Introduction
Ближнее (тандем) альтернативный сплайсинг, где альтернативные акцепторные или донорные участки находятся в непосредственной близости друг от друга, часто встречается у млекопитающих, беспозвоночных 1 2 и 3 растения. Подсчитано , что 20% генов млекопитающих содержат альтернативные сайты сплайсинга 2-12 нуклеотидов друг от друга 4. Многие из этих сайтов 3 нуклеотидов друг от друга и приводят к включению или исключению одного кодона. Существует дискуссия о характере регуляции сплайсинга в этих местах 5,6 с некоторыми утверждая , что различия сплайсинга мотив настолько тонки , что выбор является стохастической 7, в то время как другие сделать вывод , регулирование на основе тканевой специфичности 8.
Тандем выбор сайтов сплайсинга был проанализирован полуколичественно с использованием модифицированного капиллярного электрофореза 7 и гель - электрофореза с высоким разрешением 8. РНК-Seq (РНК секвенирования) считывает может быть использован для количественного определения коэффициентов сплайсинга на каждом сращиваниясайт. Таким образом, РНК-Seq данные дали представление о регулировании тандем сайтов сплайсинга 9. Он также позволил предсказать ожидаемые коэффициенты варианта сплайсинга на основе нуклеотидной мотива 10. Большинство акцент на сплайсинга, который включает или не включает один кодон на наиболее часто встречающихся сайтов сплайсинга тандем акцепторных, известный как NAGNAGs (где N = любой нуклеотид).
Тандем-доноров альтернативные сайты сплайсинга включая или исключая одну кодон (GYNGYN распознавания мотив, где Y = пиримидин) менее распространены, чем тандем акцепторов. Преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3 (STAT3) является одним из ключевых генов претерпевает донорскую тандем альтернативный сплайсинг 1,11. Сайты доноров тандем сплайсинга присоединиться к экзонов 21 и 22 и привести к включению или исключению кодона для серина-701 (S или & Dgr ; S соответственно) 1,11. Downstream альтернативные сайты акцепторные (40 нуклеотидов друг от друга), соединяющего экзоны 22 и23A / результат б во включении либо 55 концевых остатков домена трансактивации (а) или усеченной домен трансактивации с 7 уникальных С-концевых остатков (& beta ; ) 11. Таким образом, четыре варианта сплайсинга возможны.
STAT3 белка является фактором транскрипции и основным интегратором сигнала во многих типах клеток 12 и когда мутировал его конститутивной активации способствует несколько фенотипов рака (обзор в ссылке 13). Синдром Иова, расстройство характеризуется иммунодефицит высоким уровнем IgE, также вызывается мутациями в STAT3 (обзор в ссылке 14). Четкие роли для STAT3 а и β сплайсинга вариантов белков были описаны ранее 15. Первоначально STAT3 β считалось действовать в доминантно-негативной манере 16, антагонистического транскрипционную активность STAT3 альфа, но последующие работы предполагают , что это имеет независимые гены - мишени 17 18), но недавнее исследование показало, что STAT3 S и & Dgr ; S варианты сплайсинга являются необходимыми для жизнеспособности STAT3-зависимым диффузной B - клеточную лимфому (DLBLCL) 19 клетки. Биологическая значимость еще предстоит изучить. Учитывая, что сращивание вариант композиции может влиять на функцию, мы пытались обнаружить, был ли отношение возмущенные цитокина стимуляции эозинофилов.
Первоначально мы пытались исследовать связь между этими двумя сплайсинга событий с использованием ПЦР , специфичных к STAT3 а и вариантов β сплайсинга, с последующим отщеплением продуктов рестриктазой специфичным для вариантов S сплайсинга, AfeI. Денситометрия продуктов реакции показал включение Ser701 был гв десять раз тельно чаще , чем ее отсутствие (& Dgr ; S) в обоих STAT3 а и р (данные не показаны). Тем не менее, этот полуколичественный подход не был достаточно воспроизводимой, и не может быть эффективно использована для измерения всех четырех вариантов сплайсинга одновременно. Для анализа пропорции каждого из четырех вариантов сплайсинга, это было необходимо установить количественный ПЦР (КПЦР) протокол, поддались жесткие технические (несколько анализы данного образца) размножается.
Относительная КПЦР опирается на сравнение представляющего интерес гена к стандартной или домашнего хозяйства известный ген экспрессируется на определенном уровне 20 и подходит , когда представляющий интерес ген и ген домашнего хозяйства, усиливаются с одинаковой эффективностью. Двухцепочечной (DS) ДНК-связывающий флуоресцентный (цианин) красителем связывается с ПЦР - ампликонов 21, и после определенного количества циклов, достаточное усиление имеет место для флуоресценции , чтобы быть обнаружены. Чем выше начальный уровеньтранскрипта, тем ниже порогового цикла значение (Ct). Поскольку концентрация препаратов кДНК отличается, нужно сравнить концентрацию транскрипта с концентрацией стенограмме как известно, экспрессируются на постоянном уровне во всех образцах, как глюциронидазу-бета (GUSB) в эозинофилов 22.
Относительная КПЦР не представляется возможным для очень сходных последовательностей, как это видно в сплайс результате тандем сплайсинга. Строгие условия, необходимые для специфически амплифицировать варианты сплайсинга приводит к снижению эффективности. Вместо абсолютного Количественное необходимо использовать 23. Это влечет за собой подготовку стандартную кривую с известными концентрациями сращивания стенограмме интерес, и обеспечение условий ПЦР оптимизировать специфичность 24. Как было описано, абсолютные и относительные данные КПЦР для конкретного гена, могут быть объединены, чтобы сообщить понимание экспрессии гена этого в определенном типе клеток, вэтот случай STAT3 в по- разному стимулированных эозинофилов 25.
Здесь STAT3 сплайсинга вариант Количественное описывается с ожиданием , что этот метод может быть адаптирован к целевым исследованиям других тандем сплайсинга событий. Оптимизация представляет собой длительный процесс, в котором несколько пар праймеров в различных концентрациях и многочисленных итераций параметров велосипедного были протестированы в течение нескольких месяцев. Ключевыми особенностями протокола являются праймер специфичность проверки и количественное определение на основе стандартных кривых с известными концентрациями вариантов сплайсинга. Относительная КПЦР в сочетании оказались полезными для нашего приложения, но не является необходимым.
Protocol
Примечание: Периферийные эозинофилы крови были получены без указания информации в соответствии с протоколом, утвержденном (# 2013-1570) Университетом Висконсин-Мэдисон Центра Совета медицинских наук Institutional Review. Подписано информированное согласие от донора было получено для использования каждого образца в исследовании.
1. Создание плазмид стандартов шаблонов
- Создание праймеров для ампликона , расположенной на обоих Stat3 сайты сплайсинга, с 5'- сайтов KpnI и NheI рестрикции (и 5'-расширений) в соответствии с таблицей 1a.
Примечание: сайты KpnI и NheI были выбраны для того, чтобы вставки , чтобы быть лигированы в модифицированный вектор пет-28a с сопротивлением канамицину 25,26 KpnI сайт был добавлен в сайт множественного клонирования.. - Используя свеже пожертвованные эозинофилы, подготовить повторяющиеся образцы 2,5 × 10 6 клеток / мл в среде для культивирования клеток (Roswell Park Memoriaл Институт (RPMI) 1640). Инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 и 10% влажности.
- Подготовить комплементарную (с) ДНК из образцов (по крайней мере , 1 × 10 6 клеток на стадии подготовки) в соответствии с инструкциями изготовителя с использованием экстракции РНК и наборы для синтеза кДНК.
- Из кДНК шаблона , полученного на стадии 1.2.1, усиливать STAT3 сплайсинга варианты с использованием ПЦР - амплификации согласно таблице 2а.
- Устраните ампликонов в 2% агарозном геле 27 Трис-ацетат-этилендиаминтетрауксусной (ТАЕ). Акцизные полосы из геля и очищают согласно инструкции к набору геля иссечение.
- Вырезать ампликонов и плазмиду с соответствующими ферментами рестрикции (обзор ограничения в 27), используя объемы, времени и температуры инкубации рекомендованных поставщиком фермента; и очищают, как на шаге 1.4. Перевязывать ограниченные ампликонов в плазмиду при поставчик рекомендованных условиях.
- Приготовьте отрицательное продолжениерол (ограниченная плазмидной ДНК без вставки, но с лигазы) и положительного контроля (неограниченное плазмиду с сопротивлением канамицину). Выполните стандартные плазмиды преобразования компетентную E. палочки DH5 & alpha ; 28 , с использованием лигирования смеси 27.
- Выдержите трансформированной E. палочки в 1 мл Лурии-бульоне (LB) среды (полученного в соответствии с инструкциями 27) встряхивания в течение 1 ч при 37 ° С. Распространение трансформантов на LB-планшеты, содержащие 50 мкг / мл канамицина, и инкубируют при 37 ° С в течение ночи.
- Выберите несколько колоний из STAT3 альфа и бета STAT3 пластин с использованием стерильной зубочистки 27. Передача каждого по 2 мл LB. Grow культур в течение ночи при 37 ° C в инкубаторном шейкере.
- Очищают плазмиды из бактериальных культур, следуя инструкциям в набор для очистки ДНК. Хранить плазмид при -20 или -80 ° С.
- Последовательность плазмиды из нескольких колоний путем подготовки 20 мкл реакции секвенирования. Пипетка 3мкл буфера реакции секвенирования, 2 мкл реакционной смеси секвенирование, 12 мкл сверхчистой водой, 1 мкл плазмиды в виде матрицы и 2 мкл праймера для секвенирования.
Примечание: При использовании пет-28a вектор, используют для секвенирования праймер 5'-ТАА TAC GAC TCA СТА TAG GGG-3 '.- Оценка electrophoretograms плазмид , кодирующих каждый вариант: Sα, Sβ, ΔSα и ΔSβ 25.
- мера концентрации чистой плазмидной ДНК в нг / мкл. Если измерять оптическую плотность при 260 нм с использованием спектрофотометра, рассчитать концентрацию ДНК с помощью закона Ламберта-29:
Там , где с = концентрация, А = оптическая плотность, ε (коэффициент экстинкции) = 0,02 (мкг / мл) -1 см -1 для двухцепочечной ДНК и L = длина пути света (обычно 1 см). - Использование молекулярных масс STAT3 сплайс вариант кДНК утраplicons и вектор, рассчитать количество копий за мкл.
Примечание: Молекулярный вес за пару оснований (п.о.) оценивается как 650 Da.
2. Анализ Primer специфичностью по отношению к Абсолютной кПЦР
- Подготовка 1 из 10 серии разведений STAT3 плазмид, с ~ 10 8 до 10 3 копий на мкл (20 мкл) с использованием сверхчистой воды. Мера концентрации наиболее концентрированной (~ 10 8 копий на мкл, см шаг 1.11).
- Используйте разбавленные плазмид подготовить четыре "нецелевые" смесей (то есть., STAT3 ΔSβ отрицательный контроль , содержащий равные концентрации STAT3 Sα, ΔSα, Sβ но не ΔSβ) в количестве 10 6 копий на мкл каждого. Подготовить «мишень» смесь с равными концентрациями всех четырех шаблонов каждая по 10 6 копий на мкл.
- Готовят грунтовку раствор парыs для каждого варианта сплайсинга (таблица 1b и рисунок 1), сделав ~ 60 мкл праймеров каждый в 7 мкМ концентрации (конечная концентрация в образце будет 560 нМ).
- Развести ДНК - полимеразы / дц-связывающим смесь красителя 7: 5 с чистым H 2 O.
- Установить Анализ 1 в 96-луночный планшет для ПЦР , как показано на шаблоне (таблица 3).
- Добавьте 21 мкл разведенного ДНК - полимеразы / дц-связывающим смесь красителя, затем 2 мкл смеси праймера и 2 мкл матрицы (согласно таблице 2b). Вместо того , чтобы шаблон, добавьте 2 мкл отфильтрованных H 2 O к элементу управления нет шаблона (NTC) скважины. Настройка реакции в двух экземплярах для оценки воспроизводимости 30.
- Уплотнение КПЦР пластина с клейкой крышкой и центрифуге в течение 5 мин при 1200 мкг при 12 ° C.
- При использовании программного обеспечения , перечисленных на материалы, установить дополнительный эксперимент , как описано.
- Включите КПЦР машину и вставьте запечатаны КПЦР пластину. Нажмите Файл &# 62; Новый> Далее> Выберите "Новый детектор", выберите репортер, гаситель и предоставить имя. Настройка "новый детектор" для каждого варианта сплайсинга.
- Нажмите Далее, и настроить стандарты в соответствии с подсказками на странице Set Up образца плиты, обеспечивая величины вводятся в таблицу и соответствующие детекторы выбраны. Нажмите кнопку Готово.
- Настройка езда на велосипеде согласно таблице 2b. Убедитесь , что флуоресценция чтения (для определения Ct) происходит в течение 72 ° C шаге каждого цикла. Выберите Выполнить.
- При запуске будет завершена, перейдите на вкладку Результаты> вкладка Amplification участок. Оценка выходной график амплификации для оценки качества данных (ищите экспоненциального участка, как показано на рисунке 2).
Примечание: Убедитесь, что участки амплификации в основном экспоненциальной и что пороговый цикл может быть установлен в экспоненциальной части участка. Обеспечение NTCS не усиливаются и другие стандартные точки демонстрируют низкое значение Ct с высокой ΔRn. - ехрорт приводит к электронной таблицы программного обеспечения, нажмите Файл> Экспорт> Результаты.
3. Оценка Absolute КПЦР Специфичность анализа и повторяемостью
- стабильность
- Используйте данные из шага 2.7.5 для расчета стандартного отклонения Ct (порогового цикла для флуоресценции) значений.
Где N = количество выборок (2 , если сделано в двух экземплярах),
= Ct образца и 
= Ct образца имели в виду. Проверьте , что стандартное отклонение значений Ct дубликатов является ≤0.2. Убедитесь , что значения Ct во всех , кроме NTC скважин меньше , чем 38. - Если повторяемостью плохие параметры оптимизируют езда на велосипеде либо увеличения или уменьшения времени отжига.
- Используйте данные из шага 2.7.5 для расчета стандартного отклонения Ct (порогового цикла для флуоресценции) значений.
- Участок журнала копия онемелаэр (как определено в пункте 1.12 и полученного на стадии 2.1) против значения Ct создать стандартную кривую; получая следующее уравнение:
Где у Ct, м градиент, х журнал (число копий) и б это значение перехватывают.
Примечание: Значение R 2 линейной регрессии будет ≥0.95 для хороших данных. - Рассчитать эффективность амплификации с использованием стандартной кривой, и уравнение:
Примечание: Цель эффективности ≥75%. - Вычислить специфичность от КПЦР анализа 1, используя формулу Too в:
Там , где целевая Δ Ct = Ct Too - Ct нецелевым, описывая разницу числа порогового цикла для специфической и неспецифической усилителяlification
Примечание: Специфичность должна превышать четыре порядка (то есть коэффициент специфичности ≥4.).- Если специфика беден, оптимизировать за счет снижения концентрации праймера. Настройка анализы (как описано в пунктах 2.5-2.7) с конечной концентрации праймеров в диапазоне от 100 до 500 нм.
= Ct образца и 
= Ct образца имели в виду. Проверьте , что стандартное отклонение значений Ct дубликатов является ≤0.2. Убедитесь , что значения Ct во всех , кроме NTC скважин меньше , чем 38. 
4. Выполнение относительных КПЦР Assays
- Лечить клетки с цитокинами для содействия транскрипцией.
- Для свеже пожертвованных эозинофилов, готовят дубликаты проб 2,5 × 10 6 клеток / мл в среде для культивирования клеток (RPMI 1640) и обрабатывают 50 нг / мл интерлейкина-3 (IL3) и / или 50 нг / мл фактора некроза опухоли альфа ( TNF - alpha) в течение периодов 3, 6, 9 и 20 ч при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 и влажности 10%.
- Готовят кДНК из образцов эозинофилов (по крайней мере , 1 × 10 6 клеток на стадии подготовки) в соответствии с инструкциями изготовителя с использованием экстракции РНК и синтез кДНК наборов. Готовят серийные разведения двух образцов кДНК аликвот (контрольных или покоящиеся образцов), с диапазоном разбавления от "1" до "1" в 1024 году разбавления.
- Для сверхчистой воды 1 в 4 разведения, пипетки 1 мкл кДНК и 3 мкл.
- Для получения 1 в 16 разбавление в, пипетки 1 мкл 1 в 4 разбавления и 3 мкл сверхчистой воды и т.д.
- Установка ПЦР в 96-луночный планшет с 25 мкл реакции , как описано шаги 2.3-2.5 , но с нескольких грунтовочных концентраций для панкреатита STAT3 и GUSB (см шаблон в таблице 4).
- Добавить "новый детектор" для GUSB и выполните шаги 2.6-2.7, используя параметры велосипедного , описанных в таблице 2с.
- Генерация стандартных кривых (см шаги 3.2 и 3.3) для определения концентрации праймера приводит к 95-100% эффективности амплификации.
- Установите пластину с готовыми образцами кДНК (со стадии 4.2) и оптимизированных концентраций праймеров(смотри таблицу 2с для параметров езда на велосипеде, реагентов и в таблице 5 шаблона 96-луночного планшета).
- Выполните шаги 2.6-2.7. Повторите анализ, по крайней мере один раз и проверки качества данных.
- Вычислить среднее значение Ct дубликата образца Cts для обоих STAT3 и генов домашнего хозяйства GUSB.
- Получение значения Δ Ct для каждого образца.
- Назначают покоя образца ( как правило , имеет низкую концентрацию стенограмме интереса) в качестве образца 0. Вычислить ΔΔ Ct 31 для каждого образца (здесь обозначен как образец X):
- Вычислить Наклоняемый увеличение для каждого образца:
- Воспроизводимость
- Рассчитывают коэффициент вариации (CV) числа копий для панкреатита STАТ3 и GUSB.
Где N = число выборок, = вычисляется количество копий образца и = выборочное среднее. Убедитесь, что резюме каждого образца (анализа многократных проб) составляет ≤10%.
- Рассчитывают коэффициент вариации (CV) числа копий для панкреатита STАТ3 и GUSB.
5. Анализ Абсолютную КПЦР данных для неизвестных образцов
- Сравните значения Ct , полученные в относительном кПЦР (как описано в пункте 4.9) для генной ведение домашнего хозяйства GUSB для обеспечения концентрации кДНК образцов 'находятся в пределах одного порядка величины.
- Развести кДНК соответствующим образом (например, если образец 1 имеет значение КТ ~ 17.5 и значения Ct других образцов 'являются ~ 21, образец 1 составляет примерно 2 (21-17.5) = 11 раз более концентрированным Выполнить 1: 1. Разбавление сверхчистой воды в том же диапазоне без разбавления больше, чем это необходимо).
Примечание: Значительно различные исходные концентрации будут смещения линейного регрессионного анализа (шаг 4.12).
- Развести кДНК соответствующим образом (например, если образец 1 имеет значение КТ ~ 17.5 и значения Ct других образцов 'являются ~ 21, образец 1 составляет примерно 2 (21-17.5) = 11 раз более концентрированным Выполнить 1: 1. Разбавление сверхчистой воды в том же диапазоне без разбавления больше, чем это необходимо).
- Настройка абсолютного КПЦР анализа образцов. Подготовка анализа шаблона 2a пластины для Sα и Sβ согласно Таблице 6; и подготовить для анализа 2b для ΔSα и ΔSβ согласно таблице 7. Провести анализы , как описано в пунктах 2.6-2.7.3 (и в таблице 2b). Повторите анализы по крайней мере, один раз.
- Проверьте качество и экспорт данных, как описано в пунктах 2.7.4-2.7.5.
- Настройка абсолютного КПЦР 96 - луночный планшет с 25 мкл реакций с использованием панкреатита Stat3 праймеров (праймеры в таблице 1c, шаблон в таблице 8) при 400 мкМ и смесь всех четырех плазмид или одной плазмиды в перечисленных общих концентрациях.
Примечание: Эффективность не имеет значения для абсолютного кПЦР, но оптимизировать эффективность этих праймеров имеет важное значение для относительного кПЦР (этап 4). - Уплотнение КПЦР пластина с клейкой крышкой и центрифуге в течение 5 мин при 1200 мкг при 12 ° C.
- Настройка "новый детектор" для сковороды- STAT3 , как на этапах 2.7.1-2.7.3.
- Настройка езда на велосипеде для панкреатита STAT3 согласно таблице 2с ( такие же условия , как относительная кПЦР). Убедитесь , что флуоресценция чтения (для определения Ct) происходит в течение 72 ° C шаге каждого цикла. Повторите анализ, по крайней мере один раз, чтобы обеспечить воспроизводимость.
- Проверка качества данных и экспорта (см шаги 2.7.4-2.7.5).
- Если усилительные участки не экспоненциальная (см рисунок 2), развести образец кДНК (1:10) и повторить испытание , как описано (шаг 5.7).
- Используя уравнение стандартной кривой (см 3.2, рис 3) и значения Ct образцов, вычислить число копий каждого варианта сплайсинга и от панкреатита STAT3 в каждом образце.
- Журнал Plot (абсолютные числовые значения , полученные копии КПЦР для панкреатита STAT3) против журнала (кумулятивных абсолютных значений числа копий КПЦР для STAT3 сплайсинга варианты).
Примечание: Идеальная линейная регрессия и склоновые значения будут оба ~ 1. - Вычислить Повторяемость (шаг 3.1) и воспроизводимости (шаг 4.13).
6. Слияние Абсолютная и относительная КПЦР данных
- Умножить долю варианта с общей STAT3 сгиба увеличение для расчета Наклоняемый увеличение каждого варианта сплайсинга.
- Вычислить стандартные отклонения (шаг 3.1.1) абсолютных и относительных величин для учета распространения ошибки. Определить стандартную погрешность измерения (SEM), как показано:
Representative Results
Хорошие данные КПЦР качества будет генерировать сигмоидального график амплификации (рис 2а), что означает экспоненциальное увеличение транскриптов по ходу езды на велосипеде. Наличие слишком большого количества шаблона может привести к фоне высокой флуоресценции, а это означает несоответствующее базовый уровень устанавливается в течение первых нескольких циклов. Если данные не дают экспоненциальную кривую (рис 2b), дальнейшая оптимизация необходимо (описано в пунктах 3.1 и 3.4). Для получения дополнительной информации об устранении неполадок результатов КПЦР см ссылку 32. Стандартные кривые , полученные для шаблона калибратора плазмид будет указывать на эффективность амплификации (кривая для STAT3 Sα , показанной на рисунке 3). Эффективности от 83 до 95% наблюдались в условиях, описанных. Уравнение для специфичности (Шаг 3.4) предполагает равную эффективность, что маловероятно 25, так что специфичностьскорее всего, будет больше, чем коэффициент специфичности предполагает.
Для того , чтобы оценить конгруэнтность уровней STAT3, абсолютные значения каждого из четырех вариантов сплайсинга , были измерены, а также от уровня общего STAT3, последние с использованием праймеров амплификации участка общей для всех четырех вариантов сплайсинга (рис 4). В идеальном случае линейной регрессии (признак корреляции) и наклон (отношение панкреатита STAT3 к суммированных сплайс - варианты) должны быть оба близко к 1.
Абсолютные данные КПЦР представлены в виде круговых диаграмм , чтобы показать пропорции четырех вариантов сплайсинга с течением времени после стимуляции цитокинами (рис 5а). Отдыхать эозинофилов (0 ч) имел наименьший удельный вес STAT3 Sα, хотя этот вариант всегда был самым распространенным. Умножив доля STAT3 вариантов β сплайсинга (S ^6; + ΔSβ) на долю вариантов STAT3 сплайсинга & Dgr ; S (ΔSα + ΔSβ) последовательно дает значение ниже , чем экспериментально записанное значение для ΔSβ. Если сплайсинга события были независимыми, можно было бы ожидать, что умножение доли вариантов Dgr; S на долю бета вариантов дало бы значение, которое согласуется с экспериментально определенное значение. Более высокие уровни ΔSβ, чем ожидалось от независимых сплайсинга событий предполагает смещение со-сплайсинга существует.
Слияние абсолютные и относительные данные КПЦР показали , что уровни всех вариантов STAT3 сплайсинга увеличилась после стимуляции цитокинами ИЛ - 3 и ФНО, с обострением уровня 6 ч после стимуляции (рис 5б - е). Для трех из четырех вариантов сплайсинга, уровни транскриптов были примерно в 3 раза выше в IL3 + ФНО обработанных эозинофилов (6 ч) по сравнению с эозинофилов в средствах массовой информациив тот же момент времени. Уровни STAT3 Sα в 3,5 раза выше в IL3 + ФНО обработанных эозинофилов по сравнению с эозинофилов в средствах массовой информации в этот момент времени. Наибольшая неопределенность ( по величине стандартной ошибки измерения) был замечен в ΔSβ (рис 5e), который содержит наименьшее долю общего STAT3 во всех образцах. И это не удивительно, так как более низкие уровни связаны с более высокими значениями Ct. Требуя больше циклов для достижения порогового цикла будет усугублять неопределенность из-за изменения цикла к циклу в эффективности амплификации.
Рисунок 1: Схема пар праймеров использовали для выполнения КПЦР STAT3 , сплайс - варианты и пан-STAT3 Праймеры , используемые для амплификации конкретно каждого из вариантов STAT3 сплайсинга (Sα, Sβ, ΔSα и ΔSβ соответственно) с.hown. Праймеры (STAT3 "S" и "& Dgr ; S") перекрывают соединение между экзонов 21 и 22. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: Amplification участки данных КПЦР (а) сигмоидального участки усиления означает надежное усиление. Эти данные были получены из кПЦР из двух последовательных разведений плазмиды , содержащей STAT3 Sα, с каждой парой цветных линий , представляющих уровни флуоресценции дублированных разбавленный выборкам в течение в течение 40 циклов (ось х). Наиболее концентрированным образец (зелено-серый) был достаточно усилено цикла 17 (с дц-связывающий краситель, пропорциональную флуоресценции, показанной на оси у) не превышает значения флуоресценции порога (baseliпе показано, как зеленая стрелка). Его значение Ct будет 17. (б) неэкспоненциальиость участки позволяют предположить , что порог фона флуоресценции не было правильно установлено в течение первых нескольких циклов. Это может быть связано с наличием ингибитора или высококонцентрированных шаблона или праймеров. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Стандартная кривая журнала (число копий STAT3 Sα) против Ct Существует линейная зависимость между логарифмом числа копий и порогового цикла каждого Stat3 сплайсированный вариант в (Ct).. Создание стандартной кривой из ДНК плазмиды подражает кДНК образцов и, таким образом,обеспечивает лучшее измерение, чем кривой, созданной из разбавленных ампликонов PCR. Данные представлены значения Ct , полученные из кПЦР двух последовательных разведений плазмиды , содержащей STAT3 Sα. Из этой кривой, число копий присутствует в каждом образце можно интерполировать, и эффективность амплификации рассчитывается (83,9%). Хотя y- перехватывает менее воспроизводимым , чем наклон, отсекаемый отрезок предполагает 42,2 циклы было бы необходимо , чтобы быть уверенным , нет ДНК - мишени не присутствует. Столбики ошибок указывают SEM, п = 3. Сопоставимые кривые были построены для STAT3 Sβ, ΔSα и ΔSβ (не показан). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Сравнение количественных панкреатита
Рисунок 5:. STAT3 уровни вариант сплайсинга колебались в течение курса лечения цитокин (а) Круговые диаграммы , указывающие на процентное содержание каждого варианта STAT3 сращиванияэозинофилов во время лечения с ИЛ-3 и ФНО. (Б - д) Изменения в вариантах STAT3 сростка эозинофилов , обработанных различными комбинациями цитокинов, измеренных с помощью сочетания относительных и абсолютных данных КПЦР Sα (б), Sβ (с), ΔSα (d), и ΔSβ (е) уровни STAT3. колебались в течение долгого времени после стимуляции. Уровни первоначально увеличивается, достигая максимума 6 ч после стимуляции. Комбинация IL3 + TNF - alpha вызвало более высокую экспрессию всех вариантов сплайсинга четыре STAT3 , чем в одиночку IL3. SEM рассчитывается для каждой точки данных учета для распространения ошибки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: Праймеры , используемые для амплификации (а), абсолютная (б) и относительного (с) количественной ПЦР. Клонирование праймеры имеют последовательности рестрикции и 5'-расширения для эффективной резки. Сайтов рестрикции KpnI и NheI , выделены жирным шрифтом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Таблица 2. Параметры ПЦР цикличности (слева) и объемы реагентов (справа) для амплификации (а), относительная (б), абсолютная (с) количественной ПЦР. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
3 / 54473tbl3.jpg "/>
Таблица 3:. Шаблон для абсолютного КПЦР плазмида калибровки анализа Этот анализ необходим для оценки воспроизводимости и эффективности, а также генерации стандартных кривых , из которых интерполировать данные. В "нецелевые" смеси даст оценку специфичности. Оптимизация может быть необходимым для достижения согласованности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Таблица 4:. Шаблон для относительной кПЦР (панкреатита STAT3 и ведение домашнего хозяйства гена GUSB) калибровки анализа В отличие от абсолютного кПЦР, точка этого анализа является определение условий , при которых эффективность амплификации составляет ~ 100%.tp_upload / 54473 / 54473tbl4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Таблица 5:.. Шаблон для относительного анализа образца КПЦР для измерения панкреатита STAT3 и генную ведение домашнего хозяйства GUSB Стандартные кривые повторяются вместе с образцами , чтобы обеспечить сравнимую эффективность анализов Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Таблица 6: Шаблон для абсолютного анализа образца КПЦР для измерения варианты S Стандартные кривые повторяются вместе с образцами , чтобы обеспечить сравнимую эфф. iciency из анализов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Таблица 7:.. Шаблон для абсолютного анализа образца КПЦР для измерения варианты Dgr ; S Стандартные кривые повторяются вместе с образцами , чтобы обеспечить сравнимую эффективность анализов Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Таблица 8: Шаблон для абсолютного анализа образца КПЦР для измерения панкреатита STAT3.large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Discussion
Мы разработали этот протокол для того, чтобы оценить уровень и пропорции STAT3 сплайсинга вариантов транскриптов в эозинофилов и клетках лимфомы и узнать, влияет ли стимуляция цитокина уровни и пропорции. STAT3 представляет особый интерес из - за его плейотропному и неопределенной функциональности, с противоречивые сообщения о действует ли она в качестве онкогена или опухолевый супрессор при раке (обзор в ссылке 33). Различия в STAT3 альфа и вариант β сплайсинга функции были охарактеризованы ранее 34,35, и наш протокол способствовал анализ нокдауна / повторного выражения , что предполагает необходимость оптимального соотношения S и стенограммы 19 & Dgr ; S.
Точная количественная оценка различных вариантов сплайсинга будет способствовать дальнейшие исследования, касающиеся гетерогенную функции STAT3 сращивание вариант композиции. Протокол интегрирует абсолютные и относительные данные КПЦР, сочетая способность ABрастворенного вещества КПЦР для расчета сплайсированный вариант пропорций, и относительная КПЦР для измерения изменений в общем выражении STAT3. Такой подход позволяет различать тонкие различия в последовательности и одновременно измерять коэффициенты сплайсинга на двух альтернативных сайтов сплайсинга более чем 50 нуклеотидов друг от друга. Определение соотношений сплайсинга событий по отдельности не дала бы замечательный вывод о том , что смещения со-сплайсинг существовали такие , что уровни ΔSβ выше , чем ожидалось , если использование двух сайтов случайным образом сращены 25.
Чрезвычайно важно, абсолютная КПЦР с использованием калибровочных кривых плазмидных позволяет количественно оценить (при субоптимальной эффективности) вариаций сплайсинга, что приводит к весьма сходных последовательностей. Мы ожидаем, что роман тонкий сплайсинга КПЦР анализ должен занять около двух месяцев, чтобы оптимизировать. Основные этапы разработки анализа являются создание STAT3 плазмид , используемых при генерации стандартных кривых для абсолютного кПЦР; опытным путемопределения оптимальных последовательностей праймеров и параметров задействуя для обеспечения специфичности и воспроизводимости; а интегрирование относительных данных КПЦР происходит от количественной оценки пан-STAT3 экспрессии по отношению к экспрессии GAPDH. Соотношение числа копий количественно с помощью панкреатической STAT3 в сравнении с совокупной количественной оценке (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) показывает , что протокол дает надежные результаты.
Протест методики является обширный процесс проверки. Необходимо оценить изменчивость внутри анализа (воспроизводимости), межпробная изменчивость (воспроизводимость) и специфичность. Протокол описывает способы получения цифровых выходов для этих параметров. Мы посчитали эффективность указанных ≥75%, коэффициент специфичности ≥4, коэффициент вариации (воспроизводимости) ≤10% и Ct стандартное отклонение (повторяемость) ≤0.2 в качестве подходящих порогов 30. Мутации или делеции в последовательности STAT3 аминокислот 1-690 не будет discoveкрасный этим протоколом, хотя они могут повлиять на коэффициенты сплайсинга. Стенографический пропорции не может быть пропорциональна proteoform пропорции 36.
Поскольку образцы имеют различные исходные количества общей кДНК, абсолютным КПЦР подходит для сравнения числа копий вариантов сплайсинга в образце, но не для сравнения между образцом, если не в сочетании с относительной кПЦР с использованием установленного гена домашнего хозяйства. Метод , описанный соответствует руководящим принципам MIQE КПЦР для воспроизводимости 30. Параметры велосипедных ПЦР и концентрации праймеров может потребоваться быть модифицирован для получения воспроизводимых данных, если используется другое оборудование. Идеальная специфичность невозможно без резко снижает эффективность, но цель была амплифицирована более эффективно, чем больше четырех порядков.
Линейная ДНК более легко, чем усиливается круговой. Если альтернативный плазмида не обеспечивает удовлетворительные стандартные кривые (R 2 <; 0,95), рассмотрим линеаризацию плазмиды с помощью одного сайта рестрикции до количественной оценки. Оптимизация КПЦР имеет решающее значение для получения качественных данных (Рисунок 1). Большинство протоколов КПЦР полагаются на двухступенчатой езда на велосипеде, и машины оптимизированы соответствующим образом. Неравномерный нагрев нагревательного блока может быть усилено в трехступенчатой езды на велосипеде, что способствует плохой воспроизводимости. Анализы должны быть установлены в стерильных условиях с фильтром пипеток и сверхчистой воды, в идеале в специальном колпаке с ламинарным потоком. Поскольку загрязняющие вещества могут привести к противоречивым результатам, анализы должны быть установлены в стерильных условиях с фильтром пипеток и сверхчистой воды, в идеале в специальном колпаке с ламинарным потоком. Дополнительные сведения об оптимизации КПЦР, обратитесь к Bustin и др. 32
Количественная STAT3 может привести к более глубокое понимание в ряде контекстов. STAT3 автоматически регулирует свое собственное выражение 37, и протокол , описанный выше , может помочьчтобы выяснить , является ли вклад соотношения вариантов STAT3 сплайсинга для регулирования этой положительной петли обратной связи. Протокол может быть использован для изучения сдвигов в соотношениях вариантных сплайсинга , как наблюдалось в клетках при различных плотностях 38 или в течение развития: известно , что STAT3 изменения / соотношение & beta ; & alpha ; на уровне белка в процессе гемопоэза 16. Сундин и др. обнаружили , что интронного полиморфизм единичного нуклеотида предвзятым сплайсинга экзона 12 в STAT3 пациента с синдромом Иова 39. Вполне возможно, что один из многих полиморфизмов, присутствующих в интронов между экзонов 21 и 22, или экзона 22 и 23 могут способствовать сплайсинга отношений & Dgr; S / S и а / р соответственно. Анализ может быть использован для количественного STAT3 - транскриптов в раковых клетках, где мутации или изменения в регуляции сплайсинга могут уклон к введению процесса 40 сплайсинга. Мутации факторов сплайсинга (как SF3B1), а Observред в МДС синдромов 41 также может привести к изменениям , которые могут быть измерены с помощью этого протокола.
В более широком плане, этот подход конкретно определяет совместное объединение в сплайсинга, что не представляется возможным с обычными РНК-Seq, ни стандартного кПЦР. В то время как феномен взаимоисключающего экзона сплайсинга демонстрирует координацию сращивания решений, совместное объединение других сплайсинга событий не был хорошо изучен. Недавно описан альтернативный способ, в котором РНК-Seq была изменена таким образом , чтобы допросить кДНК полной длины, предполагает отдаленная сплайсинга события более взаимозависимы , чем считалось ранее 42.
STAT3 содержит сайт сплайсинга донора тандем. Акцепторные сайты сплайсинга тандем чаще 43 и принципы наметившейся протокола могли бы послужить отправной точкой для разработки анализов для обнаружения совпадений NAGNAG сплайсинга и других сплайсинга событий в пределах 200 нуклеотидов. Другое POTENренциальные применения включают в себя количественную оценку совпадения других тонких различий последовательности, как вставкам или двойной / тройной нуклеотидных полиморфизмов 44.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить Национальные институты здоровья-NHLBI для грантовой программы проекта о роли эозинофилов в дыхательных путях Воспаление и ремоделирования: P01HL088584 (PI: Н. Jarjour), и Университета штата Висконсин Carbone онкологического центра и отдела медицины для очного финансирования. Мы благодарим Дуглас Annis для клонирования четыре варианта STAT3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | GMI | N/A | Used for standard PCR |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | N/A | qPCR machine |
| GS-6R | Beckman Coulter | N/A | centrifuge for 96-well plates |
| Nanodrop 2000 sprectrophotometer | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| RPMI-1640 medium | Sigma Aldrich | R8758 | cell culture medium |
| PfuTurbo DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600410 | DNA polymerase for standard PCR |
| KpnI | New England Biosciences | R0142S | |
| NheI | New England Biosciences | R0131S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Qiagen | 330523 | qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74204 | RNA extraction kit |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | 18080-044 | cDNA synthesis kit |
| Primers | Integrated DNA Technology | N/A | |
| NEBuffer 1.1 | New England Biosciences | B7201S | |
| GenePure LE Agarose | ISC BioExpress | E-3120-500 | component of TAE gel |
| Pipettors | Major lab suppliers (MLS) | N/A | |
| Filter pipette tips | Neptune Scientific | BT10XL, BT20, BT200 | |
| EU One Piece Thin Wall Plate | MidSci | ABI7501 | |
| ThermalSeal A Sealing Film | MidSci | TSA-100 | 96 well plate seal |
| pET-Elmer (variant of pET-28a) | Novagen; modified in Mosher lab | N/A | Details in PMID: 20947497 |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Sequencing kit |
| QIAEX II Gel Extraction kit | Qiagen | 20021 | Amplicon purification |
| DH5α competent cells | ThermoFisher Scientific | 18265-017 | available from several providers, see PMID: 2162051 |
| kanamycin | Research Products International Corp. | K22000-5.0 | |
| Tris base | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | component of TAE buffer |
| Acetic acid, glacial | ThermoFisher Scientific | A38C-212 | component of TAE buffer |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich) | E-5134 | component of TAE buffer |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | component of Luria Broth |
| Bacto Yeast extract, technical | BD Biosciences | 288620 | component of Luria Broth |
| Sodium chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | component of Luria Broth |
| Sodium hydroxide | ThermoFisher Scientific | SS255-1 | component of Luria Broth |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | component of Luria Broth plate |
| Lasergene SeqBuilder | DNASTAR | Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR) |
References
- Hiller, M., et al. Phylogenetically widespread alternative splicing at unusual GYNGYN donors. Genome Biol. 7 (7), R65 (2006).
- Treacy, M. N., et al. Twin of I-POU: a two amino acid difference in the I-POU homeodomain distinguishes an activator from an inhibitor of transcription. Cell. 68 (3), 491-505 (1992).
- Schindler, S., et al. Alternative splicing at NAGNAG acceptors in Arabidopsis thaliana SR and SR-related protein-coding genes. BMC Genomics. 9, 159 (2008).
- Szafranski, K., Kramer, M. It's a bit over, is that ok? The subtle surplus from tandem alternative splicing. RNA Biol. 12 (2), 115-122 (2015).
- Wang, M., et al. Alternative splicing at GYNNGY 5' splice sites: more noise, less regulation. Nucleic Acids Res. 42 (22), 13969-13980 (2014).
- Hiller, M., Platzer, M. Widespread and subtle: alternative splicing at short-distance tandem sites. Trends Genet. 24 (5), 246-255 (2008).
- Tsai, K. W., Lin, W. C. Quantitative analysis of wobble splicing indicates that it is not tissue specific. Genomics. 88 (6), 855-864 (2006).
- Tadokoro, K., et al. Frequent occurrence of protein isoforms with or without a single amino acid residue by subtle alternative splicing: the case of Gln in DRPLA affects subcellular localization of the products. J Hum Genet. 50 (8), 382-394 (2005).
- Bradley, R. K., Merkin, J., Lambert, N. J., Burge, C. B. Alternative splicing of RNA triplets is often regulated and accelerates proteome evolution. PLoS Biol. 10 (1), e1001229 (2012).
- Zheng, C. L., Fu, X. D., Gribskov, M. Characteristics and regulatory elements defining constitutive splicing and different modes of alternative splicing in human and mouse. RNA. 11 (12), 1777-1787 (2005).
- Schaefer, T. S., Sanders, L. K., Nathans, D. Cooperative transcriptional activity of Jun and Stat3 beta, a short form of Stat3. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9097-9101 (1995).
- Waitkus, M. S., et al. Signal integration and gene induction by a functionally distinct STAT3 phosphoform. Mol Cell Biol. 34 (10), 1800-1811 (2014).
- Srivastava, J., DiGiovanni, J.
- Holland, S. M., et al.
- Maritano, D., et al. The STAT3 isoforms alpha and beta have unique and specific functions. Nat Immunol. 5 (4), 401-409 (2004).
- Hevehan, D. L., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. Differential expression and phosphorylation of distinct STAT3 proteins during granulocytic differentiation. Blood. 99 (5), 1627-1637 (2002).
- Yoo, J. Y., Huso, D. L., Nathans, D., Desiderio, S. Specific ablation of Stat3beta distorts the pattern of Stat3-responsive gene expression and impairs recovery from endotoxic shock. Cell. 108 (3), 331-344 (2002).
- Stahl, N., et al. Choice of STATs and other substrates specified by modular tyrosine-based motifs in cytokine receptors. Science. 267 (5202), 1349-1353 (1995).
- Zheng, M., et al. A mix of S and DeltaS variants of STAT3 enable survival of activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells in culture. Oncogenesis. 4, 184 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
- Kelly, E. A., Liu, L. Y., Esnault, S., Quinchia Johnson, B. H., Jarjour, N. N. Potent synergistic effect of IL-3 and TNF on matrix metalloproteinase 9 generation by human eosinophils. Cytokine. 58 (2), 199-206 (2012).
- Whelan, J. A., Russell, N. B., Whelan, M. A. A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR. J Immunol Methods. 278 (1-2), 261-269 (2003).
- Too, H. P. Real time PCR quantification of GFRalpha-2 alternatively spliced isoforms in murine brain and peripheral tissues. Brain Res Mol Brain Res. 114 (2), 146-153 (2003).
- Turton, K. B., Annis, D. S., Rui, L., Esnault, S., Mosher, D. F. Ratios of Four STAT3 Splice Variants in Human Eosinophils and Diffuse Large B Cell Lymphoma Cells. PloS One. 10 (5), e0127243 (2015).
- Maurer, L. M., et al. Extended binding site on fibronectin for the functional upstream domain of protein F1 of Streptococcus pyogenes. J Biol Chem. 285 (52), 41087-41099 (2010).
- Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Greene Pub. Associates; J. Wiley. (1987).
- Grant, S. G., Jessee, J., Bloom, F. R., Hanahan, D. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (12), 4645-4649 (1990).
- Kocsis, L., Herman, P., Eke, A. The modified Beer-Lambert law revisited. Phys Med Biol. 51 (5), N91-N98 (2006).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45 (2001).
- A-Z of quantitative PCR. Bustin, S. A. , International University Line. (2004).
- Zhang, H. F., Lai, R.
- Caldenhoven, E., et al. STAT3beta, a splice variant of transcription factor STAT3, is a dominant negative regulator of transcription. J Biol Chem. 271 (22), 13221-13227 (1996).
- Zammarchi, F., et al. Antitumorigenic potential of STAT3 alternative splicing modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (43), 17779-17784 (2011).
- Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165 (3), 535-550 (2016).
- Narimatsu, M., et al. Tissue-specific autoregulation of the stat3 gene and its role in interleukin-6-induced survival signals in T cells. Mol Cell Biol. 21 (19), 6615-6625 (2001).
- Szafranski, K., et al. Physiological state co-regulates thousands of mammalian mRNA splicing events at tandem splice sites and alternative exons. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8895-8904 (2014).
- Sundin, M., et al. Novel STAT3 mutation causing hyper-IgE syndrome: studies of the clinical course and immunopathology. J Clin Immunol. 34 (4), 469-477 (2014).
- Oltean, S., Bates, D. O.
- Boultwood, J., Dolatshad, H., Varanasi, S. S., Yip, B. H., Pellagatti, A. The role of splicing factor mutations in the pathogenesis of the myelodysplastic syndromes. Adv Biol Regul. 54, 153-161 (2014).
- Tilgner, H., et al. Comprehensive transcriptome analysis using synthetic long-read sequencing reveals molecular co-association of distant splicing events. Nat Biotechnol. 33 (7), 736-742 (2015).
- Hiller, M., et al. Widespread occurrence of alternative splicing at NAGNAG acceptors contributes to proteome plasticity. Nat Genet. 36 (12), 1255-1257 (2004).
- Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6102-6111 (2010).
