Abstract
ex vivoでの養子移入は、転移性黒色腫を有する患者のかなりの部分集合で、耐久性と完全な応答を媒介することができる自己腫瘍浸潤リンパ球（TILを）を拡大しました。このアプローチの主要な障害は、テロメアの短縮に起因する転送T細胞の減少生存率であり、のTILの限られた数の患者から得られました。長いテロメアを有するあまり分化T細胞は、養子T細胞療法のための理想的なT細胞のサブセットであろうが、これらのあまり分化T細胞を大量に生成することは問題があります。この養子T細胞療法の制限理論的にその自己複製人工多能性幹細胞（iPS細胞）を使用することによって克服することができる、多能性を維持するためには、テロメアの伸長、および免疫療法のための自己T細胞の無制限の供給源を提供しています。ここで、我々はのTILへの再プログラミング因子の伝達にセンダイウイルスベクターを用いてiPS細胞を生成するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、生成します完全に再プログラム、ベクトルフリーのクローンです。これらのTIL由来のiPS細胞は養子T細胞療法のためのあまり分化patient-および腫瘍特異的T細胞を生成することができるかもしれません。
Introduction
転写因子の定義されたセットの過剰発現を介して人工多能性幹細胞（iPS細胞）の生成を可能にする細胞再プログラミング技術は、細胞ベースの治療法1,2の分野において非常に有望です。これらのiPS細胞は、転写およびエピジェネティックな特徴を示すと同様に、胚性幹細胞（ESC）3-5の自己再生および多能性の能力を有します。過去10年間にリプログラミング技術で作られた著しい進歩は、私たちはあっても、このようなT細胞6-8のような分化細胞からヒトiPS細胞を生成することができました。 T細胞由来のiPS細胞（TiPSCs）はTiPSCs 9-11からの抗原特異的T細胞の再生を可能にする、元のT細胞などのT細胞受容体（TCR）鎖遺伝子の再配列と同じ構成を保持します。
患者の腫瘍から得られた黒色腫浸潤リンパ球（TILを）のほぼ80％は、具体的には、A、腫瘍関連抗原を認識するNDオリジナルの癌細胞12に対する細胞傷害性を維持します。注目すべきこと、のTILのプログラム細胞死タンパク質1（PD-1）の発現は、突然変異した新生抗原特異的CD8 +リンパ球13を含む自己腫瘍反応性レパートリーを同定することが見出されました。取リンパ球枯渇レジメンおよびインターロイキン2（IL-2）の全身投与と組み合わせてex vivoで拡大した自己のTILの養子移入は、患者14のサブセットに転移性メラノーマの実質的な後退を引き起こす可能性があります。前臨床モデルおよび患者に結果を励みにもかかわらず、貧しい注入されたT細胞の生存および免疫抑制経路の存在は、養子T細胞療法の可能性を最大限に妥協するように見えます。現在の臨床プロトコルは、多数を得るために、自己T細胞の大規模なex vivoでの操作を必要とします。これは、悪い生存率を有する最終分化T細胞の生成をもたらす、減少proliferative容量、およびPD-1 15の高レベル。
養子T細胞療法のこの制限は、理論的には、免疫療法のための自己T細胞の無制限の供給源を提供することができるiPS細胞を使用することによって克服することができます。我々は最近、センダイウイルス（SeVを）4転写因子の媒介形質導入、OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC 16によるPD-1の高レベルで発現メラノーマのTILの再プログラミングを報告しています。レトロウイルスベクターは、再プログラミング遺伝子を発現するために宿主染色体への統合を必要とするが、センダイウイルスベクターは、非組み込みがあり、最終的に細胞質から排除されています。リプログラミング効率がレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを6-8と比較したSeVシステムとはるかに高いです。レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターにより生成されるいくつかのIPSCのクローンは非リンパ系系列6-8由来することができるしながらさらに、センダイウイルスは、具体的には、末梢血単核細胞（PBMC）中のT細胞を再プログラムすることができます。ここでは、詳細手順は、ヒトメラノーマのTILの単離および活性化のためにとのSeVの再プログラミング・システムを使用してTIL由来のiPS細胞の生成のために実装されています。
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Protocol
注：患者は、治験審査委員会に参加するためにインフォームドコンセントを与えるべきであり、ヒト多能性幹細胞の委員会は、研究を承認しました。
1.単離とのTILの文化
- 病理サービス/組織の調達コアからの病理組織学的診断のために必要とされない腫瘍材料を入手します。メディアを収集する30ミリリットルの腫瘍（ 表1）を用いて50 mlチューブに腫瘍標本の20〜100グラムを置きます。
- 固体、しっかりと、はさみを使用して、脆弱および/または血の壊死領域からの腫瘍標本の正常組織を解剖。壊死組織を除去した後、可能な限り小さく、試料をミンチするはさみを使用してください。
- 製造者の指示に従って解離および腫瘍解離キット（ヒト）を使用して単一細胞懸濁液に刻んだ試料を解離させます。 50ミリリットルチューブに設定されている70μmのセルストレーナーでサスペンションを濾過して、ストレーナを2回洗浄RPMI1640培地2mlの。
- 5分間、室温で200×gで遠心分離します。上清を捨て、T細胞培地（ 表1）の10ミリリットル中に細胞を懸濁します。
- 100％勾配液及びダルベッコのリン酸で希釈した75％の勾配溶液30mlの中間ステップを10mlの下段で、50 mlチューブにかかるフィコール（勾配液）としての2段階勾配液を調製緩衝生理食塩水、無カルシウム、無マグネシウム（D-PBS（ - ））。
- （ステップ1.5）の勾配溶液に（工程1.4からの）細胞懸濁液レイヤ。 45分間20℃で400×gで遠心分離します。
- 100％勾配溶液、50 mlチューブ75％勾配液との界面に濃縮されたのTILを含む層を集め。 （ - ）D-PBS 20〜30 mlで添加することによって富化のTILの溶液の層を希釈します。
- 5分間、室温で200×gで遠心分離します。上清を捨て、10mlのTIL濃縮画分を再懸濁T細胞メディア。
- 37℃、5％CO 2で6ウェルプレート中のT細胞培地を2ml 6,000 IU / mlの組換えヒト（RH）IL-2との培養（工程1.8からの）画分。
- 培養開始後5日目に半分メディアを変更し、その後2〜3日ごと。
- 80〜90％コンフルエントに達したとき、ウェルの数を2倍、そっと懸濁した後、トリプシン処理することなく、2：1の割合で細胞を分割します。 6000 IU / mlで新鮮なT細胞培地とのrhIL-2の半分の体積（1ミリリットル）を追加します。
マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞プレートの調製
- 0.1％ゼラチンでコーティングした10cmディッシュ上のSNLフィーダー細胞培地（ 表1）10ml中の培養SNLフィーダー細胞を80〜90％コンフルエンス（3-4×10 6細胞）に到達するまで。
- 直接SNLフィーダー細胞培養皿に0.4 mg / mlでマイトマイシンC溶液310μLを加え、37℃で2時間15分間、5％CO 2でインキュベートします。メディアAを吸引（ - ）ND 5ミリリットルのD-PBSで2回細胞を洗浄します。
- 0.5ミリリットル0.25％のトリプシン/ 1mMのEDTAを添加し、細胞を解離するために1分間室温でインキュベートします。単一の懸濁液に細胞を中和し、再懸濁するためにSNLフィーダー細胞培地の4.5ミリリットルを追加します。
- 5分間、200×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機に細胞を移します。メディアを吸引し、SNLフィーダー細胞培地10mlに再懸濁した後、血球計算板を用いて細胞を数えます。
- プレート10cmディッシュ上のSNLフィーダー細胞のウェル当たり1.5×10 6細胞を、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 3日以内のSNLフィーダー細胞を使用してください。
センダイウイルス（SeVの）ベクトルを用いたiPS細胞の3世代
- （ステップ1.11から）のTILを収穫し、プレート結合マウス抗ヒトCD3（1μg/ ml）および可溶性マウス抗ヒトCD28（5μg/ ml）でのTILの5×10 5細胞を活性化し、のrhIL-2と3で6ウェルプレート中のT細胞培地2ml中（6,000 IU / ml）を7℃で、5日間、5％CO 2。
- ピペットを用いて15mlチューブ（ステップ3.1）からのTILを採取し、血球計で細胞数を数えます。
- 500μlの中のrhIL-2（60 IU / ml）で、プレートに結合したマウス抗ヒトCD3（1μg/ mlの）および可溶性マウス抗ヒトCD28（5μg/ ml）でのTILの1×10 5個の細胞を再活性化37℃で24ウェルプレート中のウェルあたり再プログラム培地（ 表1）、24時間、5％CO 2の。センダイウイルス感染のための3つのウェルを準備します。OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC（1ウェル）。センダイウイルス感染（GFP：緑色蛍光タンパク質）（1ウェル）。細胞数（1ウェル）。
- （ステップ3.3から）24時間後、血球計数器を用いて細胞数をカウントし、感染症の様々な（3-20）多重度（MOI）のために各ウイルスの量を決定します。 -80℃ストレージからセンダイウイルスベクター管の1セットを削除してください。水浴（37℃）で急速センダイウイルスベクターを解凍し、氷の上に置きます。
ウイルスの容量（μL）ウイルスの細胞/力価（CIU / ml）を×10-3（μL/ ml）を= MOI（CIU /セル）x個 - 活性化のTILを含む培地中に10〜20 MOIでセンダイウイルスベクターの混合物を添加することにより、個別にOCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYCを担持4センダイウイルスベクターチューブのそれぞれの計算されたボリュームを追加します。
- 形質導入効率を決定するために、活性化したのTILのウェルにのSeV-GFPの計算されたボリュームを追加します。
- 24時間、37℃、5％CO 2のインキュベーター内（ステップ3.5およびステップ3.6から）の皿を置きます。 24時間後、蛍光顕微鏡下でのSeV-GFPに感染したTILを使用して、感染効率を推定します。
- 15ミリリットルチューブに（ステップ3.5から）の細胞を収集します。 5分間、室温で200×gで遠心分離します。
- 上清を捨て、霊長類ES細胞用培地および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、4 ngの/ ml）でのhESC培地0.5mlにペレットを再懸濁。
- コンタ10cmの皿にサスペンションを移しインのhESC培地10mlにSNLフィーダー細胞をマイトマイシンCで処理しました。コロニーが成長するまで一日おきのhESCのメディアを変更します。
- 18〜21日頃、クリーンベンチ内で10μlのチップを用いて、顕微鏡下でコロニーの周りのSNLフィーダー細胞を除去します。
- 10μlのチップを用いてコロニーを掻き取り、96ウェル組織培養プレートのウェルあたりiPS細胞培地100μlの中に200μlのチップを使用して転送します。 2-3時間で上下ピペット50から100ミクロンの平均サイズが小さな塊にコロニーを破壊します。
- 塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF、4 NG / ml）を用いてiPS細胞培地のウェルあたり2ml中の（工程2から）マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞を6ウェル組織培養プレートに小塊を移します。毎日iPS細胞のメディアを変更します。
- すべての5-6日に1mg / mlのコラゲナーゼIVで新鮮マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞を6ウェル組織培養プレートにiPS細胞を移します。 IMMUNのために各クローンのプレート当たり2つのウェルを準備ostaining。
- 多能性マーカー（SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、およびOCT3 / 4）1の免疫組織化学染色により各クローンの完全な再プログラミングを決定します。
注：多能性の可能性をさらに評価するために、完全に再プログラムIPSCラインが胚様体形成および分化アッセイまたはテラトーマ形成アッセイ16により三胚葉に分化することができることを確認します。 - 完全に再プログラムIPSCラインは細胞遺伝学的解析により、正常な核型を示すことを確認してください。
- テラトーマ形成のために、6〜8週齢の雌NOD / SCIDマウスの皮下組織に10％FCSを含むDMEM100μl中の未分化TIL由来のIPSC（1×10 6）の懸濁液を注入します。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色奇形腫セクション。
SSEA3、SSEA4、TRA1-60およびTRA1-81のためのiPS細胞の4.免疫蛍光染色
- 1 mlのPBSと4％のPAの1ミリリットルでiPS細胞を固定で洗浄性IPSC10分間raformaldehydeソリューション。 4％パラホルムアルデヒド溶液を除去し、1mlのPBSで3回iPS細胞を洗います。
注：パラホルムアルデヒドを使用しているとき、それは毒性があるので注意してください。 - 30分間緩衝液（ 表1）を遮断してiPS細胞を前処理。一方、PBSおよびトリトンで希釈した一次抗体（ラット抗ヒトSSEA3、マウス抗ヒトSSEA4、マウス抗ヒトTRA1-60、およびマウス抗ヒトTRA1-81）1時50分1.5％ヤギ血清溶液を希釈-100（総容量：1ミリリットル）。
- ブロッキングバッファー（ 表1）を取り外します。希釈した一次抗体溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。一方、1.5％ヤギ血清溶液中で二次抗体（抗マウスIgGおよびIgMまたは抗ラットIgM抗体）1:50に希釈します。
- 希釈した一次抗体溶液を除去し、1mlのPBSで3回、5分間ごとにiPS細胞を洗います。希釈された二次抗体溶液を添加し、暗室において室温で45分間インキュベートします。 希釈した二次抗体溶液を除去し、1mlのPBSで3回、5分間ごとにiPS細胞を洗います。免疫蛍光顕微鏡を用いてiPS細胞を観察します。
Oct3 / 4用のiPS細胞の5.免疫蛍光染色
- 1 mlのPBSと10分間、4％パラホルムアルデヒド溶液の1mlでiPS細胞を固定と洗浄性IPSC。 4％パラホルムアルデヒド溶液を除去し、PBSで3回iPS細胞を洗います。
- 透過化緩衝液（ 表1）を加え、室温で10分間インキュベートします。透過化緩衝液を除去し、緩衝液（ 表1）をブロックに追加します。
- 室温で30分間インキュベートします。一方、ブロッキング緩衝液中で一次抗体（マウス抗ヒトのOct3 / 4）1:50に希釈します。
- 希釈した一次抗体溶液を加え、4℃で一晩インキュベートします。
- 希釈した一次抗体溶液を除去し、5分間、PBSの1ミリリットルで3回、それぞれのiPS細胞を洗います。一方、ディブロッキング緩衝液で100：二次抗体（ヤギ抗マウスIgG / IgM抗体）1リュート。
- 希釈された二次抗体溶液を添加し、45分間、暗室において室温でインキュベートします。
- 希釈した二次溶液を除去し、1mlのPBSで3回、5分間ごとにiPS細胞を洗います。免疫蛍光顕微鏡下でiPS細胞を観察します。
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Representative Results
図1は、抗CD3 / CD28による活性化とのTILにOCT3 / 4、KLF4、SOX2、およびc-MYCの遺伝子導入が続いているのrhIL-2と黒色腫のTILの初期膨張を伴う手順の概要を示していますiPS細胞の生成のため。通常、のrhIL-2開始と文化についてのTILは21-28日間培養開始後に球を形成しました。この時点で、のTILは、抗CD3 / CD28で活性化される準備ができていること、21日目のrhIL-2と文化を、。 図2AはのTILを示している抗CD3 / CD28で活性化される準備ができている。 図2Bは、GFPの導入を示しています20でトランスフェクトされたセンダイウイルス（SeVを）によってMOI。 図2Cは、18-21日のSeV感染後に表示されるのSNLフィーダー細胞上の典型的な多能性クローンを示している。 図2Dは、生成されたTIL由来のiPS細胞は、正常な核型を持っていることを示している。図3図免疫蛍光染色は、pを確認するために、性IPSC（SSEA3、SSEA4、TRA1-81、TRA1-60、及びOCT3 / 4）にluripotencyマーカー発現。 図4は、黒色腫のTIL由来iPS細胞は、3胚葉（神経からの種々の細胞が含まれている奇形腫を形成することができることを示しています組織、気道上皮、および軟骨）。TIL由来のiPS細胞は、TCR再配列を保持して生成された図5に示す図 。
図1： メラノーマのTILからのiPS細胞の生成の概略プロトコルは三つの段階が含ま：分離と文化のTILのIL-2と、抗CD3 / CD28とT細胞の活性化、およびセンダイウイルス（SeVを）を用いて細胞の再プログラミングをベクトル符号化OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：彼らは培養開始後2-3週間を展開するメラノーマのTILからのiPS細胞の作製 （A）のrhIL-2でのTILの形態を表す画像を開始しました。 （B）のSeV感染後のTIL 1日の形態およびGFPの発現を表す画像。 （C）のSeV感染後21日目に、典型的なESCのようなIPSCコロニー。 =200μmのスケールバー。 （D）、黒色腫のTIL由来iPS細胞の1から20のG-バンド化中期細胞上の細胞遺伝学的分析。図（D）は、斉藤ら 16から適合されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図3：幹細胞の多能性マーカーと免疫蛍光染色免疫蛍光アッセイは、2人の患者からのTIL由来のiPS細胞は、SSEA3、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60、およびOCT3 / 4について陽性であることを示しています。スケールバー= 100μm.Theの図は斎藤ら 16から適合されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：（NOD / SCIDマウスへの6週間後注射）TIL由来のiPS細胞クローン由来奇形腫形成ヘマトキシリンとiPS細胞およびエオシン染色した代表的な奇形腫のセクションのための多能性の確認が表示されます。斎藤ら 16から適応図。.COM /ファイル/ ftp_upload / 54375 / 54375fig4large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：TIL-iPS 細胞におけるTCR-β遺伝子の配列パターンの多種多様な TIL-iPS細胞におけるTCR-β遺伝子再編成は、キャピラリー電気泳動によって識別されます。緑のラインはJβ1遺伝子のためのバンドから導出され、青のラインがJβ2遺伝子のためのバンドから導き出されます。図は斎藤ら 16から適合されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1：T細胞のための作曲、再プログラミング、トンumor SNLフィーダー細胞、およびIPSCメディア、および透過性及びブロッキングバッファーは、収集。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYCは、4つの転写のセンダイウイルス媒介形質導入によりiPS細胞に黒色腫のTILを再プログラミングするためのプロトコルを要因を明らかにしました。このアプローチは、T細胞を再プログラムするためのSeVシステムを使用して、非組込み方法7の利点を提供します。
以前の研究では、センダイウイルスの再プログラミング・システムは、線維芽細胞だけでなく、末梢血T細胞7,17のみならずを再プログラムするために高効率で信頼性の高いことが示されました。また、我々は最近、より分化しており、末梢血T細胞は、センダイウイルスベクター16を使用して再プログラムすることができるよりも、例えば、PD-1のような阻害性受容体の高いレベルを発現するメラノーマのTILを示しています。センダイウイルスベクターを用いた抗CD3 / CD28による刺激や感染のタイミングが再プログラミングのTILで重要でした。末梢血T細胞を被験者7、whilから収穫後直ちに再プログラミングのために抗CD3およびIL-2で刺激することができEののTILは、刺激の前にIL-2で3〜4週間培養する必要があります。
TILの99％以上は、抗CD3 / CD28 16とIL-2および活性化と文化の3-4週間後にCD8 T細胞であったが、私たちは、性IPSCはのTIL（ 図からある発生したことを確認するために、iPS細胞にTCR再配列の解析をお勧めします5）。注目すべきことに、我々を含む以前の研究は、すべてのiPS細胞は、末梢血単核細胞からのSeVを用いて生成されたかのTILは、TCR再配列7,16を有することを示しました。
メラノーマのTILからのiPS細胞の生成が可能であったが、我々は黒色腫のTILの再プログラミング効率は、末梢血T細胞（0.1％）7よりも16（0.01〜0.05％）より低かったことを見出しました。この理由は不明のままであるが、それは抑制性受容体の高い発現またはTILを13,16で分化したT細胞サブセットの大きい番号に関連付けられている可能性があります。最近の重要な進展リプログラミング技術のためTIL-iPS細胞の生成のための初期化の効率を向上させることができます。第二世代SeVベクター、TS12KOSは、以前の研究18,19で使用される従来のSeVベクターよりIPSC世代の高効率を有することが判明しました。
センダイウイルスの再プログラミングシステムによるヒトiPS細胞の導出が可能であるが、このプロトコルで考慮すべきいくつかの制限があります。私たちは、このプロトコルでSeVの感染の間にウシ胎児血清を使用します。私たちは、のTILの同様の増殖にもかかわらず、ウシ胎児血清を有するものと比較したSeV感染の間にヒト血清を含む培地を使用している場合は、黒色腫のTILの再プログラミング効率が有意に低いことがわかりました。また、IPSCの生成と維持のために、マウスフィーダー層を使用しますが、定義された無フィーダーと異種非含有システムは、将来の研究における代替方法であるとしてもよいです。
iPS細胞を生成するために、腫瘍の収穫の時から2ヶ月の周りにそれを取りますメラノーマのTILから。また、導入遺伝子を含まないiPS細胞を得るために、さらに1〜2ヶ月かかるだろう。これは、より効率的なウイルス除去率19を示しているSeVベクター、TS12KOS、新しいタイプを使用することによって短縮される場合があります。
結論として、メラノーマのTIL由来のヒトiPS細胞の生成が可能です。現在のプロトコルは、養子T細胞療法のための腫瘍特異的T細胞の無限の数を生成するための重要なステップであるかもしれません。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 |
References
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