Abstract
Os desvios em relação aos níveis normais e padrões de vasculares jogo cisalhamento papéis fluidos importantes na fisiologia vascular e fisiopatologia induzindo adaptativa, bem como alterações patológicas no fenótipo endotelial e expressão gênica. Em particular, os efeitos inadaptado de periódico, o fluxo unidireccional shear stress induzido pode desencadear uma variedade de efeitos sobre vários tipos de células vasculares, em particular as células endoteliais. Embora até agora as células endoteliais de diversas origens anatômicas têm sido cultivadas, análises em profundidade das suas respostas ao cisalhamento de fluidos têm sido dificultados pela relativa complexidade dos modelos de cisalhamento (por exemplo, câmara de fluxo de placas paralelas, cone e modelo de fluxo de placa). Enquanto todos estes representam excelentes abordagens, tais modelos são tecnicamente complicado e sofre de desvantagens, incluindo o tempo de configuração relativamente longo e complexo, áreas de superfície de baixo, os requisitos para bombas e pressurização muitas vezes necessitando de selantes e vedações, criando desafios para both manutenção de esterilidade e uma incapacidade de executar várias experiências. No entanto, se os modelos de taxa de transferência mais elevados de fluxo de cisalhamento e foram disponíveis, um maior progresso na cisalhamento respostas endoteliais vasculares, a pesquisa de cisalhamento particularmente periódica, a nível molecular, podem ser mais rapidamente avançada. Aqui, descrevemos a construção e utilização de anéis de corte: um romance, simples de montar, e modelo de cultura de tecido barato, com uma área de superfície relativamente grande, que facilmente permite um alto número de repetições experimentais em unidirecionais, cisalhamento periódica estudos de estresse sobre células endoteliais.
Introduction
Tensão de cisalhamento de fluidos tem sido mostrado para modular os programas de genes endoteliais 1-5 através da activação de elementos cis-reguladores 6, a actividade de acetiltransferase de histona 7 e elementos de resposta a tensão de cisalhamento (8) SSRE. Cisalhamento influências de stress contribuições endoteliais no sentido de coagulação através da modulação do factor de tecido 9 e activador do plasminogénio tecidular (tPA) 10 expressão. A tensão de cisalhamento também influencia o controle da angiogênese 11 e remodelação dos navios por regulação da síntese e capacidade de resposta 8 PDGF-B. O endoteliais derivado mediadores vasoativos adrenomedullin, a endotelina-1, urotensina II e relaxina são também regulados por cisalhamento 12. Transcrição da produção de óxido nítrico sintase endotelial e produção de óxido nítrico são ambos cisalhamento dependente 10. Cisalhamento endotelial também controla a expressão de ICAM-1 13. tensão de cisalhamento induzidas pelo fluxo pode, por conseguinte, Powerfuinfluenciar lly uma grande variedade de respostas endoteliais. Importante, pulsações vasculares agora também parecem desempenhar papéis importantes na patofisiologia de ambas envelhecimento vascular normal e formas de demência vascular 14 e pode ainda contribuir para outras doenças neurodegenerativas, tais como esclerose múltipla 15.
Venosa e células endoteliais arteriais são inerentemente expostos a diversos padrões de fluxo hemodinâmicos in vivo, e diversos fenótipos de células endoteliais diferentes pode ser exibido 16. Dependendo da magnitude e a periodicidade do escoamento, efeitos sobre as células endoteliais podem incluir a activação de células inflamatórias e de apoptose, que podem reflectir alterações no gene ou proteína de expressão 17,18. Estudos sobre as respostas das células endoteliais para tosquiar fenômenos, portanto, permanecem complicado pelas dificuldades na produção de modelos in vitro que produzem adequadamente tais padrões de cisalhamento.
Muitos experime diferentental protocolos foram desenvolvidos para aplicar a tensão de cisalhamento de fluidos para monocamadas endoteliais celulares. Um dos sistemas mais utilizados é a câmara de fluxo de placas paralelas, que cria o fluxo laminar uniforme dentro da câmara de 19-21. A bomba peristáltica está normalmente ligado para criar fluxo periódico, que pode recapitular características de fluxo tipicamente encontrados em muitos locais in vivo 22. Outra configuração comum utiliza o modelo de "cone e o prato ', onde a tensão de cisalhamento de fluidos é determinada pela velocidade de rotação do cone 23. Ambos os sistemas, e outros acordos semelhantes a eles, pode ser tedioso para configurar e requerem componentes que podem ser relativamente caros e inacessíveis para muitos laboratórios.
Outra limitação importante destes modelos actuais é o número relativamente baixo de estudos em duplicado que podem ser executadas simultaneamente, cada um com uma área superficial relativamente baixa. Isso aumenta o tempo e co mplexity de tais abordagens. Portanto, um modelo ideal que induz ao cisalhamento unidirecional e periódica pode ser aquele em que um elevado número de repetições do estudo pode ser facilmente configurado, cada um com uma área de superfície relativamente grande. Além disso, os modelos acima mencionados exigem uma configuração bastante sofisticados, que pode ser de custo proibitivo para muitos utilizadores. Um modelo que pode produzir distúrbios de cisalhamento de fluidos usando materiais básicos de laboratório pode ter várias vantagens.
Um método simples e altamente econômica de aplicar unidirecional, tensão de cisalhamento periódica envolve a colocação de pratos circulares num agitador orbital 24. Este protocolo é muito simples e pode ser escalada até atingir números elevados de estudo repetições, cada um com uma área de superfície relativamente grande, conforme necessário. No entanto, as células situadas no centro do prato são expostos a diferentes padrões de fluxo de células ao longo da periferia, dando origem a respostas celulares fenotípicas misturados no mesmo prato.
_content "> Neste relatório, nós descrevemos a construção e utilização de" anéis de corte ', o nosso modelo para a criação de tensão de cisalhamento unidirecional e periódica. O projeto para o anel de corte efetivamente fenótipos induzida por cisalhamento celulares "mistos" limites restringindo o fluxo caminho dentro de uma placa de cultura de circular para a periferia por meio da colocação de um anel interno. a construção e o funcionamento do anel de cisalhamento é simples e económico e pode ser facilmente dimensionada para acomodar uma grande variedade de agitadores orbitais usando fontes de cultura de tecidos amplamente disponíveis. Este modelo pode ser aplicado em experiências com células endoteliais para proporcionar padrões de fluxo unidireccional e periódicas dentro dos níveis fisiológicos e patofisiológicos.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Construção de 150 mm de diâmetro de cisalhamento anéis (Figura 1)
NOTA: Os anéis de corte pode ser construído de modo a criar muitas dimensões diferentes, variando as dimensões exteriores e interiores do prato de Petri, resultando em dispositivos com diferentes áreas de superfície total, o rendimento de células e desenvolvido gamas de forças de cisalhamento. Este relatório descreve um prato de 150 milímetros combinado com um prato de 100 milímetros interior para uma área de superfície total de 98 cm2 (Figura 2).
Figura 1. conjunto do anel de cisalhamento. A porção de topo da figura mostra um anel de corte parcialmente montado. Injectar 0,5 mL de cloreto de metileno através do furo 3 de passagem mm, com uma pipeta de transferência se uma vedação hermética não tem completamente formado entre os pratos interiores e exteriores. O anel de corte é selado pela aplicação de um 1 milímetro de espessura cordão de adesivo de borracha de silicone em torno da ca internae do anel superior cisalhamento. A parte inferior da figura mostra o anel de corte montado. O azul representa a área de células endoteliais banhados. As setas vermelhas externas e internas indicam o movimento orbital do anel de corte e meios de comunicação no interior do anel de cisalhamento quando colocado em um agitador orbital. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. medições de superfície para um anel de corte 150 mm (não desenhada à escala). O painel superior mostra mudança centrífuga de líquido em direcção anel externo em resposta à rotação orbital. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Criar um modelo de construção de anel de corte, gerando um150 milímetros perfil de aresta exterior em software de apresentação com um diâmetro interno de 100 mm, colocada no centro do círculo de 150 mM. Imprimir o modelo em uma folha de papel A4 branco.
- Pipetar 10 ml de cloreto de metileno (diclorometano) para uma placa de Petri de vidro de 150 milímetros. É fundamental que o prato de vidro e não é de poliestireno (ou de outro plástico de vinilo), como o cloreto de metileno solubiliza a maioria dos plásticos e é utilizado aqui para se juntar peças de plástico.
CUIDADO: Use luvas para toda a construção com ventilação capô adequada. cloreto de metileno é um irritante de contato e é hepatotóxico. - Alinhar de 150 mm plástico de Petri para o modelo de anel de corte exterior.
- Perfurar um furo de 3 mm no centro de uma placa de 100 mm utilizando uma ferramenta rotativa. Remover quaisquer aparas de plástico produzidos a partir da perfuração.
- Enquanto segura com uma mão enluvada, inverter e mergulhar a borda superior da placa de Petri de 100 mm de o passo anterior para dentro da piscina de cloreto de metileno durante cerca de 3 segundos.
- transfer o "humedecido" 100 milímetros prato de borda para baixo no centro de um prato de 150 mm, alinhando cuidadosamente a placa de 100 mm sobre o molde marcado. O cloreto de metileno irá fundir o plástico, juntando-se os 100 mm e 150 mm pratos. Suavemente girar a placa de 100 mm e anti-horário algumas vezes para garantir uma boa aderência ao prato 150 milímetros.
NOTA: Tome muito cuidado para garantir o alinhamento correcto do prato interior para o centro do prato exterior. alinhamento excêntrico pode resultar em variações da tensão de corte em locais diferentes no anel de corte. Ter o cuidado de não permitir que o cloreto de metileno a escorrer acidentalmente para a porção de pista exterior da placa de Petri de 150 milímetros durante a colocação da placa de 100 mm. Isto irá fundir o plástico na superfície inferior onde as células serão em crescimento, criando uma superfície irregular que pode causar perturbações de fluxo. - Uma vez que o cloreto de metileno secou, virar as placas de Petri recém-vinculado ao longo e inspeccionar cuidadosamente os pontos de contato para garantir queuma vedação estanque foi formado entre as duas placas de Petri.
- Se uma vedação hermética não tem completamente formado, injectar 0,5 ml de cloreto de metileno através do furo 3 de passagem mm, com uma pipeta de transferência. Pegar o prato e gentilmente gire-a para permitir que o cloreto de metileno para alcançar a borda.
NOTA: Se rodado demasiado rapidamente, o cloreto de metileno pode derramar para dentro da parte exterior do prato de 150 mm, a deformação da superfície onde as células irão crescer e estragando o anel de corte. Vazamento de anéis de corte deve ser descartada. - Vedar o furo na placa de 100 mm x aplicando um cordão de 3 milímetros de vedante de borracha de silicone.
- Usando uma ferramenta rotativa equipada com uma cabeça de corte plana, corte a parte superior 3 cm de um tubo de cultura de tecidos de poliestireno de 15 ml cônico, deixando pelo menos 1 cm do tubo abaixo do limite. Polir a ponta do tubo cortado até ficar lisa e plana com o lado plano da cabeça de corte. Remover quaisquer aparas de plástico produzidos por trituração.
- Traçar as cortadas tubo de 15 ml para atampa da placa de 150 mm, com um marcador, aproximadamente 0,5 cm de distância da borda do prato. Perfurar um orifício no interior do círculo desenhado, deixando uma margem de aproximadamente 1-2 mm a partir da margem do círculo.
- Coloque o ponto de corte superior tubo cônico sobre o furo perfurado. Usando uma pipeta de transferência, aplicar cerca de 250 ul de cloreto de metileno para as extremidades cortadas do tubo cónica para ligar o tubo cónico com a tampa 150 milímetros.
- Selar a tampa 150 milímetros para o prato de 150 milímetros por aplicação de um cordão de um milímetro de espessura de vedante de borracha de silicone em torno da borda interior da parte superior uma placa de Petri.
2. Esterilização de cisalhamento Anéis
- Pipetar cerca de 10 ml de solução salina tamponada com fosfato para o anel de corte recém-formada através da porta 15 ml tubo cónico. Giram em torno de remover todos os detritos no interior do anel de cisalhamento. Remover a solução salina tamponada com fosfato com uma pipeta de Pasteur aspirador / vácuo.
- Repita o passo anterior até detritos é removido.
- para Sterilize o anel de corte, utilizar uma combinação de uma lavagem com etanol a 70% com irradiação UV.
- Desapertar a tampa ventilada, pipeta cerca de 10 ml de etanol a 70% através da porta de acesso e aparafusar a tampa. Rodar e virar sobre o anel de cisalhamento várias vezes, assegurar que o interior do anel de corte é cuidadosamente lavado.
- Sob um exaustor, aspirar o excesso de etanol a 70%. Com um frasco de spray, spray completamente o orifício da tampa e acesso com 70% de etanol.
- Coloque o anel de cisalhamento e cap sob radiação UV na capa de cultura de tecido até que esteja completamente seco.
- Depois de seco, o parafuso novamente a tampa e armazenar esterilizado anéis de cisalhamento à temperatura ambiente até ser usado no chapeamento de cultura de células.
3. Estudos tensão de cisalhamento
- Placa células endoteliais em anéis de cisalhamento esterilizado seguindo o protocolo padrão de cultura de células, tipicamente utilizando uma proporção de 1: 4 dividido por linhas de células endoteliais transformadas.
NOTA: Rat microV retinalcélulas endoteliais ascular foram obtidos comercialmente. células células endoteliais do cérebro humano (hCMEC / D3) foram fornecidos como uma generosa oferta do Dr. Pierre-Oliver Couraud (Inserm, França) e foram cultivados em meio basal endotelial completo (EBM). - Permitir culturas para atingir confluência antes do início dos estudos de fluxo. Utilizar 30 ml de meio de cultura de tecidos (soro de vitelo fetal a 10%, meio de Eagle modificado por Dulbecco com 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina). Mudança do meio de cultura de células a cada 3 dias e manter as células a 37 ° C com 7,5% de CO2 e 92,5% de ar ambiente.
- Coloque o agitador orbital na incubadora.
Nota: agitadores orbitais são tipicamente pesada (> 10 kg). Coloque o agitador orbital na prateleira inferior da incubadora para minimizar o stress prateleira e vibração. - Coloque os anéis de cisalhamento experimentais no agitador orbital. Coloque anéis grupo controle de cisalhamento estático dentro da mesma incubadora.
- Estimar a tensão máxima de cisalhamento dentro do shbrinco com a equação
Onde 
é o raio de rotação do agitador orbital (em cm), 
é a viscosidade do meio (em poise), 
é a densidade do meio (em g / ml), e 
é a frequência de rotação (em rotação / seg) 24. - Inicia-se a configuração de rotação sobre o agitador orbital à rpm desejado (por exemplo, 90 rpm), deixando os anéis de cisalhamento no agitador durante a duração desejada de aplicação de esforço de cisalhamento (por exemplo, 72 horas).
NOTA: agitadores orbitais pode produzir calor, de modo que a temperatura da incubadora deve ser monitorizado inicialmente para garantir que 37 ° C é mantida durante toda a duração da experiência. Alternativamente, sanéis HEAR pode ser transferido para as câmaras ambientais (por exemplo, câmara incubador modular) e depois colocadas dentro de uma incubadora rotativa. - Depois de as camadas de células foram expostas a resistência de corte durante o período de tempo desejado, remover anéis de cisalhamento da incubadora. Retire a tampa anel de cisalhamento e recuperar as células e / ou meios para examinar ponto final desejado análises (por exemplo, Western blot, fluorescência activado separação de células, etc.) 25.
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Representative Results
Aqui nós apresentamos resultados representativos, tanto das células endoteliais do cérebro hCMEC / D3 e do rato monocamadas de células endoteliais microvasculares da retina, cultivadas em anéis de cisalhamento.
Depois de se deixar hCMEC / D3 monocamadas de células endoteliais do cérebro a crescer até à confluência em EBM completo, os anéis de cisalhamento foram colocadas num agitador orbital durante 72 horas. Usando a equação do passo 3.5, a tensão de cisalhamento máxima calculada 
foi cerca de 2,8 dines / cm2 (com parâmetros 
= 0,95 cm, 
= 0,0101 poise, 
= 0,9973 g / ml de 24, 
= 1,5 rotações / segundo ). Verificou-se que estas monocamadas de células endoteliais, por vezes, apresentam alinhamento em paralelo com a direcção do fluxo periódica (Figura 3), embora isso não seja uniformemente observado porque as camadas de células, normalmente têm uma excelente adesão à superfície do anel de corte ao longo do estudo.
Depois de permitir que as da retina monocamadas de células endoteliais microvasculares de rato a crescer até à confluência em meio de células endoteliais de rato completo, incluindo o EGF / VEGF de factores de crescimento suplementos, os anéis de cisalhamento foram colocadas num agitador orbital durante 72 horas. Usando a equação do passo 3.5, a tensão de cisalhamento máxima calculada foi cerca de 12 dines / cm2 (com parâmetros = 0,95 cm, = 0,0101 poise,iles / ftp_upload / 54632 / 54632eq4.jpg "/> = 0,9973 g / ml 24, = 4 rotações / segundo). A Figura 4 mostra que, em comparação com o controlo de carregamento da β-actina, houve uma perda grande e significativa da molécula de adesão celular endotelial plaquetária (PECAM-1 / CD31) a partir da superfície de células endoteliais.
PECAM-1 é uma proteína da membrana integral, que é um membro da imunoglobulina (Ig) -superfamily que contém um motivo inibidor dependente da tirosina imunorreceptor ou 'ITIM' 26. PECAM-1 não é expresso apenas em células endoteliais, mas também é encontrada em células hematopoiéticas. PECAM-1 desempenha um papel significativo na adesão célula-célula endotelial, de leucócitos juncional transmigração, a sinalização celular, e mais importante, mecano-transdução de tensão de cisalhamento. O papel de PECAM-1 no sensor de tensão de corte é crítica para as funções de endotheli vascular células da Al e homeostase 17. Quando as monocamadas endoteliais são expostas a tensão de corte, PECAM-1 responde directamente à força mecânica exercida sobre ele, alterando a sua fosforilação da tirosina, e a subsequente activação da ERK1 / 2 cascata de sinalização 27. Além disso, o PECAM-1-eNOS complexa associação é interrompida por distúrbios na tensão de cisalhamento 28. Portanto, PECAM-1 activa as células endoteliais vasculares para detectar alterações na força de tensão de cisalhamento de fluidos que podem conduzir à dilatação reactivo da parede do vaso 29.
Estes dados suportam este modelo mostrando que as células endoteliais responder à exposição a periódica de cisalhamento de fluidos, unidirecional por-down regulando um juncional importante e determinante adesiva, que media o contato intercelular bem como o intercâmbio celular transvascular.
632fig3.jpg "/>
Figura 3. morfologia de células endoteliais de cérebro de um anel de corte. O aparecimento de monocamadas de células hCMEC / D3endothelial em anéis de corte seguinte de 48 horas de cisalhamento de fluidos periódica ou exposição estática. Alinhamento de culturas nem sempre é observado paralelamente à direção de fluxo (indicado pela seta). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. respostas celulares para cisalhamento periódica. Rat microvasculares da retina monocamadas de células endoteliais cultivadas em anéis de cisalhamento Houve uma redução na PECAM1 / CD31 em relação a p-actina (n = 3 cada, estudantes teste t não emparelhado, * -p <0,05, barras de erro referem-se ao desvio padrão), após 72 horas de karité periódica fluidor em anéis de cisalhamento.
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Discussion
A construção do sistema de anel de corte durante a exposição das células endoteliais de cisalhamento é uma abordagem simples para realizar estudos de tensão de cisalhamento. No entanto, existem alguns passos que são críticos para a obtenção de anéis de cisalhamento superiores e melhores resultados. A vedação completa deve ser feita entre o anel interno e externo para evitar que materiais de vazamento que poderia criar tensão de cisalhamento inconsistente entre as amostras. Se a vedação não é feita, uma quantidade mínima de cloreto de metileno deve ser adicionado à borda entre o prato interior e exterior com uma pipeta de transferência através do orifício no interior do anel. Rotação suave do anel deve permitir que o cloreto de metileno para formar uma vedação completa. Além disso, aparas de plástico, inadvertidamente, produzidos a partir de corte pode estar presente na pista do anel de cisalhamento e enxaguar o anel de cisalhamento após a construção deve remover quaisquer detritos que podem afetar adversamente o crescimento celular e dar aplicação tensão de cisalhamento inconsistente.
os sanéis HEAR descritos no artigo são relativamente grandes em tamanho, que conduz a um elevado volume de produção por amostra. No entanto, versões mais pequenas pode ser construído usando pequenas placas de Petri (por exemplo, de 100 mm de prato de Petri com uma inserção de 60 mm). Construindo múltiplos anéis de corte menores podem permitir a números mais elevados de estudo replica mantendo ainda relativamente grandes volumes de fluido e áreas de superfície, por exemplo, quando comparado com outros métodos.
Algumas questões têm sido observados quando se usa anéis de cisalhamento. Em primeiro lugar, alguns agitadores orbitais produzem quantidades excessivas de calor, e algumas incubadoras deixar de controlar este aumento de temperatura. Isto pode ser evitado através da selecção adequada dos rotadores e da utilização de incubadoras encamisados não em água, que a troca de calor muito mais facilmente. contaminação da cultura é outra preocupação potencial quando usando anéis de cisalhamento, especialmente após a montagem em um ambiente ao ar livre. anéis de cisalhamento devem ser cuidadosamente esterilizados antes da utilização.
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Disclosures
J. Winny Yun tem uma bolsa de investigação desde a fundação Annette Funicello. J. Steven Alexander tem suporte pesquisa do Departamento de Neurologia, LSUHSC-S.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a assistência do Sr. Christopher Nguyen, Aaron Hunter eo Shreveport Jumpstart, inteligente e programas de treinamento biostart, bem como o departamento de Centenary College of Louisiana de Biofísica, Shreveport, LA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass Petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15 ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 ml transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
References
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