Summary
Vi visar en lagringsbara, transportabla lipiddubbelskikt bildningen. En lipidbiskiktmembranet kan bildas inom en timme med över 80% framgång när en frusen membran prekursor bringas till omgivande temperatur. Detta system kommer att minska arbetskrävande processer och expertis i samband med jonkanaler.
Abstract
En konstgjord lipidbiskikt, eller svart lipidmembran (BLM), är ett kraftfullt verktyg för att studera jonkanaler och proteininteraktioner, liksom för biosensorapplikationer. konventionella BLM bildningstekniker har dock flera nackdelar och de kräver ofta särskild sakkunskap och mödosamma processer. I synnerhet konventionella BLMs lider låga bildnings framgångsrika och inkonsekvent membranbildning tid. Här visar vi en lagringsbar och trans BLM bildningen med kontrollerad gallring Tiden och förbättrad BLM bildningshastigheten genom att ersätta konventionellt använda filmer (polytetrafluoretylen, polyoximetylen, polystyren) till polydimetylsiloxan (PDMS). I detta experiment är en porös strukturerad polymer såsom PDMS tunn film används. Dessutom, i motsats till konventionellt använda lösningsmedel med låg viskositet, användningen av skvalen tillåts en kontrollerad gallring Tiden via långsam lösningsmedel absorption av PDMS, förlänger membran livstid. i adsättning, genom att använda en blandning av skvalen och hexadekan, fryspunkten för lipidlösningen ökades (~ 16 ° C), dessutom har membran prekursorer fram som kan obestämd tid lagras och lätt transporteras. Dessa membran prekursorer har minskat BLM bildning tid av <1 timme och uppnått en BLM bildningshastigheten av ~ 80%. Dessutom jonkanal experiment med gramicidin A visade genomförbarheten av membransystem.
Introduction
Artificiell lipidbiskiktmembranet eller svart lipidmembran (BLM), är ett viktigt verktyg för att belysa mekanismerna för cellmembran och jonkanaler, liksom för att förstå samspelet mellan jonkanaler och joner / molekyler. 1-7 Även om patch-clamp-metoden anses ofta vara den gyllene standarden för cellmembranstudier, är det arbetskrävande och kräver mycket skickliga operatörer för jonkanal mätningar. 8 även artificiellt rekonstituerade lipidbiskiktmembraner har dykt upp som alternativa verktyg för jonkanal studier, 9,10 de också förknippade med mödosam processer samt specifik kunskap. Dessutom membran är känsliga för mekaniska störningar. Därför har lipiddubbelskikt teknik som introduceras hittills begränsade praktiska tillämpningar. 11
För att förbättra robustheten och livslängden av lipidbiskiktmembraner, Costello et al. 12, och Ide och Yanagida
Utvecklingen av ett lipiddubbelskikt plattform har främst kretsat kring ökad robusthet och livslängd BLMs. Även livslängden för BLMs har varit substantially förbättras senare tid har sina ansökningar varit begränsad på grund av bristande flyttbarhet och lagringsbarhet. För att övervinna dessa problem, Jeon et al. Skapade en lagringsbar membransystem och introducerade ett membran föregångare (MP). 16 För att konstruera en MP, de förberett en blandning av n- dekan och hexadekan innehållande 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn-glycero-3-fosfatidylkolin) för att reglera fryspunkten för lipidlösningen sådana att det skulle frysa vid ~ 14 ° C (under rumstemperatur, ovanför typisk kylskåpstemperatur). I detta experiment var kombi spridda över en liten öppning på en polytetrafluoretylen (PTFE) -film och därefter fryses i ett kylskåp vid 4 ° C. När MP fördes till rumstemperatur tinade MP och ett lipiddubbelskikt var automatiskt bildas, vilket eliminerar expertis vanligtvis förknippas med membranbildning. Men var så låg som ~ 27%, och membran formatio framgång på BLM göras från MPn tid var inkonsekvent (30 min till 24 h), vilket begränsar dess praktiska tillämpningar.
I denna studie, är en polydimetylsiloxan (PDMS) tunn film som används i stället för en konventionell hydrofoba tunna filmer (PTFE, polyoximetylen, polystyren) och (a) Kontroll tillverkningstiden och (b) öka andelen framgångsrika BLM formation som tidigare rapporterats av Ryu et al. 17 Häri ades membranbildning underlättas genom extraktion av lösningsmedel på grund av den porösa naturen hos PDMS, och den tid som krävs för membranbildning lyckades kontrollerad i denna studie. I detta system, som lipidlösningen absorberades i PDMS tunn film, var ett konsekvent membranbildning tid uppnåtts. Dessutom har membran livslängd förlängs på grund av långsam absorption av lösningsmedel i PDMS tunnfilms, ett resultat av tillsatsen av skvalen till lipidlösningen. Vi har utfört optiska och elektriska mätningar för att kontrollera att membran bildade med denna teknik är lämplig för ipå kanaler studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lösning Beredning
- Framställning av buffertlösning:
- Att formulera buffertlösning, lös upp en M KCl (Kaliumklorid), 10 mM Tris-HCl (Tris-hydroklorid), och 1 mM EDTA (etylendiamintetraättiksyra) i destillerat vatten och justera pH till 8,0.
- Filtrera lösningen med en 0,20 pm filter. För att sterilisera, autoklavera lösningen vid 121 ° C under 15 min.
- Beredning av lipid lösning för pre-målning:
- Att formulera lipidlösningen för pre-målning, lösa 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl--sn-glycero-3-fosfatidylkolin) lipid (w: v) i en blandning av 2: 8 n dekan och hexadekan (v: v). Omrördes över natten med användning av en rotator.
- Framställning av lipid lösning för membranbildning:
- Att formulera lipidlösningen för membranbildning, lös upp 0,1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- sn-glycero-3-fosfatidylkolin) lipid (vikt: vol) i en blandning av 2: 8 squalene och hexadekan (volym: volym). Omrördes över natten med användning av en rotator.
2. Bildandet av en PDMS Thin Film
- Blanda PDMS och härdare i en 9: 1 (vikt / vikt) förhållande i en blandningsform för att bilda den PDMS prepolymer. Tillsätt 5 g av PDMS-prepolymeren till en petriskål för att bilda de PDMS tunn film (tjocklek 200-250 ^ m). Sprida PDMS pre-polymer med användning av en spinnbeläggningsanordning vid 800 varv per minut under 10 sek för att bilda en tunn film.
- Placera petriskålen i en vakuumtorkapparat vid ett tryck av 100 mTorr under 2 h för att avlägsna luftbubblor. Att polymerisera prepolymeren tunn film, baka i en ugn under 5 h vid 70 ° C.
- För att göra en kvadrat PDMS tunnfilms, klippa polymeriserade PDMS tunn film i 2 x 2 cm 2 rutor. Använd en 500 um mikro punch för att göra en öppning i mitten av PDMS tunnfilms. Pre-paint öppningar med 3% DPhPC lipidlösningen blandas i 2: 8 n- dekan och hexadekan.
3. Chamber Fabrication och Assembly
- Att tillverka BLM kammaren, design två symmetriska block i kammaren med hjälp av 3D-ritprogram med yttermått av 4 cm x 1,5 cm x 1 cm och inre brunnar dimensioner av 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm 17.
- Craft kammaren med hjälp av en PTFE-block med en CNC-maskin och följa tillverkarens instruktioner.
4. kammarenheten
- För att sätta samman kammaren, placera förmålad-PDMS tunn film mellan de två PTFE-block, så att öppningen på PDMS tunna filmen i linje med hålet i kammaren.
- Täta de yttre kanterna av kammaren med hjälp av ett täckglas med fett (underlätta optisk observation). Immobilisera monterade kammaren med hjälp av bultar och muttrar.
OBS: Se till att kammaren är väl tillsluten, så att det inte finns något vätskeläckage.
5. Bildande av Membrane prekursor med Expedited Själv montering Formation (tillåtna fel)
- Med hjälp av en pipett, sätta 0,5il av 0,1% DPhPC lipid blandas i 2: 8 n -dekan: hexadekan på öppningen i PDMS tunn film hopsatt med kammaren.
- Före användning, förvaras den kammare, i en frys eller ett kylskåp under 10 ° C.
6. Membranbildning och verifiering
- För att bilda en BLM med största tillåtna fel, dra tillbaka kammaren från kylskåpet och suspendera 2 ml av buffertlösning i varje sida av kammaren. Ställ kammaren åt sidan för <10 min tills den frusna membrangångaren tinar.
- Placera kammaren på en mikromanipulator för att exakt kontrollera höjd i förhållande till ljuskällan och mikroskopet. Lys upp en sida av kammaren som en ljuskälla med hjälp av en halogen fiberoptisk belysnings att lysa öppning PDMS tunnfilms för optisk observation av BLM bildningsprocessen.
- På den andra sidan, placera en digital mikroskop vertikalt i förhållande till ljuskällan för att observera BLM bildning (tora med 200X).
- För att bekräfta BLM bildning, observera öppningens mitt där färgen blir ljusare än ringen.
7. Elektrisk Recording
- För elektrisk mätning, förbereda Ag / Cl elektroder med hjälp av en 208 um tjock silvertråd och blekmedel i natriumhypoklorit för> 1 min. Placera Ag / Cl elektroder i varje sida av kammaren tillräckligt djup för att doppas i buffertlösningen.
- Anslut elektroderna till mikro förstärkaren. Med hjälp av elektro programvara, tillämpa en ± 10 mV triangulär vågform över membranet för att få en fyrkantvåg. Ställ spänningssättning genom att klicka på pilarna anges på V_clamp (mV).
- Registrera de elektriska egenskaperna hos membranet genom att klicka på inspelningsknappen (röd prick ikon). Fortsätt med inspelningen tills en enhetlig fyrkantsvåg observeras. Avsluta inspelningen genom att klicka på den svarta fyrkantig ikon.
8. jonkanalen Incorporation
INTEE: Gramicidin A (GA) inkorporering sker spontant vid bildandet av BLM, som gA tillsätts direkt till lipidlösningen.
- Att observera GA-kanalaktiviteter, tillämpa 100 mV över membranet vid en provhastighet av 5 kHz för att mäta hållpotential av membranet. Ställ spänningssättning genom att klicka på pilarna anges på V_clamp (mV).
- Registrera de elektriska egenskaperna hos gA införlivande genom att klicka på inspelningsknappen (röd prick ikon). Fortsätt inspelningen tills nuvarande hopp observeras. Avsluta inspelningen genom att klicka på den svarta fyrkantig ikon.
- Efter elektrisk datainsamling, filtrera data med en låg-pass Bessel-filter vid 100 Hz med hjälp av en elektro programvara.
- Beakta nuvarande hopp i den filtrerade hålla potentiella uppgifter (varje nuvarande hopp, ~ 0,15 nS representerar dimerisering av en gA jonkanalen) att kontrollera gA inkorporering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optimering av tillåtna fel Lösningssammansättning
Olika kompositioner av lipider och lösningsmedel testades för att framgångsrikt rekonstituera lipidbiskiktmembraner från tillåtna fel. MP-system med en blandning av n- dekan och hexadekan innehållande 3% DPhPC 14 uppvisade en låg framgång för membranbildning (~ 27%). Dessutom, såsom PDMS filmen extraherades kontinuerligt lipidlösning, var det nödvändigt att optimera sammansättningen lösningsmedel för att upprätthålla en intakt lipidbiskiktmembranet. Därför skvalen, som har en viskositet av 12 cP vid 20 ° C 18 användes i stället för n-dekan, som har en viskositet av 0,92 cP vid 20 ° C. 19 När skvalen användes, både stabilitet och livslängd ökat på grund av en minskade absorptionshastigheten lösningsmedel av PDMS. Tabell 1 jämför gallring tiden~~POS=HEADCOMP, livstid, och framgång på membran med olika sammansättningar lösningsmedel.
När n- dekan användes, membranbildning var inkonsekvent och membran ofta spruckit inom en kort tidsperiod, på grund av snabb absorption av lösningsmedel genom PDMS tunna filmer. Å andra sidan, när skvalen användes, var tid till membranbrott försenad. Dessutom blev membranbildning tid mer konsekvent, framgång på membranbildning förbättras och livslängden hos membranen ökat.
Membranbildning från Membrane prekursor (MP)
En MP är frusen form av lipid-lösning som blir lätt användbar vid tining vid rumstemperatur. Lipidlösningen innehållande en blandning av n- dekan och hexadekan i en liten öppning i en PDMS tunn film fryser under 16 ° C, och är på obestämd tid lagringsbar och transporterbar i fryst form. Figur 1 illustrerar monteringen av en PDMS tunn film med en PTFE chamber att producera en MP. Före användning, var PTFE kammaren tillbaka från kylskåpet för membranbildning. Häri var PDMS tunn film innehållande den frysta lipidlösningen placerades mellan två halvor av PTFE kammare. När buffertlösning tillsattes därefter till båda sidor av kammaren vid rumstemperatur, lipidbiskiktmembranet bildas spontant vid upptining av den frysta membran prekursorn (MP).
Vid tining, tunnas lipidlösningen ut såsom beskrivs i figur 2. När den frysta membran prekursor tinades ades två monoskikt längs gränsytorna mellan buffert och lipidlösningen bringas kontakt. In 20 Efter bildning av membranet, ga monomerer som var förblandad i lipidlösningen visade kanalverksamhet.
Optisk Observation av Membranes
För att optiskt verifiera membranbildning, vibegagnade transmitterat ljus för att visualisera membranet. Vid membranbildning, föreföll membranet ljusare än omgivningen på grund av förtunning-ut-processen, och centrum av öppningen (platsen för membranbildning) var ljusare än ringen. Figur 3 visar membranbildning observer via digital mikroskopi. Membranet framgångsrikt tunnas ut vid tining.
Elektrisk Mätning av ett lipiddubbelskikt
Vi mätte elektriska strömmar genom membranet med hjälp av en förstärkare för att beräkna membrantjocklek. Ag / AgCl-elektroder nedsänktes in i båda kamrarna för elektrisk mätning. När 10 mV topp-till-topp-triangelvåg applicerades över membranet, var triangelvågen omvandlas till en fyrkantvåg av ström på grund av den karakteristiska för lipidbiskiktmembranet (som fungerar som en kondensator). 21 Som ett resultat, var vi kunna uppskatta membranets tjocklekmed användning av följande ekvation:
där I (t) representerar elektrisk ström och C representerar kapacitansen över membranet. V representerar den applicerade topp-till-topp-spänning (20 mV för 0,0625 sek). Häri, kan C uttryckas med, permittiviteten ledigt utrymme (8,85 x 10 12 F / m 2),, den dielektriska konstanten av lipider (2,1), 22 A, området av membranet (~ 1,29 x 10 -7 m 2), och d är tjockleken av dubbelskiktet. Med de optiska data i figur 3 och elektriska data, beräknade vi tjockleken av membranet för att vara ~ 4 nm. Dessutom den rekonstituerade membranet uppfyllde en giga-ohm-nivå tätning (> 1 GΩ), som typiskt krävs för jonkanal studier. 23
Jonkanalen verksamhet Gramicidin A (GA)
För att kontrollera möjligheten att jonkanal screening med lipiddubbelskiktet bildas av MP, införlivade vi Ga, en av de mest använda jonkanaler för att verifiera membranbildning. Gramicidin A införlivar membranet som två skilda underenheter som senare dimeriserar. 7 jonkanaler form vid dimerisering av gA, och joner tränger igenom gA jonkanalen. Figur 4 illustrerar införlivandet och dimerisering av GA. Vid gA dimerisering, Ga kanal ledningsförmåga nivåerna 28 PS, som överensstämmer med resultaten från tidigare rapporter. 3
| lipidkoncentration | Lösningsmedel | Gallring Tiden (min) | Livslängd (min) | Framgång |
| 0,1% | 2: 8 skvalen: hexadekan | 50,6 (± 30,9) | 52,4 (± 30,9) | 77,8% |
| 0,1% | 2: 8 n -dekan: hexadekan | 13,2 (± 12,3) | 10,8 (± 7,8) | 75,2% |
| 1% | 2: 8 n -dekan: hexadekan | 15,8 (± 8,8) | 26,2 (± 25,3) | 69,3% |
| 1% | 2: 8 n -dekan: hexadekan | 13,8 (± 13,3) | 23,6 (± 30,1) | 55,6% |
| 1% | 2: 8 n -dekan: hexadekan | 13,6 (± 10,3) | 8,9 (± 3,0) | 50,0% |
Tabell 1. Optimering av tillåtna fel lösningskomposition. 0,5 pl lipidlösningen avbröts på en PDMS tunnfilms öppning (500 um diameter). Här varierade vi lipidkoncentration, sammansättning av lösningsmedel, och pre-målning. 17. Anpassad med tillstånd från Ryu, H. et al. 7
Figur 1. Schematisk diagram över membranbildning system. Den yttre dimensionen av varje halvorna av kammaren var 4 cm x 1.5 cm x 1 cm, och storleken av det inre brunn var 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm. Den inre brunnen var tillräckligt stor för att rymma 2 ml av buffertlösning. På varje PTFE blocket fanns hål att ha PDMS tunnfilms kontakt med buffertlösning. Den andra sidan förseglades med ett täckglas för optisk observation av BLM. Slutligen var kammarblocken förstärkt med bultar och muttrar för att undvika vätskeläckage.4258 / 54258fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Skiss av Frozen Membran prekursor med Expedited Självenheten (tillåtna fel) bildning. Lipid lösning på PDMS tunnfilms öppning kan frysas på obestämd tid. När den frusna membrangångaren fördes till rumstemperatur för att tina, är lipiddubbelskikt bildningen underlättas på grund av extraktion av hydrofoba lösningsmedel i PDMS tunnfilms. Som GA monomerer direkt läggas i lipidlösningen, Ga jonkanaler som bildas omedelbart efter membranbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
= "/ Filer / ftp_upload / 54.258 / 54258fig3.jpg" />
Figur 3. Mikroskopisk schema för uttunning-ut-processen. Vid upptining av tillåtna fel och efterföljande absorption av hydrofoba lösningsmedel, var gallring-ut-processen underlättas om öppningen av PDMS tunnfilms, och membranet bildades inom två minuter efter upptining. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Elektriska mätningar vid inkorporering av gramicidin A. Aktuella hoppar på införlivande och dimerisering av gA i membranet visas. En amplitud på ~ 28 pS sågs vid dimerisering av GA-monomerer (100 mV hållpotential; 100 Hz Bessel lågpassfilter).rFå = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534----------K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
References
- Hanke, W., Schulue, W. Planar lipid bilayers: methods and applications. , Academic Press. (2012).
- Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
- Bayley, H., Cremer, P. S. Stochastic sensors inspired by biology. Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).
- Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
- Majd, S., et al. Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).
- Kim, Y. R., et al. Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications. Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).
- Ryu, H., et al. Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes. Sci Rep. 5, (2015).
- Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J.
- Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
- Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).
- Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents. Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).
- Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. A robust gel-bilayer channel biosensor. Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).
- Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).
- Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J.
- Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel. Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).
- Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).
- Ryu, H., et al. Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements. Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).
- Yaws, C. Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals. , MC GRAW HILL HANDBOOKS. (1999).
- Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs. , Merck & Co. (1976).
- Miller, C. Ion Channel Reconstitution. , Springer Science & Business Media. (1986).
- Miller, C. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).
- Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).
- Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording. Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).
