Abstract
전체 심장 수준에서 단일 클론 추적 및 분석 심장 개발하는 동안 심장 전구 세포의 행동과 분화를 결정하고, 정상 및 비정상 심장 형태 형성의 세포 및 분자 기초 연구를 허용 할 수 있습니다. 회고전 단일 클론 분석 최근 새로운 기술은 단일 세포 해상도에서 심장 형태 형성의 연구가 가능합니다. 그러나 조직의 불투명도 및 이미징 깊이와 마음의 빛 산란은 단일 셀 해상도을 방해 전체 심장 이미징 증가한다. 이러한 장애, 개발해야 조명 및 검출 모두 매우 투명 마음을 렌더링 할 수있는 전체 배아 청산 시스템을 극복하기 위해. 다행히 지난 몇 년 동안, 같은 CLARITY으로 전체 유기체의 청산 시스템, 무서 제작, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB 및 PACT위한 많은 방법들이보고되었다. 이 연구소는 카드의 세포 및 분자 메커니즘에 관심IAC의 형태 형성. 최근에, 우리는 ROSA26-Cre 호텔 ERT2를 통해 추적 단일 세포 계보를 설립, 드문 드문 라벨 세포에 ROSA26 - 색종이 시스템을 심장 개발하는 동안. 우리는 마음 안에 이미지 단일 클론에 전체 마운트 얼룩과 함께 배아을 취소 무서 제작 및 CUBIC (일반, 탁 트인 뇌 영상 칵테일 및 전산 분석) 등 여러 전체 배아 삭제 방법을 적용. 심장은 성공적 단세포 해상도로 촬상 하였다. 우리는 CUBIC 출생 후의 마음을 지울 수 있습니다 동안 무서 르가, 배아 심장을 취소 할 수 있지만, 효과적으로 출생 마음을 지울 수 없습니다 것을 발견하지만, 손상 조직을 용해하여 배아 마음입니다. 여기에 설명 된 방법은 차례로, 선천성 심장병의 세포 및 분자 기초를 밝힐 수 심장 형태 형성 중에 단일 클론 해상도 유전자 기능 연구를 허용한다.
Introduction
심장 형태 형성은 심장의 별개 섹터로 심장 전구 세포의 네 가지 유형의 시공간 구성을 필요로하는 일련의 이벤트이며, 또한 기능성 심장 1,2-을 형성하는이 과정을 조율하기 위해 여러 유전자 조절 네트워크를 필요로한다. 심장 사양, 차별화, 패턴, 챔버의 성숙은 심장 성 전사 인자 (3)에 의해 조절된다. 유전자 돌연변이 또는 심장 전구 세포에서 이러한 요인의 전사 후 수차는 배아 치사 또는 선천성 심장 결함 (CHD) 4 중 발생할 수 있습니다. 심장 형태 형성의 연구는 심장 형태 형성에 대한 이해를 촉진 심장 개발하는 동안 추적을 세 가지 차원 (3D) 고유의 세부 구조 및 단일 레이블 심장 전구 세포 계보의 이해를 필요로한다. 고해상도 부 기초 단층 다수의 방법 일 개발되어왔다이미지 기관 구조 5,6에 수십 년 과거 전자; 그러나, 이러한 방법은 고가의 특화된 장비 광범위한 노동력을 필요로하고, 최종 부피 화상 7,8 재구성 단일 셀 해상도의 상세한 구성 조직이 부족하다.
단일 세포 수준에서 3D 용적 촬상 생체 7 전구 세포 분화 및 세포의 거동을 연구하기위한 수단을 제공한다. 그러나 조직 광 산란 깊은 그대로 마음 안에 3D로 세포 구조를 이미징에 주요 장애물이 남아있다. 조직 투명성 8 증가 가능성 접근법 지질 광산란의 주요 원인, 지질 및 / 또는 지질 및 그 주변 영역 사이의 굴절률 차의 조정 제거되어있다. 지난 몇 년 동안, 조직 청산 방법의 수는 조직의 불투명도 및 빛의 산란을 줄일 수있는 개발되었다 BABB (벤질 알코올, 벤질 benzoat 등전자 혼합물)과 DBE (테트라 히드로 푸란 dibenzylether); 그러나이 방법에서, 형광 소광 문제 8-10 남아있다. 용매, 예를 SeeDB (과당 / 티오 글리세롤) 및 3DISCO (디클로로 메탄 / dibenzylether)와 같은 친수성 방법을 기반으로 형광 신호를 보존하지만, 7,8,11 투명 전체 기관을 렌더링하지 않습니다. 이에 비해 선명도 조직 소거 방법은 장기 투명 렌더링, 또한 하이드로 겔 7,13 매립 필요 PACT (수동 명확성 기법)처럼 그 지질 8,12을 제거 전문 전기 영동 장치를 필요로한다. 사용 가능한 모든 조직 삭제 방법에 대한 자세한 내용 등 리처드슨과 Lichtman, 표 1을 참조하십시오. 7.
2011 년, 하마는 등. serendipitously 친수성 혼합물 '무서 르를'발견 (우레아, 글리세롤 및 트리톤 X-100 혼합물) 마우스 뇌와 배아 transpar를 렌더링하는천만에 완전히 표시 클론 (14)로부터 형광 신호를 보존하면서. 이는 세포 내 해상도 밀리미터 및 신경 집단과 돌기의 대규모 개조의 깊이에서 뇌 손상의 이미징을 허용한다. 사키 등. 또한 아미노 알코올을 첨가하여 제작 무서에게 개선 및 인지질 용해를 증가 'CUBIC'(일반, 탁 트인 뇌 영상 칵테일 및 전산 분석) 조직 청소 방법, 감소 청소 시간을 개발하고, 여러 가지 빛깔의 형광 이미징 8 허용했다. 본 연구에서는 cardiogenesis 동안 심장 내부의 무서 제작의 장점과 CUBIC 조직 청소 기술과 고해상도 3D 광학 절편, 각각의 클론을 복용 Rosa26Cre ERT2 15 R26R - 색종이 (16), αMHC-Cre 호텔 17, cTnT를-Cre 호텔을 사용하여 추적했다 18 일 Nfatc1-Cre 호텔 (19), 및 Rosa26-mTmG (mTmG) 20 마우스 라인. 전체 마운트 염색 (WMS) 방법의 조합은 이전에 (21, 22)를 더 표시 클론의 다른 단백질의 염색과 3 차원 체적 맥락에서 자신의 행동의 연구에 허용 조직 청산 방법과를 개발했다. 조직 및 정화 WMS의 조합은 심장 개발시 다른 유전자와 단백질의 역할을 이해하고, 선천성 심장 결함의 원인을 허용한다. 이 프로토콜 개발시 다른 전구 세포의 분화, 세포의 행동 및 장기 형태 발생 이벤트 연구에 적용될 수있다.
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Protocol
모든 동물 실험은 관리에 대한 NIH 가이드에와 실험 동물의 사용에 따라 올 버니 의과 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 수행 하였다.
1. 솔루션의 준비
참고 : Rosa26Cre ERT2 15 R26R - 색종이 (16)는, αMHC-Cre 호텔 (17), 및 Rosa26-mTmG (mTmG)는 20 마우스 라인은 시중에서 구입 한 cTnT를-Cre 호텔 (18)는 알라바마 대학에서 박사 지아오에서 선물했다 Nfatc1-Cre 호텔.. 의학 (19)의 알버트 아인슈타인 대학에서 박사 빈 저우에서 선물했다. 마우스는 양측 개흉술, 잘린 또는 자궁 전위에 의해 사망 검증의 물리적 수단 다음에 적어도 60 초 동안 밀폐 된 챔버 내에서 이산화탄소 흡입에 의해 안락사시켰다.
- 타목시펜을 준비합니다. 해바라기 씨 OI 10ml에 타목시펜 10 ㎎을 용해엘. -20 ℃로 완전 용해 후, 분액 저장.
- 인산 완충 식염수 (PBS)를 준비한다. 나 2 HPO 4 (1.41960 g), KH 2 PO 4 (0.24496 g), 염화나트륨 (8.0669 g) 및 증류수 1 L에의 KCl (0.20129 g)을 녹이고 7.4로 pH를 조정합니다.
- PBST 준비 : 0.1 % 트윈 20 용액을 PBS에서 PBS 100 ㎖의 트윈 20 100 ㎕를 용해.
- 버퍼를 차단 준비합니다. 0.2 % 트윈 -20을 함유하는 PBST 100 ml의 BSA 3 g을 용해시켜 3 % 소 혈청 알부민 (BSA) 블로킹 용액을 만든다.
- CUBIC-1 (시약 1)을 준비합니다. 25 중량 % 우레아, 25 중량 %의 N, N, N ', N'- 테트라 키스 (2- 히드 록시 프로필) 에틸렌 디아민 및 15 중량 %를 혼합 DH 2 O. 트리톤 X-100
- CUBIC-2 (시약 2)을 준비합니다. 50 중량 % 수 크로즈, 25 중량 % 우레아, 10 중량 %, 2, 2 ', 2' '믹스 - nitrilotriethanol 0.1 % (절 / V) DH (2) O. 트리톤 X-100
- 무서 제작 A2 준비 : 4 M 우레아, w 10 % / V 글리세롤 및 / 트리톤 V X-10 w 0.1 %DH 2 O. 0 7.7로 pH를 조정합니다.
- 무서 제작 : B4 준비 : 8 M 요소 및 / 트리톤 V X-100w 0.1 % DH 2 O.에서 8.7로 pH를 조정합니다.
- 준비 무서 제작 : 70 : 4 M 우레아, 70 % w / v를 글리세롤과 DH 2 O.에서 / 트리톤 V X-100 w 0.1 %
2. 타목시펜 유도, 배아 분리 및 고정
- 타목시펜 유도와 배아 분리
- 배아 발달 하루 E7.75 (33)에서 타목시펜의 10 μg의 / g으로 (R26Cre ERT2 수컷 마우스에 의해 연결) 곡선 공급 튜브 승인 프로토콜 (ACUP 13-12007), 위관 여성 R26Cre ERT2 색종이 마우스를 사용. 배아 일 9.5 (E9.5) 또는 E10.5에서, CO 2, 자궁 경부 전위와 여성의 쥐를 안락사.
- 마우스 사망 확인 후, 가위 마우스 복강을 열고 자궁 경적을 해부, (제 1 주 참조) 가위와 핀셋, 다시의 도움으로 자궁 튜브 층을 제거자궁 관 (23, 24)에서 배아를 임대.
- PBS (산도 7.4)를 포함하는 페트리 접시에 배아를 전송합니다. 해부 현미경, 핀셋의 도움으로 비 배아 층 (융모막, 난황과 양막)를 제거합니다.
- 이전에 22을보고 집게와 가위를 사용하여 유전자형의 여성 마우스와 배아의 꼬리 샘플을 수집합니다. 플라스틱 피펫을 사용하여, 1X PBS 1 ㎖를 함유하는 48 웰 플레이트의 각 웰에 배아를 옮긴다.
- 형광 현미경, 카메라와 거꾸로 현미경을 통해 GFP / RFP / CFP 긍정적 인 배아를 식별합니다. 멀리 껍질 핀셋을 사용하여 심낭과는 GFP / RFP / CFP 필터와 심장의 양쪽에 형광 클론의 수를 결정하는 곡선 핀셋의 도움으로 마음 / 배아를 돌립니다. 어떤 컷은 필요하지 않습니다.
- GFP / RFP / CFP 긍정적 인 배아를 식별 한 후, 신속하게 일에 1X PBS로 두 번 (2 분 각각) 배아를 씻어전자 48 실온 (RT)에서 판 쉐이커에 잘 판. 이 여분의 혈액을 제거합니다.
- RT에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용하여 태아 / 배아의 마음을 수정합니다. 고정 시간은 배아 나이와 조직의 크기에 따라 달라집니다. E9.5의 경우 실온에서 2 시간 동안 배아를 수정합니다. 늦은 배아 단계의 배아도 출생 후 심장에 대한 24 시간으로 연장 할 수 있습니다 더 이상 고정 시간을 필요로합니다.
주의 : 파라 포름 알데히드는 독성, 피부, 눈 및 점막과의 접촉을 피하십시오. - 고정 후, 실온에서 접시 쉐이커에 두 번 48 잘 접시에 1X PBS로 (10 분 각각) 배아 / 마음을 씻는다. 이 배아 / 마음에서 과잉 PFA를 제거합니다. 배아는 또한 전체 마운트 염색 및 조직 청산을 위해 처리됩니다.
3. 전체 마운트 얼룩
참고 : 다음과 같이 PFA 고정 후 배아 / 마음은 전체 마운트 염색을 실시한다.
- 1m를 사용하여 48 잘 플레이트에서 배아 / 마음을 Permeabilize 하시려면실온에서 플레이트 통에 2 시간 동안 0.1 % PBST의 리터.
- permeabilization 후, 4 ºC에서 접시 통에 2 시간 또는 밤새 차단 버퍼 1 ml의 배아 / 마음을 몰입.
- 4 ºC에서 판 통에 48 시간 동안 버퍼를 차단 0.3 ml의 : (100 1) 희석 내피 세포 특이 적 항체 PECAM (CD31)에 배아 / 마음을 담가.
- 판 통에 실온에서 PBST 5 회, 30 분 각각을 사용하여 배아 / 마음을 씻으십시오. 이 조직에서 과량의 비 특이 결합 된 차 항체를 제거합니다.
- 4 ºC에서 판 통에 48 시간 동안 버퍼를 차단 1 ㎖에 (1000 1) 희석 알렉사 플 루어 647 염소 항 - 쥐 이차 항체에 배아 / 마음을 담가.
- 단계를 반복 3.4 이차 항체를 씻어.
- 판 통에 실온에서 1 시간 동안 4 % PFA와 배아 / 마음을 포스트 - 수정하고 PBS 5 분마다 두 번 씻는다.
- 승낙에 PBST에 희석 핵 얼룩 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) (와 배아 / 마음을 얼룩실온에서 플레이트 통에 10 분 동안 0.01 ㎎ / ㎖)의 배급. 5 분 각각 두 PBS 세척에 따릅니다.
4. 배아 / 무서 리터 e 또는 CUBIC 방법 심장 지우기
참고 : 전체 마운트 염색 한 후, 배아 / 마음이 무서 제작 또는 CUBIC 조직 청소 방법 중 하나를 실시한다. 방법의 선택은 티슈 크기 및 배아 나이에 따라 달라진다. E11.5 이전 연령의 배아를 사용 무서 리터 전자 조직 청소 방법에 대해서는 이전의 배아 또는 출생 후의 마음의 CUBIC 조직 청소 방법이 선호된다.
- 규모의 조직 지우기 방법
- 부드러운 가끔 4 ℃에서 48 시간 동안 (손으로) 진탕 (알루미늄 호일에 싸서) 섬광 유리 병에 무서 리터 전자 A2 용액 1 ml의 배아 / 마음을 품어.
- 무서 리터 전자의 A2 배양 한 후, 가끔 부드러운 anot 진탕와 같은 병에 4 ° C에서 무서 리터 전자 B4 용액 1 mL로 배아 / 마음을 품어그녀의 48 시간.
- 가끔 부드러운 흔들림 4 ° C에서 1 ml의 무서 리터 전자 (70)와 또 다른 48 시간 동안 배아 / 마음을 품어. 90 % 글리세롤을 사용하여 마운트 배아 (5.1 절 참조).
- CUBIC 조직 지우기 방법
- 전체 배아 / 마음 CUBIC 지우기를 들어, 부드러운 가끔 37 ºC 7에서 48 시간 동안 진탕 CUBIC-1의 1 ml의 각 배아 / 마음을 몰입. 48 시간 후, 신선한 CUBIC 시약 (1)의 동일한 양을 가진 용액을 교체하고 가끔 손으로 진탕하면서 37 ℃에서 추가로 48 시간 동안 샘플을 배양한다.
- 부드러운 손으로 흔들어 실온에서 1X PBS 여러 번 함께 CUBIC-1 처리 심장 / 배아를 씻으십시오. 이것은 과잉 CUBIC-1 솔루션을 제거합니다.
- PBS로 CUBIC-1을 세척 한 후, 가끔 부드러운 손으로 흔들어 37 ºC에서 48 시간 동안 CUBIC-2 용액 (배아 / 심장 당 1g)에 배아 / 마음을 몰입. 이 글리세롤을 이용하여 장착 배아 / 마음을 다음 (섹션 5 참조0.2).
5. 샘플 장착 및 이미지
참고 무서 리터 예 70 CUBIC-2 용액의 클리어 배아 또는 기관 각각 촬상 매체로서 스케일 70 CUBIC-2 용액으로 직접 영상화 할 수있다. 샘플 아래의 프로토콜 다음 90 % 글리세롤의 샘플을 저장하는 즉시 촬상하지만, 장기간 저장되지 않은 경우에는 클리어 시약 배아 샘플의 취약성을 고려하여.
- 직접 무서 르 이미징 때까지 4 ℃에서 90 % 글리세롤 및 저장 1 ml의 샘플을 삭제 몰입.
- 회 1X PBS로 5 분간 각각 입방 처리 된 샘플을 세척하고, 30 분 동안 연속적으로 30 %, 50 %, 70 %, 90 % 글리세롤 용액을 각각 1ml의 시료를 배양한다.
- 이미징을위한 두 개의 광자 기능을 구비 한 공 초점 현미경으로 90 % 글리세롤 및 화상 클론 최소량 유리 바닥 페트리 접시에 시료를 옮긴다.
- 이미지 심장이나 배 10 배 / 0.3 NA와 글리세롤에서, 25X / 0.8 NA 침지, 또는 40X / 1.2 NA 물 교정 대물 렌즈. 이미지 DAPI는 일관된 티타늄에서 2 광자 여기를 사용하여 : 사파이어 카멜레온 레이저를. 현미경 대물 렌즈의 선택 초해 예 : 실험의 목적에 의존한다, 광 시트 형광 현미경이 이용 될 수있다.
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Representative Results
지워진 배아 심장 이미징
척추 심장 형성은 시공간 규제 형태 형성 과정과 네 개의 다른 소스 (1)로부터의 조직 및 전구 세포의 분화에 따라 달라진다. 심장 초승달 제 심장 분야에서 세포 선형 심장 튜브를 형성하기 위해 복부 정중선을 향해 접어 것이다. 처음에 첫 번째 심장 필드에 dorsomedially 거주하는 두 번째 심장 필드에서 세포는, 이후 그들은 선형 심장 튜브의 기존 발판으로 마이그레이션 곳에서, 인두 및 내장의 중배엽으로 이동시키다. 두 번째 심장 필드의 세포는 우심실, 유출 관 (OFT) 심근에 어떤 내막 25-28에 기여할 것입니다. 심장 신경 능선 세포 (CNCC) postotic rhombomeres 6, 7, 8에서, 원래는 꼬리 인두로 마이그레이션 및 signifi을 기여OFT가있는 평활근 층과 내막 쿠션 cantly. 그들은 또한 aorticopulmonary 격벽 (29, 30)의 형성에 기여한다. 네번째 인구 친 외막 기관 (PEO) 유래의 세포 외막으로 구성하고, 섬유 아세포, 평활근 세포 및 다른 잠재적 심장 세포 유형 (31)에 기여한다. 심장 외막 관상 혈관 발달 심장 성장 및 형태 형성 (21)을 조절한다.
심장 형태 형성에 대한 가장 중요한 개념은 심장 개발, 비정상적인 세포 마이그레이션하는 동안 / 네 개의 전구 세포 집단의 분화가 기형이나 선천성 심장 결함 기형아 출산의 번호를 하나의 원인은 세계에 4,22,32를 초래할 것입니다 . 세포 및 분자 수준에서 심장 형태 형성의 메커니즘을 결정하는 것은 CHDs에 대한 진단과 잠재적 치료 개선을 향한 필수적인 단계이다.따라서, 이미지를 단일 세포 해상도 전체 심장 수준 심장 형태 형성 과정 중요하다. 그것을 달성하기 위해, 우리는 구체적으로 mTmG 기자 라인, 심근 (18)로 표현된다 심장 특정 트로포 닌 T의 제어 (cTnT를)에서 Cre 호텔 선을 넘어하여 심근을 표시. E8.5의 배아는 수확 및 심근에서 심 내막 및 내피 세포를 구별하는 PECAM에 대한 염색 하였다. 배아는 무서 르 클리어하고, 마음은 몇 군데 있었다. 심근 인해 mTmG 기자의 cTnT를 기반 Cre 호텔 - 중재 재조합에 GFP로 표시하고, 그 내막은 PECAM (그림 1A 및 보충 영화 1)으로 표시 하였다. 심근 세포는 단일 세포 분석 (도 1a)에서 관찰 될 수있다. 이러한 원시적 인 뇌실과 OFT와 이미징 부분의 핵심 구조는 명확 3D 재를 사용하여 3 차원 복원 후 확인할 수 있습니다건설 소프트웨어 (그림 1B 및 보충 영화 2).
지워진 배아 마음의 단일 클론 이미징
심장 형태 형성은 전체 심장 수준 22 심장 계통 분화 개별 세포 조직에 의존하고, 따라서, 다른 심장 세포 유형 이미지 번의 심장 전구 세포의 분화에 필수적이고 단세포 해상도도 화상 세포 형태이다. 그것을 달성하기 위해, Rosa26Cre ERT2 (15)는 R26R - 색종이 (16)에 교차하고, 임신 여성은 낮은 농도에서 타목시펜과 gavaged했다. 48 시간 후, 배아는 E9.5에 수확하고, 전체를 PECAM에 대한 스테인드 마운트하고 온 마음을 이미지화했다. 우리는 OFT에 지역화, 세포의 하나의 클러스터가 있음을 발견하고,이 클론 8 셀 기반의 O를했다재구성 된 영상과 이들 세포가 단일 전구 세포로부터 유도 된 것을 나타내는 연속 섹션 (도 2A, 2B 및 보충 영화 3), N. 이러한 세포 증식 및 마이그레이션 등의 세포 형태와 세포의 동작은 세포 (그림 2A)의 궁극적 인 위치에서 유추 할 수있다. 우리는 또한 데이터가 표시되지 (E9.5과 E10.5에서 배아의 마음을 지우려면 CUBIC 방법을 적용, 심지어 시약 1 부화의 24 시간 후, 배아가 미묘하게 용해 것을 발견하고 조직 구조에 부정적인 영향을 받았다 ).
클리어 출생 후의 늦은 배아 마음의 영상
우리는 출생의 마음을 취소 무서 리터 전자와 CUBIC을 모두 적용했다. αMHC-Cre 호텔의 유전자형과 P2 마음; mTmG은 (αMHC-Cre 호텔은 특히 심근로 표현된다 <SUP> 17) 48 시간 동안 무서 리터 전자와 클리어했지만, 무서 리터 전자의 삭제가 출생 마음 유효하지 않습니다 것을 나타내는, PBS로 처리 한 마음 만 (데이터는 도시하지 않음)보다 더 많은 투명성을 표시하지 않았다. P2 마음은 48 시간, 96 시간 동안 시약 2 CUBIC 시약 1 클리어했을 때, 그들은 훨씬 더 투명 48 시간 동안 시약 (1) 48 시간 동안 시약 2 클리어 마음보다 있었다. 촬상 깊이 크게 CUBIC 시약 이상 배양 투명성을 촉진 촬상 깊이의 증가를 제공되었음을 나타내는 시약이 배양 96 시간 (보충 영화 4 및 5)로 증가 하였다. 각각 심근 세포의 형태 및 크기가 비대를 식별 할 수있는 멤브레인 지역화 GFP (도 3a)에 의해 식별 될 수있다.
Nf 개의와 연결 색종이 (색종이 여성, 우리는 또한 Nfatc1-Cre 호텔을 해제atc1Cre 남성) E17.5 마음 (Nfatc1-Cre 호텔은 48 시간, 48 시간 동안 시약 2 CUBIC 시약 1 심 내막 세포 19)로 표현된다. 마음은 투명하고, GFP, YFP, CFP 및 RFP를 포함하는 형광 단백질은 심 내막 세포와 그 유래 세포에 라벨을 예상했다; 그러나, GFP 및 YFP 전체 중심으로 묘화 될 수있다 (도 3B, 3C 및 보충 영화 6 및 7) 및 CFP 및 RFP 검출 할 수 없었다 (결과는 제시하지 않았다). PECAM의 염색 (알렉 시아 플 루어 647)도 CUBIC 시약은 CFP, RFP 및이 프로토콜의 항체 결합 형광을 소멸 것을 제안, (데이터는 도시하지 않음)를 검출 할 수 없습니다.
그림 1 :. 골목 / E는 배아의 마음을 지워 이미징 (A) 하나의 연산E8.75 심장 (cTnT를-Cre 호텔, mTmG)의 광 케이블 (optical) 슬라이스가 표시됩니다. V : 뇌실; OFT : 유출 관. (B)는 110.4 μm의 총 깊이 93 연속 광학 조각의 재구성 심장의 구조를 보여줍니다. A.에서 스케일 바 = 20 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 무서 / 전자의 단일 클론 이미징은 배아의 마음을 클리어 (A) ROSA26-Cre 호텔 ERT2의 유전자형을 가진 E9.5 마음에서 클론 중 하나는 광학 부와,. ROSA26 - 색종이. 심근의 세포 돌기에있는 화살표를 가리 킵니다. (B)는 10 광학 슬라이스와 36 μm의 총 깊이와 E9.5 마음의 OFT 지역에서 재구성 복제를 표시합니다. A.에서 스케일 바 = 20 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 그림 3 : CUBIC 삭제 출생 늦은 배아 마음 이미징 (A)는 αMHC-Cre 호텔의 유전자형과 P2의 마음을 하나의 광학 부분을 표시; mTmG을; ROSA26 - 색종이, 광학 모든 섹션이 보충 영화 5 (B)에 도시는 Nfatc1-Cre 호텔의 유전자형을 가진 E17.5 마음의 한 부분을 보여줍니다. (C)는 630 μm의 총 깊이 106 광학 조각에서 재구성 된 심장의 구조를 보여줍니다. 스케일 바는 = A에서 20 μm의 및 B. 100 μm의는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 보충 영화 1 : 무서 르 이미징 배아 마음을 삭제 (마우스 오른쪽 클릭하여 다운로드) , 심장 루멘에 심장 표면에서 영화 1 무서 르의 광 섹션 E8.75 심장 (mTmG cTnT를-Cre 호텔)을 치료 보여줍니다. 깊이는 110.4 μm의이며, 총 93 조각이있다.
보충 영화 2 :. 무서 르 이미징 배아 마음을 삭제 (마우스 오른쪽 클릭하여 다운로드) 영화 (2) 영화 (1)에서 재구성 된 심장의 3 차원 표면 사진을 보여주고, reconstruc3 차원 재구성 소프트웨어를 통해 테드. 노란색 마크 PECAM의 발현과 녹색 레이블 모든 심근.
보충 영화 3 : 무서 르의 단일 클론 이미징은 배아의 마음을 클리어 (오른쪽 다운로드 클릭). 영화 3 ROSA26-Cre 호텔 ERT2의 유전자형을 가진 E9.5 마음에서 클론의 섹션을 보여줍니다.
보충 영화 4 :. 입방 클리어 출생의 마음을 이미징하는 (오른쪽 다운로드 클릭) 영화 (4)는 CUBIC 처리 P2 마음의 섹션을 보여줍니다 (& #945; 심장 루멘에 심장 표면에서 mTmG) MHC-Cre 호텔. 이 P2의 심장은 48 시간 동안 CUBIC 시약 일, 96 시간 동안 CUBIC 시약 2 지워졌습니다.
보충 영화 5 :. 입방 클리어 출생의 마음을 이미징 (오른쪽 다운로드 클릭) 영화 (5)는 48 시간, 48 시간 동안 2 CUBIC 시약 1 CUBIC 시약으로 허가 된 마음을 보여줍니다. 깊이는 영화 4 섹션 당 6 μm의 136 μm의이며, 두께는 영화 5 섹션 당 6 μm의 76 μm의입니다.
보충 영화 6 : CUBIC 삭제 늦은 엠브리 이미징. 심장 루멘에 심장 표면에서, onic 심장 영화 6은 CUBIC 처리 E17.5 마음 (ROSA26-색종이 Nfatc1-Cre 호텔)의 부분을 보여줍니다 (오른쪽 다운로드 클릭). 깊이 6㎛의 부 당 630 μm의 것이다.
보충 영화 7 : 입방 삭제 늦은 배아 심장 이미징 (오른쪽 다운로드 클릭). 영화 7은 3D 재구성 소프트웨어를 통해 재구성 된 영화 6 심장의 3 차원 표면 사진을 보여줍니다.
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Discussion
배아 분리는 매우 중요한 단계입니다. E9.5의 배아 때문에 각별한주의가 분리 동안 배아 / 심장 구조 손상되지 않도록주의해야한다, 크기가 매우 깨지기 쉬운 작은 있습니다. 전체 배아를 이미징 할 때 배아 / 마음을 포위 비 배아 여분의 층은 신중하게, 특히 제거해야합니다. 이 배아 조직 내부에 깊은 항체 및 청산 혼합물의 침투를 허용하고, 또한 이미징 때 배경 신호를 제거하는 데 도움이됩니다. PECAM에 대한 항체, 아세틸 화 α-튜 불린과 인테그린 β1 등 다양한 항체를 검사하고, 모든 성공적으로 33 (데이터는 도시하지 않음) 검출되었다. 이 분자의 무결성은 무결성 세포 항원 호환성이 소거 과정에서 교란되지 않았 음을 보여준다.
넓은 입 전송 피펫 (팁을 절단)를 사용하여 배아 / 마음을 전송합니다. 이 취급 중에 손상을 방지 할 수 있습니다. GFP / YFP / RFP / CFP 발현 패턴 및 n-클론의 암갈색 신중하게 한 마음에 따라 복제하거나 다른 기관에 레이블을 적절한 투여 량을 결정하기 위해 마음에 기록되어야한다. 때문에 타목시펜 (10 μg의 / g)의 낮은 복용량에, 때로는 마음은 클론을 포함하거나 클론을 감지하기가 어렵하지 않습니다. 따라서, 배아는 어떤 GFP / YFP / RFP / CFP 클론이 있는지 확인 난황을 사용하는 것이 좋습니다.
배아 또는 심장 고정은 오버 고정 밑에 고정 불량 염색 발생합니다 동안 높은 백그라운드에서 발생합니다 같은 중요한 단계입니다. 접시 통에 실온에서 2 시간의 E8.5-E10.5 전체 배아를 해결하는 것이 좋습니다. E11.5-E15.5 배아에 대한 있지만, 권장 사항은 조심스럽게 마음을 분리하고 실온에서 2 시간 동안 4 % PFA로 문제를 해결하는 것입니다. 전체 배아를 처리하는 경우에 심장을 둘러싸고있는 레이어를 제거 확인한 후 E11.5- E13.5 배아는 실온에서 3 ~ 4 시간 동안 고정 할 수 있지만 그 증가 된 조직 지우기 시간이 필요합니다. E16.5-P1 (출생1 일) 마음 접시 통에 실온에서 3-4 시간 동안 고정되어 있습니다. 전체 배아를 고정 할 때 심장 이미징을 방해으로, 전면 및 뒷다리를 제거해야합니다.
샘플은 샘플의 건조를 최소화 섬광 바이알 르 CUBIC 무서 및 처리되어야한다. 무서 제작 청산 최적 4 ° C에서 수행하는 동안 우리는 37 ° C에서 CUBIC 조직 청소 방법과 샘플의 더 나은 청소를 관찰했다. 촬상 후, 샘플 2 또는 CUBIC 무서 르 70 단기 저장 될 수있다. 샘플은 항상 형광 표백을 방지하기 위해 알루미늄 포일로 피복되어야한다.
배아 조직 및 기관 적은 소거 시간을 초래 이하 지질 및 세포 외 기질 침착을 갖는다. 한편, 이들은 소거 시약에 더 취약하다. 지우기 시약 CFP, RFP 및 항체 conju의 소광 결과, 조직 구조 및 항원의 무결성에 영향을 미칠 수도문이 형광. 따라서, 더 이상 고정 시간은 담금질을 방지 할 수 있습니다. 이전 34보고 된 형광 단백질의 담금질은 또한 화학 물질에 대한 민감도와 산도로 인해 수 있습니다. 화학 레시피, 산도, 고정 제, 배양 길이 형광 단백질의 담금질을 최소화하기 위해 탐색되어야한다.
전체 기관 transparentizing 또는 조직의 정화 방법은 부피 3D 영상 혁명을하고있다. 직렬 섹션 수동 2D 또는 3D 재구성을 포함 심장 형태 형성에 대한 이전 영상 법은 시간이 많이 걸리고 악기 5,6- 요구된다. 3D 모델링과 함께 고해상도 episcopic 현미경 (HREM)는 마우스 심장의 형태 형성의 연구에 적용되고, 현상 마우스 배아 (35)의 해면골 아키텍처 우수한 해부학 적 설명을 제공 할 수있다. 그러나 HREM는 fluoresc의 식별을 허용하지 않습니다엔트 단백질 표지 셀 또는 셀 (35)의 나머지 부분에서 항체 염색 된 세포. 최소한의 노력과 높은 비용 효율성과 현재의 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 무서 제작 또는 CUBIC 조직 청산 방법 (- 3 그림 1)를 사용하여 배아 마음에 형광 신호를 보존하고있다. Cre 호텔의 재조합을 유도하고 전체 배아 내부와 마음에 몇 클론을 생성하는 타목시펜의 저용량과 결합 (10 μg의 / g)을,이 시스템은 추적하고 하나의 심장 전구 세포 분화에서 세포 행동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다 생체 내 (그림 2A) 33. 또한, Cre 호텔 매개 유전자 결실 또는 과발현 Cre 호텔 매개 단일 세포 표지와 결합이 이미징 시스템은 심장 형태 형성시 함수 또는 전구 세포 분화 및 세포 행동 함수의 이득의 유전 손실을 연구에 적용함으로써 강력한를 제공 할 수있다 일에 도구선천성 심장 결함의 원인을 udy.
본 연구에 사용 된 두 조직 클리어 시스템 무서 / E 및 CUBIC 더 배아 연령, 조직 및 조직 두께 클리어 시간의 기간에 기초하여 상기 시스템을 구별하는 다른 소거 효율을 나타내었다. 초기 단계의 배아의 E9.5-E10.5를 들어, 무서 / 전자 시스템은 명확한 조직을 렌더링뿐만 아니라,하지만 CUBIC 치료는 배아 용해 결과 동안 또한, 형광 신호를 배아 형태를 보호하고 보존. 이 추가 아미노 알콜의 결과와 CUBIC 솔루션 8 트리톤 X-100의 높은 농도 될 수 있습니다. 나이가 마음에 들어, 무서 / 전자 시스템은 심지어 더 이상 배양 시간에 완전히 조직을 취소하지 못했습니다. 입방 청산 솔루션은 기존의 조직 클리어 (그림 3) 렌더링합니다. 그러나 증가 배양 시간은, 약한 신호 만 보호 내생 GFP 결과 동안 RFP, CFP 및 항체 결합 신호분실되었다. 이 때문에, 소거 시약 더 배양 시간의 더욱 최적화 된 레시피는 형광 라벨의 큰 스펙트럼 화상 하트 또는 장기 용적해야 할 것이다.
이 연구는 하나가 개발 마음의 내피 / 심 내막 세포 마커 PECAM의 전체 마운트 얼룩과 함께, 추적 라벨 및 이미지 하나의 심장 클론 수 있음을 보여 주었다. 이 시스템을 PECAM 및 DAPI 전체 산 얼룩뿐만 아니라 심장 내부 표지 세포의 세포 형태 및 세포 형태를 식별하는 데 도움이 아니라 심장 형태 발생 동안 클론 패턴, 이동 행동을 연구 할 수있다. 도 2a에서 우리는 OFT 8 세포와 복제를 관찰했다. 표지 시간을 참조하여이 클론 본 셀의 수를 이용하여, 세포 증식 속도는 쉽게 계산 될 수있다. 이와 같은 시스템을 이용하여 또 다른 연구에서는 세포 배향 분할 패턴 및 마이그레이션 백분율을 식별trabeculation 과정 (33) 중 하나의 심근의 ATION 패턴입니다. 시공간 표지 심장 전구 세포의 분화에 대한 함수 또는 함수의 이득의 유전 손실의 효과를 연구하기 위해 이러한 프로토콜의 애플리케이션이 클론 패턴 및 셀룰러 동작이 가능하고, 유전자에 선천성 심장 결함의 원인에 대한 연구에 도움이되며 3 차원 맥락에서 분자 수준. 또한,이 프로토콜은 다른 기관계의 형태 형성의 연구에 적용 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
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