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Behavior

Implantations- und Aufzeichnung von Wireless-Elektroretinogramm und visuell evozierten Potenziale in wachen Ratten

Published: June 29, 2016 doi: 10.3791/54160
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Optometry and Vision Sciences, University of Melbourne, 2Pfizer Neusentis

Summary

Wir zeigen eine chirurgische Implantation und Aufnahmeverfahren visuelle elektro Signale aus dem Auge (ERG) und Gehirn (visuell evozierte Potentiale) zu messen in der bewussten Ratten, die mehr analog zum menschlichen Zustand ist, wo Aufnahmen ohne Narkose verwechselt durchgeführt werden.

Abstract

Die Vollfeld-ERG (ERG) und visuell evozierten Potential (VEP) sind nützliche Werkzeuge, Netzhaut- und Sehbahn Integrität sowohl in Labor- und klinischen Umfeld zu bewerten. Derzeit werden präklinische ERG und VEP-Messungen mit Betäubung durchgeführt stabile Elektrodenanordnungen zu gewährleisten. Jedoch hat die Anwesenheit der Anästhesie wurde gezeigt normalen physiologischen Reaktionen zu verunreinigen. Um diese Anästhesie verwechselt zu überwinden, entwickeln wir eine neue Plattform zu testen, ERG und VEP in wachen Ratten. Die Elektroden werden chirurgisch Unter konjunktival auf das Auge implantiert, um die ERG und epidural über dem visuellen Kortex zu untersuchen den VEP zu messen. Eine Reihe von Amplitude und Empfindlichkeit / Timing-Parameter sind sowohl für die ERG und VEP bei steigender Licht Energien untersucht. Die ERG und VEP-Signale werden gezeigt für mindestens 4 Wochen nach der chirurgischen Implantation stabil und wiederholbar sein. Diese Fähigkeit, ERG und VEP-Signale ohne Anästhesie aufnehmen confounds in den vorklinischen setting sollte überlegen Übersetzung klinische Daten zur Verfügung stellen.

Introduction

Die ERG und VEP sind minimal in vivo - Tools invasive sowohl die Integrität der retinalen und der Sehbahn jeweils im Labor und Klinik zu beurteilen. Die Vollfeld ERG ergibt eine charakteristische Wellenform , die in verschiedene Komponenten aufgeteilt werden können, wobei jedes Element die verschiedene Zellklassen des retinalen Stoffwechselweg 1,2. Die klassische Vollfeld - ERG - Wellenform besteht aus einer anfänglichen negativen Steigung (a-Welle) die Photorezeptoraktivität Post Belichtung repräsentieren 2-4 gezeigt wurde , . Die a-Welle wird durch eine wesentliche positive Wellenform (b-Welle) gefolgt , die elektrische Aktivität der mittleren Netzhaut reflektiert überwiegend die ON-bipolaren Zellen 5-7. Darüber hinaus kann eine Lichtenergie variieren und Inter-Stimulus-Intervall Kegel von der Stange Antworten 8 zu isolieren.

Der Flash-VEP stellt elektrische Potentiale des visuellen Kortex und im Hirnstamm in Reaktion auf retinale Lichtstimulation9,10. Diese Wellenform kann in frühen und späten Komponenten zerlegt werden, wobei die frühe Komponente Reflexions Aktivität von Neuronen des retino-geniculo-striate Weg 11-13 und den späten Anteil darstellt kortikale Verarbeitung in verschiedenen Schichten V1 durchgeführt in Ratten 11,13. Daher gleichzeitige Messung der ERG und VEP liefert umfassende Bewertung der in der Sehbahn beteiligten Strukturen.

Derzeit, um die Elektrophysiologie in Tieren aufzunehmen, wird der Anästhesie eingesetzt, um stabile Platzierung der Elektrode zu ermöglichen. Es gab Versuche, 14-16 in wachen Ratten ERG und VEP zu messen , aber diese Studien eine verdrahtete Einrichtung eingesetzt, die mühsam sein kann und 17 durch die Beschränkung Tier Bewegung und natürliches Verhalten zu Tier Stress führen kann. Mit den jüngsten Fortschritten in der drahtlosen Technologie einschließlich der Verbesserung der Miniaturisierung und Lebensdauer der Batterie ist es nun möglich, eine Telemetrie Ansatz für ERG eine umzusetzend VEP-Aufnahme, die mit verdrahteten Aufnahmen verbunden sind Stress zu verringern und langfristige Rentabilität zu verbessern. Vollständig internalisiert stabile Implantationen von Telemetrie - Sonden haben sich für chronische Überwachung der Temperatur um erfolgreich zu sein, den Blutdruck 18, Aktivität 19 sowie Elektroenzephalographie 20. Solche Fortschritte in der Technologie wird auch mit Wiederholbarkeit und Stabilität der bewussten Aufnahmen helfen, die Plattform der Nutzen für chronische Studien zu erhöhen.

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Protocol

Ethik - Anweisung: Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem australischen Kodex für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke (2013) durchgeführt. Die Tierethik Genehmigung wurde von der Tierethikkommission der Universität Melbourne erhalten. Die Materialien werden hier für die Laborversuche nur und nicht für medizinische oder veterinärmedizinische Verwendung bestimmt.

1. Vorbereiten Elektroden

Hinweis: Ein Drei-Kanal-Sender ist für die chirurgische Implantation verwendet, die 2 ERG und 1 VEP Aufzeichnung ermöglicht gleichzeitig durchgeführt werden. Die drei aktiven und inaktiven drei Elektroden müssen in eine Ringform vor der Implantation, um das Auge zu befestigen vorgearbeitet werden. Zur Identifizierung hat der Hersteller aktive Elektroden in halb weiß, halb farbigen Kunststoff-Ummantelungen eingeschlossen, während inaktive Elektroden in vollfarbigen Scheiden bedeckt sind. Die Masseelektrode (durchsichtiger Plastikhülle) wird unverändert gelassen. Für alle aktiven und inaktiven elektrOden Verhalten Schritte 1.1, 1.2, 1.3 und 1.7.

  1. Aufdrehen Doppelstrang-Elektrode aus rostfreiem Stahl mit zwei feinen Spitzen versehenen Zange.
  2. Schneiden Sie eine der Edelstahl-Stränge (ca. 1 cm von der Spitze), einen einzigen längeren geraden Strang verlassen verbleibenden, um die Ringelektrode zu formen.
  3. Falten Sie den einzelnen Edelstahl-Strang wieder auf sich selbst und drehen, einen glatten Ring an der Spitze der Elektrode bilden.
  4. Für die ERG aktiven Elektroden Art und Weise diese Schleife ~ 0,2-0,5 mm Durchmesser durch die Basis der Schleife drehen (für den hier beschriebenen Zweck, Form zwei aktive Elektroden auf diese Weise ERG von beiden Augen zu erfassen), und die ERG inaktiv und VEP Elektroden machen die Schleife Durchmesser ~ 0,8 mm Durchmesser (in diesem Beispiel, tun dies für eine aktive VEP Elektrode und alle drei inaktive Elektroden).
  5. Haken Sie die Kreis VEP aktive Elektrode um eine Schraube aus rostfreiem Stahl (Durchmesser 0,7 mm, Länge 3 mm), so dass die Elektrode liegt an dem Schraubenkopf.
  6. Hook die 3 inaktive Elektroden (2 ERG, 1 VEP) um eine zweite Schraube aus rostfreiem Stahl (Durchmesser 0,7 mm, Länge 3 mm).
  7. Ziehen Sie die Kunststoffhülse nach vorne über den spitzen Enden der beiden Edelstahl-Strang-Reizung zu reduzieren.
  8. Sterilisieren der Telemetriesender von ca. 25 ° C für mehr als 10 Stunden in 2% Glutaraldehyd Einweichen. Dann spülen Sie den Sender mit steriler Kochsalzlösung 3 mal.

2. Sender Implantierung

  1. Tiervorbereitung
    1. Desinfizieren Sie den OP-Bereich vor dem Experiment, indem sie mit 70% Ethanol reinigen. Autoklav alle chirurgische Geräte vor dem Gebrauch und warten Anlagen in Chlorhexidin, wenn sie nicht in Gebrauch während der Operation. Decken Sie das Tier mit einem Operationstuch während der Operation eine sterile Umgebung aufrechtzuerhalten. Sicherstellen, dass alle Experimentatoren tragen chirurgische Masken, sterile Handschuhe und Kittel.
    2. Induzieren Anästhesie mit 1,5 bis 2% Isofluran, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 l / min und der Wartung des2% bei 2 L / min während des gesamten surgery - 1,5 definiert. Bestätigen ausreichende Narkosetiefe durch das Fehlen eines Pedals Reflex auf den Muskel zwischen den Zehen einklemmen.
    3. Rasur eine 40 mm x 30 mm Fläche, über dem Abdomen von oberhalb der Leiste bis zum Sternum.
    4. Rasur eine 30 mm x 20 mm Fläche, über die Stirn, posterior zu den Augen und ventral der Ohren.
    5. Desinfizieren Sie die zwei rasierten Flächen. Für die Stirnbereich mit 10% Povidon-Iod dreimal (vermeiden Sie die Verwendung von Alkohol-basierte Antiseptika für die Fläche in der Nähe des Auges, mit dem Standard der Praxis in Einklang stehen von der Association of Surgical Technologen festgelegt) zu desinfizieren. Über den Bauch desinfizieren mit 10% Povidon-Jod und 70% Ethanol.
    6. 1 Tropfen Proxymetacain auf die Hornhaut für zusätzliche Lokalanästhesie.
    7. 1 Tropfen Carboxymethylcellulose-Natrium zur Hornhaut Trocknen der Augen zu verhindern.
  2. chirurgische Implantation
    1. Machen Sie eine 10 mm Einschnittauf dem Kopf entlang der vertikalen Mittellinie zwischen den Ohren mit einem chirurgischen Skalpell.
    2. Machen Sie einen 5 mm Einschnitt auf dem Bauch durch die Hautschicht entlang der Mittellinie unterhalb des Brustbeins.
    3. Tunnel ein Durchmesser von 5 mm Kanüle subkutan aus dem Bauch Schnitt auf den Kopf Einschnitt.
    4. Führen Sie die Elektrodendrähte (3 aktiv und 3 inaktiv) des Senders durch die Kanüle aus dem Bauch in den Kopf.
    5. Lassen Sie die Referenzelektrode mit dem Sender Basis und decken die Elektrodenspitze mit aseptischer Gaze.
    6. Decken Sie die Elektrodenspitzen (3 aktiv und 3 inaktiv) mit aseptischer Gaze.
    7. Befestigen Sie den Kopf der Ratte zu einer stereotaktischen Plattform.
    8. Verlängern Sie die Stirn Einschnitt bis 30 mm in der Länge mit einer chirurgischen Schere.
    9. Expose OP-Bereich durch lose Haut mit 2 Nähten Einfahren (3-0) bei ~ 3 und 9 Uhr.
    10. Kratzen Sie die Periost über dem Schädel mit sterilisierten Gaze aus zu belichten Bregma, Lambda und Mittellinie Nähten. Bohren Sie zwei Löcher durch den Schädel an der VEP aktiv (7 mm ventral Bregma 3 mm lateral Mittellinie) und inaktiven (5 mm rostral auf der Mittellinie zu Bregma) stereotaxische Koordinaten.
    11. Bringen Sie VEP aktive und inaktive Elektroden mit vormontierten Schrauben aus Edelstahl (Durchmesser 0,7 mm, Länge 3 mm) auf den Schädel mit einem kleinen Schraubenzieher auf ~ 1 mm in der Tiefe in die vorgefertigten Löcher. Das verankert die Schraube bis auf die Knochen, ohne die zugrunde liegende Rindengewebe zu schädigen.
    12. Um die ERG aktiven Elektroden implantieren verwenden, um eine 8-0 Naht, um vorübergehend das obere Augenlid zurückzuziehen.
    13. Legen Sie eine 16 bis 21 G Kanüle subkutan hinter dem Auge bis zum überlegen Fornix conjunctivae.
    14. Entfernen Sie die Führungsnadel.
    15. Ziehen Sie die aktive Elektrode durch die verkürzte Kunststoff-Katheter von der Stirn auf das Auge. Dann entfernen Sie die Kunststoff-Katheter.
    16. Eine temporäre Naht (8-0), die durch die Elektrodenschleife eingeschraubt ist, zu verhindern, dass die elektrode aus zurück in den Tunnel zurückzieht.
    17. Machen Sie einen 0,5 mm Einschnitt auf der oberen Bindehaut um 12 Uhr, 1 mm hinter Limbus. Verwenden Sie stumpfe Dissektion die darunter liegende Lederhaut freizulegen.
    18. Implantieren eines 8-0 oder 9-0 Naht unmittelbar hinter dem Limbus bei halber scleral Dicke.
    19. Entfernen temporärer Naht von ERG aktiven Elektrode.
    20. Anchor die ERG aktive Elektrode zur Hälfte scleral Dicke Naht von 3 aufeinander folgenden Knoten binden die Spitze der Elektrode sicherzustellen, liegt in der Nähe des Limbus.
    21. Schließen Sie die Bindehautlappen mit 1 bis 2 unterbrochen Nähten (8-0 zum 9 - 0). Stellen Sie sicher, dass die Bindehaut vollständig die ERG-Elektrode zur Verbesserung des Komforts umfasst.
    22. Entfernen Sie das Augenlid Einziehen Naht.
    23. Wiederholen Sie den Vorgang für das andere Auge.
    24. Bewerben Cyanacrylat Gel über den Schädel alle rostfreie Schrauben und Elektrodendrähte zu sichern. Sicherstellen, dass die ERG aktiven Elektroden sind nicht zu eng gezogen, bevor sie en Sicherungkönnen Augenbewegungen.
    25. Schließen Sie die Kopfwunde ein nicht resorbierbares 3 unter Verwendung von - 0 Naht.
    26. Drehen Sie Nagetier Bauchbereich zu belichten. Verlängern Sie die Bauchhauteinschnitt bis 40 mm entlang der linea alba mit chirurgische Scheren.
    27. Machen Sie eine 35 mm Schnitt durch die innere Muskelwand der inneren Bauchhöhle zu belichten.
    28. Mit Hilfe von zwei Nähten (3-0) befestigen Sie den Senderkörper auf der rechten Seite inneren Bauchdecke des Tieres. Vermeiden Sie die Leber in Kontakt.
    29. Schleife die Masseelektrode und sicher in dieser Form mit einer Naht (3-0). Legen Sie es in die Bauchhöhle freischwebend.
    30. Schließen Sie das Peritoneum eine fortlaufende Naht mit (3-0).
    31. Schließen Sie den Hautschnitt mit Einzelnähten (3-0).
  3. Die postoperative Betreuung
    1. Überwachen Sie das Tier, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt Brustlage zu halten. Haus das Tier folgenden einzeln die Operation.
    2. Verwalte carprsubkutan ofen für Analgesie (5 mg / kg) einmal täglich für 4 Tage.
    3. Fügen prophylaktischen oralen Antibiotika (Enrofloxin, 5 mg / kg) an das Trinkwasser für 7 Tage nach der Operation.
    4. Tragen Sie eine entzündungshemmende Salbe auf die Haut Inzisionsstellen Reizung für die ersten 7 Tage nach der Operation zu reduzieren.

3. Führen Sie ERG und VEP Recordings in wachen Ratten

  1. Dunkle anpassen Tier für 12 Stunden vor der ERG und VEP-Aufnahmen
  2. Führen Sie alle experimentellen Manipulationen bei schwacher roter Beleuchtung (17,4 cd.m -2, λ max = 600 nm)
  3. Bewerben Lokalanästhesie (0,5% Proxymetacain) und dilating (0,5% Tropicamid) fällt auf der Hornhaut.
  4. Führen Sie das bewusste Nagetier in einem Maß, klar Verzögerer.
    Anmerkung: Die Länge dieser Kunststoffrohr kann eingestellt werden, um unterschiedliche Größe Ratten unterzubringen mit dem Gesamtdurchmesser auf 60 mm festgelegt. Das vordere Ende der Vorrichtung verjüngt Kopf mo zu minimierenserung und enthält Perforationen normale Atmung zu ermöglichen. Dieser verjüngte Front ermöglicht die Ausrichtung und Stabilisierung der Ratte den Kopf und die Augen für die Öffnung der Kugel Ganzfeld. Man beachte, dass das Nagetier zum Verzögerer akklimatisiert wurde (3 bis 5 Mal) vor der Operation.
  5. Platzieren Sie den Nager vor dem Ganzfeld Schüssel mit den Augen mit der Öffnung der Schale ausgerichtet sind.
  6. Einschalten indwelling Sender durch einen Magneten innerhalb von ~ 5 cm des Senders verläuft. Stellen Sie sicher, dass der Sender die LED-Statusanzeige durch Überprüfung auf der Empfängerbasis eingeschaltet ist.
  7. Sammeln Signale über einen Bereich von Lichtenergie ( das heißt, -5,6 bis 1,52 log cd.sm -2) , wie zuvor beschrieben 21. Kurz gesagt, durchschnittlich mehr Signale an den Dimmer Lichtpegel (~ 80 Wiederholungen) und weniger bei den helleren Lichtenergien (~ 1 Wiederholung). Allmählich verlängern von 1 bis 180 Sekunden von dimmest zum hellsten Lichtpegel der Interstimulus Intervall.
  8. Um die ERG Stange isolierenund Kegel Antworten verwenden einen Doppel Flash - Paradigma 8. Zum Beispiel initiieren zwei Blitze bei 1,52 log cd.sm -2 mit einem 500 ms Inter-Stimulus - Intervall in-between.
  9. Zur Aufzeichnung VEP Signale, durchschnittlich 20 Wiederholungen bei den helleren Lichtenergien (dh 1,52 log cd.sm -2, 5 sec Inter-Stimulus - Intervall).
  10. Zur Beurteilung der Implantatstabilität, die durch Signalvariabilität im Laufe der Zeit beurteilt wird, führen ERG und VEP Aufnahmen 7, 10, 14, 21 und 28 Tage nach der Operation.
  11. Folgende Versuchsperiode euthanize Ratten über intrakardiale Injektion von pentobarbiturate (1,5 ml / kg) nach dem Ketamin: Xylazin Anästhesie (12: 1 mg / kg).

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Representative Results

Der Photorezeptor - Antwort wird durch den Einbau eines verzögerten Gaußsche an der Vorderkante des anfänglichen absteigenden Schenkel der ERG - Antwort in den oberen 2 Leucht Energien (1,20, 1,52 log csm -2) für jedes Tier analysiert, basierend auf dem Modell von Lamb und Pugh 22, formuliert von Hood und Birch 23. Diese Formel gibt eine Amplitude und eine Empfindlichkeitsparameter, (1C bzw. 1D). Eine hyperbolische Funktion wurde auf die Lichtenergie Reaktion von bipolaren Zellen Stange für jedes Tier angebracht, die auch eine Amplitude und eine Empfindlichkeitsparameter zurückgegeben, (1E und 1F respectively). Cone bipolaren Zellenamplitude wurde als Peak - Ansprechen der Wellenform (obere Wellenform von 1A und 1B), mit impliziter Zeit als die Zeit, die Spitzenempfindlichkeit zu erreichen nahm genommen analysiert. Für weitere Informationen wenden Sie sich bitte Charng et al sehen 24.

1A und B zeigt ERG Wellenform ± SEMs (n = 8) in wachen Ratten am Tag 7 und 28 nach der Operation. Die Wellenformen erscheinen leicht am Tag 28 größer sein im Vergleich zu Tag 7, aber lineare gemischte Modell - Analyse ergab keinen signifikanten Zeiteffekt (p = 0,14-0,67) für Photorezeptor (dunkeladaptierten PIII) Amplitude (1C) und Empfindlichkeit (1D ); Stab Bipolarzelle (dunkeladaptierten PII) Amplitude (Abbildung 1E) und Empfindlichkeit (1F); Kegel Bipolarzelle (Licht angepasst PII) Amplitude (1G) und implizite Zeit (Abbildung 1H). In ähnlicher Weise SEMs VEP Wellenform (n = 8, 2A) erscheinen vergleichbar bei 7 und 28 Tage nach der Operation, mit der Amplitude (2B und 2C) und der Zeitpunkt (2D - 2F) Parameterkeine signifikanten Zeiteffekt (p = 0,20-0,93) zeigt. Diese Ergebnisse zeigen, robust ERG und VEP Signalstabilität.

Durchschnittliche Signal-Rausch (SNR, n = 8) Verhältnis der beiden ERG (3A) und VEP (3B) zurück gute Stabilität über die fünf bewusste Aufnahme - Sessions. In diesem Szenario wird ERG-Signal als die als die Amplitude der ERG P2 Antwort definiert, während Rauschen der maximale Peak Amplitude von 10 ms Pre-Stimulus-Intervall berechnet Trog. In der VEP wird P2-N1 Amplitude als das Signal als während Rauschen auch durch die Spitze bis zur Talsohle des 10 ms Pre-Stimulus-Intervall zurückgegeben wird. Es gab keinen signifikanten Zeitwirkung über den SNR sowohl ERG und VEP (p = 0,49 und 0,62 beziehungsweise).

Abbildung 1
Abbildung 1: Conscious Elektroretinogramme Exhibit Eigentic Kurven und wiederholbare Messungen (A - B). ERG Wellenformen ± SEMs (n = 8) in einem breiten Spektrum von Licht Energien am Tag 7 (A) und 28 (B) nach der Operation. (CF) Rod und Kegel ERG Parameter werden gegen die Zeit nach der Implantation aufgetragen. Rod (dunkeladaptierten PIII) photoreceptoral Amplitude (C) und Empfindlichkeit (D), Stab - Bipolar - Zelle (dunkeladaptierten PII) Amplitude (E) und Empfindlichkeit (F) und Kegel Bipolarzelle (Licht angepasst PII) Amplitude (G ) und implizite Zeit (H) alle zeigten stabile Aufnahmen über die 5 - Sessions. Alle Symbole zeigen Mittelwert (± SEM). Diese Zahl wurde von Charng et al modifiziert. 24 Abbildung 4. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figur 2
Abbildung 2: Conscious visuell evozierten Potentialen zeigen charakteristische Kurven und wiederholbare Messungen (A) VEP Wellenformen ± SEMs (n = 8) werden am Tag 7 und 28 nach der Operation aufgetragen.. (B - F) VEP Amplitude und Timing - Parameter sind über 1 Monat nach der Implantation beurteilt. P1-N1 (B) und P2-N1 (C) Amplitude sowie P1 (D), N1 (E) und P2 (F) implizite Zeitparameter Sitzungen alle stabil über die 5 Aufnahme waren. Alle Symbole zeigen Mittelwert (± SEM). Diese Zahl wurde von Charng et al modifiziert. 24 Abbildung 6. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

ontent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 3
Abbildung 3:. Das Telemetriesystem Demonstriert Stable Signal-Rausch - Verhältnis im Laufe der Zeit das Signal-zu-Rausch - Verhältnis des (A) ERG und (B) VEP wurden im Laufe der Zeit nicht signifikant verändert (n = 8). Alle Symbole zeigen Mittelwert (± SEM). Diese Zahl hat sich von Charng et al modifiziert worden ist . Abbildung 24 S1. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Aufgrund der minimal-invasive Art visueller Elektrophysiologie, ERG und VEP-Aufnahmen bei menschlichen Patienten werden unter Bedingungen durchgeführt bewußten und erfordern nur die Verwendung von topischen Anästhetika zur Elektrodenplatzierung. Im Gegensatz dazu wird visuelle Elektro in Tiermodellen üblicherweise unter Vollnarkose durchgeführt, durch die Beseitigung freiwilligen Auge und Körperbewegungen stabile Platzierung der Elektroden zu ermöglichen. Jedoch häufig verwendete allgemeine Anästhetika verändern die ERG und VEP - Antworten als 25-27 von unseren früheren Veröffentlichung 24 und anderen gezeigt. Als solche Entwicklung einer bewussten ERG und VEP-Plattform in einem Nagetiermodell bietet überlegene Darstellung von physiologischen Reaktionen in Tiermodellen, die wiederum leisten besser Übersetzbarkeit von der präklinischen bis zur klinischen Befunde können. Ein weiterer Nachteil der Anästhesie ist, dass es die Dauer eines Experiments einschränkt. die Verwendung von verlängerten Anästhesie sowie wiederholte administ SpezifischerRation von Anästhetika kann 28 Chance von Nebenwirkungen wie zum Beispiel Drogen aufzubauen und die damit verbundenen Atemwegserkrankungen erhöhen.

Diese Studie zeigte, dass das Telemetriesystem in der bewussten Ratten robust ERG und VEP Signalstabilität für mindestens 28 Tage nach der Operation zurück. Unsere Gruppe ist die erste bewusste drahtlose ERG und VEP - Antworten gleichzeitig 24 und das Manuskript zur Durchführung Details der chirurgischen und Aufzeichnungsverfahren beteiligt. Vergleich zu anderen chirurgischen Verfahren durchgeführt mit verdrahteten bewussten ERG und VEP - Aufnahmen zeigen eine überlegene Stabilität in der ERG und gleichwertige Wiederholbarkeit in VEP Aufnahmen über einen Zeitraum von 1 Monat 15.

Die chirurgischen Techniken und anschließende bewusste Aufnahmen haben das Potenzial, zu verschiedenen Tiermodellen angewendet werden. Die Plattform hat einen potentiellen Nutzen in mehreren Anwendungen , bei denen es vorteilhaft ist , verwechselt mit der Anästhesie 29, zu vermeiden. Diese inklude Drug Discovery, eine verbesserte Übersetzung Studien am Menschen und chronische oder Längs Experimente.

Mögliche Änderungen an der Technik umfassen die Anzahl der Biopotential Kanäle implantiert zu verändern und gleichzeitig aufgezeichnet. Dies kann von 1 bis 4 Biopotential führt variieren und somit visuell evozierten Elektro von zwischen 1 Auge auf 2 Augen und 2 Inden messen konnte. Beachten Sie, dass die Änderung in der Anzahl von Kanälen Biopotentialen auch Modifikation der Bandbreite führt aufgezeichnet, die Auswirkungen auf die hochfrequente elektrophysiologischen Signalen haben. Zum Beispiel der 3-Kanal-Biopotential-Sender in dieser Studie (F50-EEE) wurde verwendet, um zu zeigen, ausgewählt, dass es möglich ist, gleichzeitig visuell evozierten Antworten von der Netzhaut und der Sehrinde einer bewußten Ratten aufzuzeichnen. Allerdings haben diese 3-Kanal-Sender eine Bandbreite von 1 bis 100 Hz, die getreu ERG a- und b-Wellen aufzeichnen kann aber oszillierenden Potentiale verändern aufgrund their höhere Frequenz 24. Im Gegensatz dazu war , wenn sie auf die Untersuchung von Interesse oszillierenden Potentiale aufzuzeichnen dann einen Sender mit geringer Aufzeichnungskanäle (dh breiteren Bandbreite) verwendet werden könnten. Es ist auch möglich, dass die Lichtreiz verändert werden, beispielsweise statt Vollfeld-ERG und VEP, visuelle Physiologie in Reaktion von leitenden Reize zu flackern können ebenfalls verwendet werden.

Eine wichtige Einschränkung dieser Technik auf andere Tiermodelle bei der Übersetzung ist die Größe des Auges des Tieres. Man sollte kein Problem haben, die Augen Elektroden Tiere größer als Ratten implantiert. Allerdings wäre es eine Herausforderung sein, die ERG-Elektrode auf eine Maus Auge implantiert werden aufgrund der geringeren Arbeitsbereich. Die kortikale Implantation, andererseits sollte relativ einfach sein, in den meisten Labortieren durchzuführen.

Es gibt mehrere Aspekte der Operation, die genau beobachtet werden müssen, um erfolgreich zu gewährleisten implantation. Es ist zwingend notwendig, dass die ERG Elektrodenring durch Reizung in einen glatten Ring gebildet wird, die von irgendwelchen Ecken und Kanten auf der Schleife induziert werden können. Die Implantation von ERG aktiven Elektroden durch zwei gleichzeitige Experimentatoren erleichtert wird, eine um das Auge zu stabilisieren, während die andere die Elektrode an der Sklera befestigt. Besondere Sorgfalt angewendet werden, um die scleral Naht (2.2.19), um sicherzustellen, ist nur die halbe Dicke, als eine volle Dicke scleral Naht des Augapfels pannen wird und glasig Leckage verursachen. Die Implantation von Elektroden auf dem Schädel (VEP aktiv und ERG / VEP inaktive Elektroden) ist technisch weniger anspruchsvoll als die der ERG-Elektroden. Dennoch ist es wichtig, dass, wenn die Elektroden an dem Schädel verankert sind, werden die Drähte natürlich unnötige Spannung zu reduzieren, um uncurl erlaubt. Akklimatisierung an die Aufnahme Verzögerer vor der chirurgischen Implantation ist von Vorteil, übermäßige Bewegungen während des ERG und VEP Aufnahmen zu reduzieren.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioamplifier ADInstruments ML 135 Amplifies ERG and VEP signals
Carboxymethylcellulose sodium 1.0% Allergan CAS 0009000-11-7 Maintain corneal hydration during surgery
Carprofen 0.5% Pfizer Animal Health Group CAS 53716-49-7 Post-surgery analgesia, given with injectable saline for fluid replenishment
Chlorhexadine 0.5% Orion Laboratories 27411, 80085 Disinfection of surgical instrument
Cyanoacrylate gel activator RS components 473-439 Quickly dries cyanoacrylate gel
Cyanocrylate gel  RS components 473-423 Fix stainless screws to skull
Dental burr Storz Instruments, Bausch and Lomb E0824A Miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws
Drill Bosch Dremel 300 series Automatic drill for trepanning
Enrofloxin Troy Laboratories Prophylactic antibiotic post surgey
Ganzfeld integrating sphere Photometric Solutions International Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size
Gauze swabs Multigate Medical Products Pty Ltd 57-100B Dries surgical incision and exposed skull surface during surgery
Isoflurane 99.9% Abbott Australasia Pty Ltd CAS 26675-46-7 Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery
Kenacomb ointment Aspen Pharma Pty Ltd To reduce skin irritation and itching after surgery
Luxeon LEDs Phillips Lighting Co. For light stimulation, twenty 5 W and one 1 W LEDs, controlled by Scope software
Needle (macrosurgery) World Precision Instruments 501959 for suturing abdominal and head surgery, used with 3 - 0 suture, eye needle, cutting edge 5/16 circle Size 1, 15 mm
Needle holder (macrosurgery) World Precision Instruments 500224 To hold needle during abdominal and head surgery
Needle holder (microsurgery) World Precision Instruments 555419NT To hold needle during ocular surgery
Optiva catheter Smiths Medical International LTD 16 or 21 G Guide corneal active electrodes from skull to conjunctiva
Povidone iodine 10% Sanofi-Aventis CAS 25655-41-8 Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml
Powerlab data acquisition system ADInstruments ML 785 Acquire signal from telemetry transmitter, paired to telemetry data converter
Proxymetacaine 0.5% Alcon Laboratories  CAS 5875-06-9 Topical ocular analgesia
Restrainer cutom made Front of the restrainer is tapered to minimize head movement, length can be adjusted to accommodate different rat length, overall diameter is 60 mm. 
Scapel blade R.G. Medical Supplies SNSM0206 For surgical incision
Scissors (macrosurgery) World Precision Instruments 501225 for cutting tissue on the abodmen and forhead
Scissors (microsurgery) World Precision Instruments 501232 To dissect the conjunctiva for electrode attachment
Scope Software ADInstruments version 3.7.6 Simultaneously triggers the stimulus via the ADI Powerlab system and collects data
Shaver Oster Golden A5 Shave fur from surgical areas
Stainless streel screws  MicroFasteners L001.003CS304 0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length 
Stereotaxic frame David Kopf Model 900 A small animal stereotaxic instrument for locating the implantation landmarks on the skull
Surgical drape Vital Medical Supplies GM29-612EE Ensure sterile enviornment during surgery
Suture (macrosurgery) Ninbo medical needles 3-0 for suturing abdominal and head surgery, sterile silk braided, 60 cm
Suture needle (microsurgery) Ninbo medical needles 8-0 or 9-0 for ocular surgery including, suturing electrode to sclera and closing conjunctival wound, nylon suture, 3/8 circle 1 × 5, 30 cm
Telemetry data converter  DataSciences International R08 allows telemetry signal to interface with data collection software
Telemetry Data Exchange Matrix DataSciences International Gathers data from transmitters, pair with receiver
Telemetry data receiver DataSciences International RPC-1 Receives telemetry data from transmitter
Telemetry transmitter DataSciences International F50-EEE 3 channel telemetry transmitter
Tropicamide 0.5% Alcon Laboratories  Iris dilation
Tweezers (macrosurgery) World Precision Instruments 500092 Manipulate tissues during abdominal and head surgery
Tweezers (microsurgery) World Precision Instruments 500342 Manipulate tissues during ocular surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frishman, L. J. Origins of the Electroretinogram. , The MIT Press. (2006).
  2. Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J Physiol. 77, 207-239 (1933).
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Verhalten Ausgabe 112 Electrophysiology Telemetrie ERG visuell evozierten Potential bewusst Anästhesie
Implantations- und Aufzeichnung von Wireless-Elektroretinogramm und visuell evozierten Potenziale in wachen Ratten
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Charng, J., He, Z., Bui, B.,… More

Charng, J., He, Z., Bui, B., Vingrys, A., Ivarsson, M., Fish, R., Gurrell, R., Nguyen, C. Implantation and Recording of Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potential in Conscious Rats. J. Vis. Exp. (112), e54160, doi:10.3791/54160 (2016).

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