Abstract
Einzel klonalen Verfolgung und Analyse auf Vollherzhöhe kann Herzvorläuferzellverhalten und Differenzierung während der Herzentwicklung, bestimmen und für die Untersuchung der zellulären und molekularen Grundlagen von normalen und abnormalen Herzmorphogenese ermöglichen. Neue aufkommende Technologien der retrospektiven Einzel klonalen Analysen machen die Untersuchung von Herz-Morphogenese auf Einzelzellauflösung möglich. Allerdings Gewebe Opazität und Lichtstreuung des Herzens als Abbildungstiefe von ganzem Herzen Bildgebung auf Einzelzellauflösung hinder erhöht. Um diese Hindernisse zu überwinden, eine ganze Embryo Clearing-System, das das Herz hoch transparent für beide Beleuchtung und Detektion machen können, müssen entwickelt werden. Zum Glück, in den letzten Jahren, viele Methoden für die ganze Organismus Clearingsystemen wie CLARITY, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, kubisch, DBE, BABB und PACT berichtet. Dieses Labor ist daran interessiert, die zellulären und molekularen Mechanismen der KarteIAC Morphogenese. Vor kurzem haben wir einzelne Zelllinie über die ERT2 ROSA26-Cre Tracing; ROSA26-Confetti System zu dünn Label - Zellen während der Herzentwicklung. Wir passten mehrere ganze Embryo-Clearing - Methoden einschließlich Sca le und CUBIC (klar, ungehinderte Bildgebung des Gehirns Cocktails und Computeranalyse) mit whole mount Färbung Bild einzelne Klone im Inneren des Herzens , den Embryo in Kombination zu löschen. Das Herz wurde erfolgreich auf Einzelzell Auflösung abgebildet. Wir fanden , dass Sca le die embryonale Herz beseitigen können, aber die postnatale Herz nicht effektiv beseitigen können, während CUBIC die postnatale Herz beseitigen können, sondern schädigt die embryonale Herz durch das Gewebe auflöst. Die hier beschriebenen Methoden wird die Untersuchung der Genfunktion in einem einzigen Klon Auflösung während kardialen Morphogenese ermöglichen, was seinerseits die zellulären und molekularen Basis angeborener Herzfehler aufdecken kann.
Introduction
Cardiac Morphogenese ist eine sequenzielle Ereignis, das die räumlich - zeitliche Organisation von vier verschiedenen Arten von Herzvorläuferzellen in verschiedene Sektoren des Herzens erforderlich ist , und erfordert auch mehrere Genregulationsnetzwerken diesen Prozess zu dirigieren die funktionelle Herz 1,2 zu bilden. Cardiac Spezifikation, Differenzierung, Strukturierung und Kammer Reifung werden von kardiogenem Transkriptionsfaktoren 3 geregelt. Genetische Mutation oder posttranskriptionalen Aberration dieser Faktoren in Herzvorläuferzellen in entweder embryonale Letalität oder angeborene Herzfehler (CHD) 4 führen könnte. Die Studie von Herzmorphogenese erfordert ein Verständnis der inhärenten strukturellen Details in drei Dimensionen (3D) und einzelne Linie Herzvorläufer markierte Zelle während der Herzentwicklung verfolgt wird das Verständnis der Herzmorphogenese fördern. Eine Reihe von hochauflösenden Abschnitt basierte Tomographieverfahren wurden in th entwickelte vergangenen Jahrzehnten zu Bild Organstruktur 5,6; Allerdings erfordern diese Verfahren teuer, spezialisierte Instrumente, umfangreiche Arbeit, und es fehlt ihnen detaillierte strukturelle Organisation auf Einzelzellauflösung in das endgültige Volumen rekonstruiert Bild 7,8.
3D volumetrischen Bildgebung auf Einzelzellebene stellt ein Mittel Vorläuferzelldifferenzierung und Zellverhalten in vivo 7 zu untersuchen. Allerdings bleibt Gewebe Lichtstreuung das primäre Hindernis Zellen und Strukturen in 3D tief im Inneren des intakten Herzens Bildgebung. Lipide sind eine Hauptquelle der Lichtstreuung, und die Entfernung von Lipiden und / oder Einstellung des Brechungsindexunterschied zwischen Lipiden und deren Umgebung sind mögliche Ansätze zur Erhöhung der Gewebetransparenz 8. In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Gewebeclearingverfahren entwickelt, das Gewebe Opazität und Lichtstreuung zu reduzieren, wie BABB (Benzylalkohol und Benzyl benzoate-Gemisch) und DBE (Tetrahydrofuran und Dibenzylether); aber bei diesen Verfahren, Fluoreszenzlöschung bleibt ein Problem 8-10. Die Lösungsmittelbasis hydrophile Methoden, wie SeeDB (Fructose / Thioglycerin) und 3DISCO (Dichlormethan / Dibenzylether), erhalten Fluoreszenzsignale, aber machen nicht das ganze Organ transparent 7,8,11. Im Vergleich dazu macht die CLARITY Gewebe-Clearing - Verfahren der Organ transparent, aber es erfordert eine spezialisierte Elektrophoreseautomat Lipide zu entfernen 8,12, ebenso wie PACT (passive Klarheit Technik), die auch Hydrogel 7,13 Einbettung erfordert. Detaillierte Informationen zu allen verfügbaren Gewebe-Clearing - Verfahren, siehe Tabelle 1 in Richardson und Lichtman et al. 7.
Im Jahr 2011 Hama et al. Serendipitously eine hydrophile Mischung 'Sca le' (Harnstoff, Glycerin und Triton X-100 - Gemisch) entdeckt , das macht das Gehirn der Maus und Embryo durchsichent während vollständig fluoreszierende Signale von markierten Klone 14 zu erhalten. Dies ermöglicht die Abbildung des intakten Gehirn in einer Tiefe von mehreren Millimetern und großen Rekonstruktion von neuronalen Populationen und Vorsprünge an einer subzellulären Auflösung. Susaki et al. weiter verbessert Sca le von Aminoalkoholen und entwickelte die "CUBIC" ( eine klare, uneingeschränkte Bildgebung des Gehirns Cocktails und Computeranalyse) Gewebe Clearing - Verfahren, das Phospholipid Solubilisierung reduziert Klärzeit erhöht und erlaubt für den Mehrfarbenfluoreszenzabbildung 8 hinzugefügt wird . In der vorliegenden Studie, die Vorteile der le Sca nehmen und CUBIC Gewebe Clearing Techniken und hochauflösende 3D - optischen Schneidens, einzelne Klone innerhalb des Herzens während der Herzentwicklung wurden unter Verwendung von Rosa26Cre ERT2 verfolgt 15, R26R-Confetti 16, & alpha; MHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, NFATc1-Cre 19 und Rosa26-mTmG (mTmG) 20 Mauslinien. Die Kombination der whole mount - Färbung (WMS) Verfahren weiterhin für die Färbung von anderen Proteinen in markierten Klone und für die Untersuchung ihres Verhaltens in einem 3D - Volumen Kontext erlaubt zuvor 21,22 mit Gewebe Verrechnungsverfahren entwickelt. Die Kombination von Gewebe Clearing- und WMS ermöglicht ein besseres Verständnis der Rolle der verschiedenen Gene und Proteine während der Herzentwicklung und der Ätiologie von angeborenen Herzfehlern. Dieses Protokoll kann angewandt werden, um andere Vorläuferzelldifferenzierung, Zellverhalten zu untersuchen und organ Morphogenese Ereignisse während der Entwicklung.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) at Albany Medical College und ausgeführt zugelassen nach dem NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
1. Lösung Vorbereitungen
HINWEIS: Die Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, & alpha; MHC-Cre 17 und Rosa26-mTmG (mTmG) 20 Mauslinien wurden im Handel erworben cTnT-Cre 18 ein Geschenk von Dr. Jiao an der Universität von Alabama war NFATc1-Cre.. war 19 am Albert Einstein College of Medicine ein Geschenk von Dr. Bin Zhou. Mäuse wurden für mindestens 60 Sekunden durch Kohlendioxidinhalation in einer geschlossenen Kammer euthanasiert gefolgt durch physikalische Mittel Todes Überprüfung durch bilaterale Thorakotomie, Enthauptung oder zervikale Dislokation.
- Bereiten Sie Tamoxifen. Man löst 10 mg Tamoxifen in 10 ml Sonnenblumenkerne oil. Sobald es vollständig gelöst ist, aliquotieren und bei -20 ° C.
- Bereiten phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Auflösen Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) und KCl (0,20129 g) in 1 l destilliertem Wasser und Einstellen des pH - Werts auf 7,4.
- Bereiten PBST: 0,1% Tween-20-Lösung in PBS durch Auflösen von 100 & mgr; l Tween-20 in 100 ml PBS.
- Bereiten Sie Puffer blockiert. Machen 3% Rinderserumalbumin (BSA) Blockierungslösung durch Lösen von 3 g BSA in 100 ml PBST, enthaltend 0,2% Tween-20.
- Bereiten Sie CUBIC-1 (Reagenz 1). Mischungs 25 wt% Harnstoff, 25 Gew% N, N, N ', N'-Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin und 15 Gew% Triton X-100 in dH 2 O.
- Bereiten Sie CUBIC-2 (Reagenz 2). Mischungs 50 Gew% Saccharose, 25 Gew% Harnstoff, 10 Gew% 2, 2 ', 2' '- Nitrilotriethanol und 0,1% (v / v) Triton X-100 in dH 2 O.
- Bereiten Sca le A2: 4 M Harnstoff, 10% w / v Glycerin und 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,7.
- Bereiten Sca le B4: 8 M Harnstoff und 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,7.
- Bereiten Sca le 70: 4 M Harnstoff, 70% w / v Glycerin und 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O.
2. Tamoxifen Induktion, Embryo Isolierung und Fixierung
- Tamoxifen Induktion und Embryo Isolation
- Mit Hilfe eines gekrümmten Ernährungsschlauch genehmigten Protokoll (ACUP 13-12007), Schlundsonde die weiblichen R26Cre ERT2 Confetti Mäuse (gesteckt von R26Cre ERT2 männliche Mäuse) mit 10 ug / g Tamoxifen an embryonalen Entwicklungs Tag E7.75 33. Bei embryonalen Tag 9,5 (E9.5) oder E10,5, einschläfern die weibliche Mäuse mit CO 2 und Genickbruch.
- Nach Überprüfung der Maus Tod, öffnen Sie die Maus Bauchhöhle mit einer Schere (Abschnitt 1 Hinweis sehen) und das Uterushorn sezieren aus, die Eileiter Schichten mit Hilfe von Schere und Pinzette entfernen und wiederleasen die Embryonen aus dem Eileiter 23,24.
- Transfer der Embryonen auf eine Petrischale mit PBS (pH 7,4). Unter dem Binokular, entfernen Sie die nicht-embryonale Schichten (Chorion, Dottersack und Amnion) mit Hilfe einer Pinzette entfernen.
- Mit einer Pinzette und Schere, sammeln die weibliche Maus und Embryo Schwanz Proben für die Genotypisierung wie zuvor 22 berichtet. Mit Hilfe einer Plastikpipette, übertragen jeden Embryo in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte mit 1 ml 1x PBS.
- Unter einem Fluoreszenzmikroskop, identifizieren die GFP / RFP / GFP positive Embryonen über ein inverses Mikroskop mit einer Kamera. Schälen Sie die Herzbeutel mit einer Pinzette entfernt und drehen Sie das Herz / Embryo mit Hilfe von gebogenen Pinzette, um die Anzahl von fluoreszierenden Klone auf beiden Seiten des Herzens mit den GFP / RFP / CFP Filter zu bestimmen. Keine Schnitte erforderlich sind.
- GFP / RFP / GFP positive Embryonen Nach der Identifizierung, schnell die Embryonen waschen zweimal (je 2 min) mit 1x PBS in the 48 Well-Platte auf einem Plattenschüttler bei Raumtemperatur (RT). Dies wird überschüssiges Blut zu entfernen.
- Befestigen Sie den Embryo / embryonale Herz mit 4% Paraformaldehyd (PFA) bei RT. Die Fixierungszeit ist abhängig von der embryonalen Alter und Gewebegröße. Für E9.5 fixieren den Embryo für 2 h bei RT. Die späten embryonalen Stadium Embryonen erfordern längere Fixierungszeit, die sogar bis 24 Stunden für die postnatale Herz verlängert werden kann.
ACHTUNG: Paraformaldehyd ist giftig, sollte der Kontakt mit Haut, Augen und Schleimhäute. - Nach der Fixierung, waschen Sie den Embryo / Herz in der 48-Well-Platte zweimal (jeweils 10 Minuten) mit 1x PBS auf einem Plattenschüttler bei RT. Dies entfernt die überschüssige PFA aus dem Embryo / Herz. Die Embryonen werden dann weiter verarbeitet für ganze Berg Färbung und Gewebe Lichtung.
3. Ganze Berge Färbung
HINWEIS: Nach dem PFA Fixierung der Embryo / Herz ganze Berg-Färbung wird wie folgt.
- Permeabilisierung den Embryo / Herz in einer 48-Well-Platte mit 1 ml von 0,1% PBST für 2 Stunden auf Plattenschüttler bei RT.
- Nach Permeabilisierung, tauchen Sie den Embryo / Herz in 1 ml Blockierungspuffer, für 2 Stunden oder über Nacht auf einem Plattenschüttler bei 4 ºC.
- Tauchen Sie den Embryo / Herz in die Endothelzellen-spezifischen Antikörper PECAM (CD31), verdünnt (1: 100) in 0,3 ml Puffer für 48 Stunden auf einem Plattenschüttler bei 4 ° C blockiert.
- Waschen Sie den Embryo / Herz mit PBST 5-mal, jeweils 30 min bei RT auf einem Plattenschüttler. Dies entfernt den Überschuß unspezifische gebundenen primären Antikörpers aus dem Gewebe.
- Tauchen Sie den Embryo / Herz in Alexa Fluor 647 Ziege anti-Ratte-Sekundär-Antikörper, verdünnt (1: 1000) in 1 ml Puffer für 48 Stunden auf einem Plattenschüttler bei 4 ° C blockiert.
- Wiederholen Sie Schritt 3.4 den sekundären Antikörper zu waschen.
- Post-fix den Embryo / Herz mit 4% PFA für 1 h bei RT auf einem Plattenschüttler und waschen zweimal mit PBS jeweils 5 Minuten.
- Stain den Embryo / Herz mit der Kernfärbung 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (verdünnt in PBST bei einer concentVerhältnis von 0,01 mg / ml) für 10 min auf Plattenschüttler bei RT. Folgen Sie mit zwei PBS Waschungen von jeweils 5 Minuten.
4. Embryo / Herz Clearing mit Sca l e oder CUBIC - Methode
HINWEIS: Nach der ganze Berg Färbung der Embryo / Herz entweder auf die Sca le oder CUBIC Gewebe Clearing - Verfahren unterzogen wird. Die Wahl des Verfahrens hängt von der Gewebegröße und embryonalen Alter. Für E11,5 oder früheren Alter Embryonen, l e Gewebe Clearing- Verfahren Verwendung Sca, während für ältere Embryonen oder postnatale Herzen der CUBIC Gewebe Clearing- Verfahren wird bevorzugt.
- Scale-Tissue Clearing-Methode
- Inkubieren Sie den Embryo / Herz mit 1 ml Sca l e A2 - Lösung in einem Szintillationsphiole (eingewickelt in Alufolie) mit gelegentlichen sanften (von Hand) für 48 Stunden bei 4 ° C schütteln.
- L e A2 Inkubation Nach Sca, Inkubation des Embryos / Herz mit 1 ml Sca l e B4 Lösung bei 4 ° C in der gleichen Fläschchen mit gelegentlichen sanften für anot Schüttelnsie 48 Stunden.
- Inkubieren Sie den Embryo / Herz für weitere 48 Stunden mit 1 ml Sca l e 70 bei 4 ° C mit gelegentlichen leichtem Schütteln. Berg Embryo 90% Glycerin (siehe Abschnitt 5.1).
- CUBIC Tissue Clearing-Methode
- Für ganze Embryo / Herz CUBIC Lichtung, tauchen jeden Embryo / Herz in 1 ml CUBIC-1 mit gelegentlichen leichtem Schütteln für 48 Stunden bei 37 ºC 7. Nach 48 Stunden, um die Lösung mit dem gleichen Volumen an frischem CUBIC Reagenz 1, zu ersetzen und die Probe für weitere 48 Stunden bei 37 ° C mit gelegentlichem Schütteln mit der Hand inkubiert.
- Waschen Sie die CUBIC-1 behandelt Herz / Embryo mit 1x PBS mehrmals bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln mit der Hand. Dies entfernt die überschüssige CUBIC-1-Lösung.
- Nach CUBIC-1 mit PBS ausgewaschen, tauchen die Embryonen / Herzen in CUBIC-2-Lösung (1 g pro Embryo / Herz) für 48 Stunden bei 37 ° C mit gelegentlichen sanft mit der Hand schütteln. Dies folgt Embryo / Herz Montage Glycerin (siehe Abschnitt 50,2).
5. Proben Montage und Imaging
HINWEIS: Die geräumten Embryonen oder Organe in Sca l e 70 oder CUBIC-2 - Lösung kann mit Skala 70 und CUBIC-2 - Lösung als Abbildungsmedium direkt abgebildet werden, beziehungsweise. Betrachtet man jedoch die Anfälligkeit der embryonalen Proben Clearing Reagenzien, wenn die Proben nicht unmittelbar abgebildet werden, sondern langfristige, speichern Sie die Proben in 90% Glycerin nach dem Protokoll unten gespeichert.
- Direkt die Sca le in 1 ml 90% Glycerin und lagern bei 4 ° C bis zur Bildgebung gelöscht Probe tauchen.
- Waschen Sie die CUBIC behandelte Probe mit 1x PBS zweimal, jeweils 5 min und Inkubation sequentiell die Probe mit 1 ml 30%, 50%, 70% und 90% Glycerin-Lösung jeweils für 30 min.
- Zur Bebilderung, Transfer der Probe auf Glasboden Petrischale mit einer minimalen Menge von 90% Glycerin und Bild Klone mit einem konfokalen Mikroskop mit zwei Photonen-Fähigkeiten ausgestattet.
- Bild das Herz oder Embryo im Glycerin mit einer 10X / 0.3 NA, ein 25X / 0,8 NA Tauch-, oder ein 40X / 1.2 NA Wasser Korrekturobjektivlinse. Bild DAPI unter Verwendung von 2-Photonen-Anregung von einer kohärenten Titan: Saphir-Laser-Chamäleon. Die Wahl des Mikroskops und die Objektivlinse von dem Zweck der Experimente abhängen wird, beispielsweise für Superauflösung, ein Lichtbogen Fluoreszenzmikroskop verwendet werden könnten.
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Representative Results
Abbilden der gelöscht embryonale Herz
Wirbelherzbildung ist ein räumlich - zeitlich geregelt morphogenic Prozess und hängt von der Organisation und Differenzierung von Vorläuferzellen aus vier verschiedenen Quellen 1. Zellen aus dem ersten Herzfeld des Herz Mondsichel wird in Richtung der ventralen Mittellinie falten, um eine lineare Herzrohr zu bilden. Die Zellen aus dem zweiten Herzfeld zunächst dorsomedial zum ersten Herzfeld Wohnsitz translozieren anschließend dem Pharynx und splanchnic Mesoderm, von wo aus sie an den bereits bestehenden Gerüst des linearen Herzrohr wandern. Die Zellen des zweiten Herzfeld an den rechten Ventrikel, Ausflusstraktes (OFT) Myokard und bis zu einem gewissen Endokardiums 25-28 beitragen. Cardiac Neuralleistenzellen (CNCC) mit Ursprung aus postotic Rhombomeren 6, 7 und 8 wird auf die Schwanz Rachen wandern und signifi beitragenkant auf die glatte Muskulatur und Endokardkissen in der OFT. Sie tragen auch zur Bildung des aorticopulmonary Septum 29,30. Die vierte Population besteht aus epikardialen Zellen aus dem pro-epikardialen Organ (PEO) abgeleitet ist , und trägt zu Fibroblasten, glatten Muskelzellen und möglicherweise anderen kardialen Zelltypen 31. Das Epikard reguliert koronaren Gefäßentwicklung, Herz Wachstum und Morphogenese 21.
Das wichtigste Konzept , über Herzmorphogenese ist , dass während der Herzentwicklung, abnormale Zellmigration / Differenzierung der vier Vorläuferzellpopulationen in Mißbildungen oder angeborenen Herzfehlern 4,22,32 führen wird, die die häufigste Ursache von Geburtsfehlern in der Welt . Die Bestimmung der Mechanismen der Herzmorphogenese auf zellulärer und molekularer Ebene ist ein wesentlicher Schritt in Richtung Diagnose- und Therapiemöglichkeiten für CHDs zu verbessern.Daher ist es wichtig, den Prozess der Herzmorphogenese auf die ganze Höhe des Herzens mit einzelnen Zelle Auflösung abzubilden. Um das zu erreichen, etikettiert man die Kardiomyozyten durch die Cre Linie unter der Kontrolle des herzspezifischen Troponin T (cTnT) kreuzen, die speziell in Kardiomyozyten 18 ausgedrückt ist, mit mTmG reporter Linie. Die Embryonen bei E8.5 wurden geerntet und gefärbt PECAM endokardialen und Endothelzellen von Kardiomyozyten zu unterscheiden. Die Embryonen wurden dann durch Sca le gelöscht und das Herz abgebildet wurde. Das Myokard wurde durch GFP aufgrund cTnT getriebenen Cre-vermittelte Rekombination des mTmG Reporter markiert ist , und das Endokard wurde mit PECAM (1A und Ergänzungs Film 1) markiert. Die Kardiomyozyten können bei einer einzelnen Zelle Auflösung (Abbildung 1A) beobachtet werden. Die Herzstrukturen des abzubildenden Teils, wie beispielsweise die primitive Ventrikel und OFT deutlich nach der Rekonstruktion 3D identifiziert werden 3D-Wieder VerwendungBau - Software (Abbildung 1B und Ergänzungs Movie 2).
Abbildung einzelner Klone der gelöscht embryonale Herz
Kardiale Morphogenese hängt von kardialen Zelllinie Differenzierung und individuellen Zellorganisation im ganzen Herzen Ebene 22, und somit ist es wichtig , zu Bild einzelne Herzvorläuferzelldifferenzierung zu verschiedenen Herzzelltypen und auch Bildzellmorphologie auf Einzelzellauflösung. Um das zu erreichen, wurde Rosa26Cre ERT2 15 gekreuzt R26R-Confetti 16 und die schwangere Frau wurde mit Tamoxifen bei einer geringen Konzentration Sonde ernährt. Nach 48 Stunden wurde der Embryo in E9.5 geerntet und ganz für PECAM Halterung gefärbt, und dann wurde das ganze Herz abgebildet. Wir fanden, dass es nur einen Cluster von Zellen war, lokalisiert der OFT, und dieser Klon hatte 8 Zellen basierend on das rekonstruierte Bild und aufeinanderfolgende Abschnitte (2A, 2B und Ergänzungs Movie 3), was anzeigt , dass diese Zellen von einer einzelnen Vorläuferzelle stammen. Die Zellmorphologie und Zellverhalten , wie beispielsweise Zellproliferation und Migration aus der endgültigen Positionierung der Zellen (2A) entnommen werden. Wir wendeten auch die CUBIC Methode, um die embryonale Herz an E9.5 und E10.5 zu löschen, und fanden heraus, dass bereits nach 24 Stunden Inkubation mit Reagenz 1 wurden die Embryonen auf subtile Weise gelöst, und die Gewebestruktur beeinträchtigt wurde (Daten nicht gezeigt ).
Imaging geräumte postnatalen und späten embryonalen Herzen
Wir wendeten beide Sca l e und CUBIC postnatalen Herzen zu löschen. P2 Herzen mit dem Genotyp von & alpha; MHC-Cre; mTmG (& alpha; MHC-Cre ist speziell in Kardiomyozyten ausgedrückt <sup> 17) wurden für 48 Stunden mit Sca l e gelöscht, aber mehr Transparenz nicht als die nur mit PBS behandelten Herzen angezeigt werden (Daten nicht) gezeigt, was darauf hinweist , dass Sca l e Clearing für postnatalen Herzen nicht wirksam ist. Wenn P2 Herzen mit CUBIC Reagenz 1 für 48 Stunden gelöscht wurden, und Reagenz 2 für 96 Stunden, waren sie viel transparenter als die mit Reagenz 1 für 48 Stunden und Reagenz 2 für 48 Stunden gelöscht Herzen. Die Abbildungstiefe wurde mit 96 hr Reagenz 2 inkubiert (Supplementary Filme 4 und 5) deutlich erhöht, was darauf hinweist , dass längere Inkubation mit den kubischen Reagenzien fördert die Transparenz und sorgt für eine Erhöhung der Bildtiefe. Die Form und die Größe jeder cardiomyocyte kann durch die Membran lokalisiert GFP (3A) identifiziert werden, die verwendet werden können , Hypertrophie zu identifizieren.
Wir räumten auch NFATc1-Cre; Konfetti (Confetti Weibchen mit Nf gestecktatc1Cre männlich) E17.5 Herzen (NFATc1-Cre in Herz endokardiale Zellen 19) mit CUBIC Reagenz 1 für 48 Stunden und Reagenz 2 für 48 Stunden ausgedrückt. Die Herzen sind transparent und fluoreszierende Proteine, einschließlich GFP, YFP, CFP und RFP wurde erwartet, dass die endokardiale Zellen und deren abgeleiteten Zellen zu kennzeichnen; jedoch nur GFP YFP und durch das ganze Herz abgebildet werden konnte (Figuren 3B, 3C und Ergänzungs Filme 6 und 7), und die GFP und RFP nicht nachgewiesen werden konnte (Daten nicht gezeigt). Die Färbung für PECAM (Alexia Fluor 647) auch nicht nachgewiesen werden konnte (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass das CUBIC Reagens, das die GFP, RFP und den Antikörper konjugiert Fluorophore in diesem Protokoll stillt.
Abb . 1: Die Abbildung der Sac / e embryonale Herz gelöscht (A) Ein optischen Scheibe eines E8.75 Herz (cTnT-Cre; mTmG) gezeigt. V: Ventrikel; OFT: Ausflusstraktes. (B) zeigt die rekonstruierten Herzstruktur von 93 aufeinander folgenden optischen Scheiben mit einer Gesamttiefe von 110,4 & mgr; m. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m in A. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Abbildung einzelner Klon von Sca / e gelöscht embryonale Herz (A) Ein optischer Abschnitt eines Klons von einem E9.5 Herz mit dem Genotyp von ROSA26-Cre ERT2;. ROSA26-Konfetti. Der Pfeil zeigt auf ein zellulares Vorsprung eines Kardiomyozyten. (B) zeigt den rekonstruierten Klon in der OFT Bereich des E9.5 Herz mit 10 optischen Scheiben und 36 & mgr; m Gesamttiefe. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m in A. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. Abbildung 3: Visualisierung der CUBIC gelöscht postnatalen und späten embryonalen Herzen (A) zeigt einen optischen Abschnitt eines P2 Herz mit dem Genotyp von & alpha; MHC-Cre; mTmG; alle optischen Schnitte werden in Ergänzungs Film 5. (B) zeigt einen Abschnitt eines E17.5 Herz mit dem Genotyp von NFATc1-Cre gezeigt; ROSA26-Konfetti. (C) zeigt die rekonstruierten Herzstruktur von 106 optischen Scheiben mit einer Gesamttiefe von 630 & mgr; m. Der Maßstabsbalken = 20 & mgr; m in A und 100 & mgr; m in B. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. Ergänzende Film 1: Funktionelle Bildgebung des Sca le embryonale Herz (Rechtsklick zum Download) gelöscht Film 1 zeigt optische Schnitte eines Sca le behandelt E8.75 Herz (cTnT-Cre; mTmG) von Herzoberfläche zu Herzen Lumen. Die Tiefe beträgt 110,4 & mgr; m, und es gibt 93 Scheiben insgesamt.
Ergänzende Film . 2: Visualisierung der Sca le embryonale Herz gelöscht (Rechtsklick zum Download) Movie 2 zeigt die 3D - Oberflächenbild des rekonstruierten Herz in Film 1, Rekonstruktionented über die 3D-Rekonstruktionssoftware. Gelb markiert den PECAM Ausdruck und grünen Etiketten alle Kardiomyozyten.
Ergänzende Movie 3: einen einzigen Klon des Sca le Imaging gelöscht embryonale Herz (Rechtsklick zum Download). Movie 3 zeigt Ausschnitte eines Klons von einem E9.5 Herz mit dem Genotyp von ROSA26-Cre ERT2.
Ergänzende Film 4: postnatalen Herzen der CUBIC gelöscht Imaging (Rechtsklick zum Download). Film 4 zeigt Abschnitte eines CUBIC behandelt P2 Herz (& #945; MHC-Cre; mTmG) von Herzoberfläche zu Herzen Lumen. Dieses P2 Herz wurde mit CUBIC Reagenz 1 für 48 Stunden, und CUBIC Reagenz 2 für 96 Stunden gelöscht.
Ergänzende Film 5: Die Abbildung der CUBIC gelöscht postnatalen Herzen (rechts Download anklicken). Film 5 zeigt ein Herz , das mit Reagens CUBIC 1 für 48 Stunden und Reagenz CUBIC 2 für 48 Stunden gelöscht wurde. Die Tiefe beträgt 136 & mgr; m mit 6 & mgr; m pro Abschnitt im Film 4 und die Dicke beträgt 76 & mgr; m mit 6 & mgr; m pro Abschnitt im Film 5.
Ergänzende Film 6: CUBIC gelöscht spät embry ImagingONIC Herz (rechts zum Download klicken) Film 6 zeigt Abschnitte eines CUBIC behandelt E17.5 Herz (NFATc1-Cre; ROSA26-Konfetti). von Herzoberfläche zu Herzen Lumen. Die Tiefe beträgt 630 & mgr; m mit 6 & mgr; m pro Abschnitt.
Ergänzende Film 7: Funktionelle Bildgebung des CUBIC gelöscht späten embryonalen Herz (Rechtsklick zum Download). Film 7 zeigt die 3D - Oberfläche Bild des Herzens in Film 6 über die Rekonstruktionssoftware 3D rekonstruiert.
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Discussion
Der Embryo Isolation ist ein sehr wichtiger Schritt. E9.5 Embryonen sind sehr zerbrechlich und klein, so besonders darauf geachtet werden, sollten nicht die Embryo / Herzstrukturen während der Isolierung nicht zu beschädigen. Die nicht-embryonale zusätzliche Schichten des Embryos / Herz umhüllt sollte sorgfältig besonders entfernt werden, wenn die gesamte Embryo-Bildgebung. Auf diese Weise können Antikörper und Clearing-Mischung Eindringen tief in den embryonalen Geweben und hilft auch das Hintergrundsignal bei der Entfernung bei der Abbildung. Mehrere Antikörper , einschließlich Antikörper gegen PECAM, acetylierte α-Tubulin und Integrin β1 wurden untersucht und alle konnten erfolgreich detektiert (Daten nicht gezeigt) 33. Dies zeigt, dass die molekulare Integrität, zelluläre Integrität und Antigen-Kompatibilität nicht während dieses Clearing-Prozess gestört wurden.
Übertragen Sie den Embryo / Herz einer breiten Mund Transferpipette (schneiden Sie die Spitze). Dies vermeidet Beschädigungen bei der Handhabung. Die GFP / YFP / RFP / CFP-Expressionsmuster und nUmbra von Klonen im Herzen sorgfältig aufgezeichnet, um die geeignete Dosierung bestimmen zu beschriften ein Klon pro Herz oder andere Organe werden sollte. Aufgrund der geringen Dosierung von Tamoxifen (10 ug / g), manchmal ist das Herz keine Klone enthalten oder ist schwierig, irgendwelche Klone zu detektieren. Daher wird empfohlen, den Dottersack zu verwenden, um festzustellen, ob der Embryo keine GFP hat / YFP / RFP / GFP-Klone.
Der Embryo oder Herz Fixierung ist ein wichtiger Schritt, da Über Fixierung wird in einem hohen Hintergrund führen, während sie unter Fixierung in einem schlechten Färbung führen. Es wird empfohlen, die E8.5-E10.5 ganze Embryo für 2 h bei RT auf einem Plattenschüttler zu fixieren. Während für E11.5-E15.5 Embryonen, ist die Empfehlung sorgfältig um das Herz zu isolieren und es mit 4% PFA für 2 h bei RT fixieren. Nachdem er sich vergewissert, die Schichten rund um das Herz, wenn die Verarbeitung des gesamten Embryos, die E11.5- E13.5 Embryonen auch für 3-4 h bei RT fixiert werden kann zu entfernen, aber das erfordert erhöhte Gewebe Klärzeit. Die E16.5-P1 (postnatalTag 1) Herzen sind für 3-4 h bei RT auf einem Plattenschüttler befestigt. Wenn die gesamte Embryo repariert ist, sollten die vorderen und hinteren Gliedmaßen entfernt werden, da sie die Herzbildgebung behindern.
Die Proben sollten mit CUBIC und Sca le in Szintillationsgefäße behandelt werden Probe Trocknung zu minimieren. Wir haben bei 37 ° C mit dem CUBIC Gewebe Clearing - Verfahren besser Reinigung der Proben beobachtet, während Sca le Clearing optimal bei 4 ° C durchgeführt wird. Nach der Abbildung können die Proben kurzfristigen in kubisch-2 oder Sca le 70 gespeichert werden. Die Proben sollten immer mit Aluminiumfolie abgedeckt werden Fluoreszenzbleich zu verhindern.
Embryonale Gewebe und Organe haben weniger Lipid und Ablagerung extrazellulärer Matrix, die in weniger Klärungszeit zur Folge hat. Auf der anderen Seite sind sie anfälliger für die Clearing-Reagenzien. Die Clearing Reagenzien könnte die Integrität der Gewebestruktur und Antigen beeinflussen, was zur Abschreckung von GFP, RFP und Antikörper conjugated Fluorophors. Daher könnte mehr Fixationszeiten der Abschreckung zu verhindern. Das Abschrecken der fluoreszierenden Proteine können auch auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Chemikalien und pH zurückzuführen sein , wie zuvor 34 gemeldet. Andere chemische Rezepturen, pH, Fixiermitteln und die Inkubation Länge sollte das Abschrecken der fluoreszierenden Proteine zu minimieren erkundet werden.
Die Methode der ganze Organ oder Gewebe transparent Lichtung hat volumetrische 3D-Bildgebung revolutioniert. Die frühere Bildgebungsverfahren für die kardiale Morphogenese, die die manuelle 2D- oder 3D - Rekonstruktion von Serienschnitten beteiligt sind , ist zeitaufwendig und Instrument anspruchsvollen 5,6. Hochauflösende episkopisch (HREM) in Verbindung mit 3D - Modellierung können zur Untersuchung der Morphogenese des Maus - Herz und für ausgezeichnete anatomische Beschreibung der trabekulären Architektur in der Entwicklungsmausembryo enthält 35 angewendet werden. Allerdings ist HREM nicht die Identifizierung des fluoreszier ermöglichenent Protein markierten Zellen oder 35 Antikörper gefärbten Zellen von den übrigen Zellen. Unter Verwendung des aktuellen Protokolls, mit minimalem Aufwand und hohe Wirtschaftlichkeit haben wir erhalten erfolgreich die Fluoreszenzsignale in der embryonalen Herzens unter Verwendung Sca le oder kubischem Gewebe Clearing- Verfahren (Figuren 1 - 3). In Kombination mit einer niedrigen Dosis (10 ug / g) von Tamoxifen Cre Rekombination zu induzieren und ein paar Klone innerhalb des gesamten Embryo und im Herzen erzeugen, kann dieses System verwendet werden , zu verfolgen und zu untersuchen einzelne Herzvorläuferzelldifferenzierung und Zellverhalten in vivo (2A) 33. Darüber hinaus kombiniert mit Cre-vermittelten Gen-Deletion oder Überexpression und Cre Einzelzellmarkierung vermittelt, kann diese Abbildungssystem genetischen Funktionsverlust oder -gewinn von Funktions auf Vorläuferzelldifferenzierung und Zellverhalten während der Herz Morphogenese zu studieren angewendet werden, und liefert somit einen robusten Werkzeug study die Ätiologie von angeborenen Herzfehlern.
Die zwei Gewebe Clearingsysteme Sca / e und CUBIC in dieser Studie verwendeten zeigten unterschiedliche Clearing Effizienz, was die Systeme unterscheidet anhand von embryonalen Alter, Gewebedicke und die Dauer der Gewebeklärungszeit. Für Embryonen im Frühstadium E9.5-E10.5, die Sca / e System gerendert nicht nur das Gewebe klar, aber geschützt auch den Embryo Morphologie und bewahrte die Fluoreszenzsignale, während die CUBIC Behandlung in Embryo Auflösung geführt. Dies könnte das Ergebnis einer zusätzlichen Aminoalkoholen und eine höhere Konzentration an Triton X-100 in den kubischen Lösungen 8 sein. Für ältere Herzen habe die Sca / e System das Gewebe vollständig selbst mit einer längeren Inkubationszeit zu löschen. Die CUBIC Clearing - Lösung machte die älteren Gewebe deutlich (Abbildung 3). Allerdings führte erhöhte Inkubationszeit in schwächeren Signalen und nur endogene GFP geschützt, während RFP, CFP und Antikörper konjugiert Signalewir sind verloren. Aus diesem Grund wird eine optimierte Rezeptur der Clearing Reagenzien und besser Inkubationszeit erforderlich wäre, um Bild Herzen oder Organen mit einem größeren Spektrum von Fluoreszenzmarkierungen volumetrisch.
Diese Studie zeigte, dass ein Etikett kann, Spur und Bild einzelnen Herz Klone in Kombination mit einem ganzen Berg Färbung von endokardialen / endotheliale Zellmarker PECAM der Entwicklung von Herz. Die whole mount-Färbung von PECAM und DAPI in diesem System nicht nur hilft, die Zelltypen und Zellmorphologie der markierten Zellen innerhalb eines Herzens zu identifizieren, sondern erlaubt auch die Untersuchung der klonalen Muster, Migration und das Verhalten während der Herz Morphogenese. In 2A beobachteten wir einen Klon mit 8 Zellen in OFT. Unter Verwendung der Anzahl der Zelle vorhanden in diesem Klon unter Bezugnahme auf die Kennzeichnung der Zeit kann die Zellproliferationsrate leicht berechnet werden. In einer weiteren Studie das gleiche System identifizierten wir die orientierte Zellteilung Muster und migration Muster der einzelnen Kardiomyozyten während Trabekularisierung Prozess 33. Die Anwendung dieses Protokolls, die Auswirkungen der genetischen Verlust der Funktion oder einen Funktionsgewinn raum-zeitlich auf dem markierten Herzvorläuferzelldifferenzierung, klonalen Muster und Zellverhalten ist möglich zu studieren, und wird in Studien über die Ätiologie angeborener Herzfehler bei genetischen helfen und molekularer Ebene in einem 3D-Kontext. Darüber hinaus kann dieses Protokoll zu studieren, der Morphogenese in anderen Organsystemen angewendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
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