Summary
ショウジョウバエの幼虫は、行動の神経制御を研究するための強力なモデル系です。この刊行物は、反復的なクロールの動作中に幼虫構造のダイナミクスを定量化するために、線形クロールとメソッドの持続的な発作を誘発するリニアアガロースチャネルの使用を記載しています。
Abstract
ショウジョウバエの幼虫のクロールは、感覚運動行動の神経制御を研究するための強力なモデルとして浮上しています。 、一時停止回し、および蛇行：しかし、平らな開口面上の幼虫のクロールの動作には、複雑です。動きのレパートリーで、この複雑さは、単一のクロールストライドサイクル中に発生したイベントの詳細な分析を妨げます。この障害を克服するために、リニアアガロースチャンネルはストレート、持続的な、リズミカルなクロールに幼虫の行動を制約すること行われました。アガロースチャネルおよびショウジョウバエ幼虫の体は両方の光学的に透明であるため、原理的には、遺伝的にコードされた蛍光プローブにより標識幼虫構造体の動きはそのまま、自由に移動幼虫でモニターすることができます。過去には、幼虫は、線形チャネルに入れ、生物全体のレベルでクロール、セグメント、および筋肉を1分析しました。将来的には、チャネルにクロール幼虫神経を監視するために、カルシウムイメージングのために使用することができますNALの活動。また、これらの方法は、任意の遺伝子型の幼虫を、任意の研究設計のチャネルに使用することができます。したがって、以下に示すプロトコルは、モータ制御を理解するためのモデルとしてショウジョウバエの幼虫を用いた研究のために広く適用可能です。
Introduction
この方法の全体的な目標は、具体的にショウジョウバエの幼虫のクロールを研究することです。運動の実験は、モータ制御2上の理論を開発およびテストに重要な役割を果たしてきました。伝統的に運動は、水生動物（ 例えば 、リーチ、ヤツメウナギ、オタマジャクシ）3で検討されています。これらの動物における歩行運動の反復性は、歩行運動を駆動する生物物理学的事象の分析のための、および移動を伴う神経発火パターンを監視するため、rhythmogenesisの研究を可能にしました。
容易な遺伝学、よく特徴付け開発、第一および第二齢で光学的に透明で本体と、全体の継続的な透過型電子顕微鏡再建：運動の研究のためのショウジョウバエの幼虫の使用は、他のモデル系に勝る利点のユニークな組み合わせを提示します神経系4-6。しかし、 ショウジョウバエの幼虫のロコフラットオープン表面上の動きが、ポーズを含めやや複雑ですなり、蛇行は7をクロールします。このマニュアルでは、幼虫が持続的な、ストレート、リズミカルなクロールの動作を実行するように、ショウジョウバエ幼虫の運動行動を導くために、線形アガロースチャネルを使用する方法を提示します。
アガロースチャネルにおけるショウジョウバエ幼虫の行動を学ぶのではなく、平らな開口面での動作、いくつかの利点を有しています。まず、研究者は、具体的に幼虫の行動レパートリーの一部である多くの動きからクロールの動作を選択することができます。第二に、幼虫の体の大きさに対してチャネルの幅を調整することにより、クローリングの速度を調整することができます。第三に、チャネルは、幼虫は幼虫がロードされ、チャネル内に配向されている方法に応じて背側、腹側、または側面から見ることが可能になります。幼虫の向きでこの汎用性は、クロール時に継続的に見えるようにする目的の任意の構造を可能にします。第4、チャネルは、顕微鏡や目的の広範囲で使用するために適しています。例えば、直線状のチャンネルが明視野ステレオスコープに及び/又はスピニングディスク共焦点顕微鏡1の高解像度画像化のために低解像度イメージングのために使用することができます。第五に、この方法は、任意の遺伝的バックグラウンドに光遺伝学/熱を生じるニューロンの操作と組み合わせて使用することができます。最後に、理由幼虫（第1、第2齢で）体とアガロースチャネルの両方は、ダイナミックな動き、または遺伝的にコードされた蛍光プローブにより標識幼虫構造の蛍光強度の変化を研究する際のチャネルを使用することができ、光学的に透明です。
記載の方法は、第1および第2齢ショウジョウバエ幼虫の動作の詳細な運動学的研究に適しています。この刊行物は、チャネルの使用を実証するために、前方幼虫のクロール時にCNSの蛍光強度の動的変化を分析し、前駆体としてNEUしますRONALカルシウムイメージング。
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Protocol
幼虫の調製
- 一週間の行動を記録する前に、クロス（25処女と5人の男性の最小値）を設定します。 25℃でのすべての十字架と子孫を維持します。
注：培養条件の温度を変更することができるが、以下に記載のタイムラインは、発生速度の変化を考慮して調整される必要があります。 - 5日午前中に、最初のものを記録する前に、寒天/ジュースキャップおよび寒天/ジュースキャップの中央に酵母ペーストのDAB（0.5〜ml）で収集ケージにクロスを配置します。
- コレクションケージを作成するには、6オンスに穴を突きます。正方形のポリエチレンショウジョウバエボトル 。
- 寒天/ジュースキャップを作るために、三角フラスコに600ミリリットルの水で寒天の18グラムを混ぜます。 200ミリリットルのリンゴジュースを持つ別のフラスコミックス20グラムのスクロース中。固形物が溶解するまで電子レンジ。混合物を60℃に冷却し、合わせ、撹拌します。 95％エタノール20ml中の10％メチル-p-ヒドロキシ安息香を追加し、攪拌します。追加〜735×10ミリメートルラウンドペトリ皿の下半分にミリリットル。寒天/ジュースはRTで1時間固化することができます。 4℃で保存。
- 酵母ペーストを作るために、ボリューム乾燥酵母と水によって等しい部分を追加します。 4℃で保存。
- 幼虫コレクションの正常性を確認してください。
- 午前中、4日および3日記録する前に、キャップを取り外し、ケージの新鮮なキャップを配置します。 24時間の卵の収集と孵化幼虫を得るために、毎日同じ時刻にキャップを変更します。
- 各キャップを除去した後、クロスが敷設されているどのように多くの卵を参照することを確認します。 500〜2,000の卵の間で期待しています。必要に応じて、大人の数を調整します。
注：いくつかの卵が幼虫に孵化している必要があり、新たに孵化した幼虫は、離れた酵母ペーストから発見されます。 - 24時間ごとのキャップを熟成。幼虫が健康であるかどうかを判断するためのキャップを再検討します。
注：ほとんどの卵が幼虫に孵化しているはず、と幼虫はあなたがたの中にクロールしている必要がありますASTペースト。体調不良の兆候は、免疫反応を示し、未孵化卵、離れた酵母ペーストから死んだ幼虫の体、および腹部の大幅な暗いパッチを適用した幼虫が多数含まれています。幼虫はケージを変更し、不健康な場合は、新鮮なキャップ/酵母ペーストを行い、遺伝子型を確認してください。 - 古いキャップを廃棄します。
- 行動の記録のための幼虫を収集します。
- 記録前の2と1日の両方で、キャップを除去し、新鮮なキャップと交換します。
- 各削除キャップにラベルを付け、25℃で維持します。これは、行動の記録のための幼虫の段階的なシリーズを生成します。孵化したばかりの（0-4時間の孵化後）からの第二齢（24〜48時間の孵化後）から幼虫がチャネルで使用することができます。連日記録のためのキャップを保存します。
- 48時間後にすべてのキャップを捨てます。
- 必要に応じて、最大5追加日間1.4.1-1.4.3手順を繰り返します。その少数の受精卵後に生成されます。
- リニアチャネルPDMS（ポリジメチルシロキサン、シリコーンエラストマー）鋳型（ 図1A）を準備します。金型を鋳造PDMSは、要求に応じてヘクシャーラボから入手可能です。
- イソプロピルアルコールで鋳型をきれいにしてください。空気乾燥、DAB実験用ワイプで乾燥、または缶詰空気を使用しています。
- 10センチメートルシャーレのふたまたは他の容器に鋳型を配置します。
- 準備し、アガロース溶液を注ぎます。
- 完全に溶解するまで電子レンジ加熱することにより、水中の3％アガロース溶液（100ミリリットルで3グラム）を作成します。
- 気泡が表面に上昇させ、55℃に冷却します。
- 金型がちょうど覆われるように、鋳型を含むペトリ皿にアガロースの混合物を注ぎます。固化するまで、アガロースセットをしてみましょう。
- 鋳型からアガロースチャンネルを削除します。かみそりの刃でアガロースディスクの縁をトリミングします。
- チャネルを入れて水に浸漬し10センチメートルペトリ皿中の。これらは、7日間、4℃で保持することができます。
レコード行動にチャンネルに幼虫のロード3
注：4°Cでのチャンネルを保存する場合は、チャンネルは行動記録のために使用する前に室温に来ることができます。
- ステップ2（ 図2A）で製造されたものから単一のチャネルを切断するためにきれいなカミソリの刃を使用してください。
- カバーガラス（ 図2B）のチャンネル溝の側を上向きにして配置するためにピンセットを使用してください。カバーガラスの大きさや厚さは、イメージングのために使用される特定の範囲に依存します。
- ステップ1で調製した寒天/ジュースキャップから幼虫を選択して、切断されたチャネル（ 図2C）に配置するために微細な鉗子を使用してください。
- 幼虫を圧迫しないでください。鉗子の歯の先端で穏やかにそれを拾います。細かい点で絵筆で幼虫を操作することも可能です。
注：幼虫は非常に銭であるため、これは重要です触れてsitive。彼らは注意して取り扱われていない場合、侵害受容応答は、実験の最初の数秒の間に彼らの行動を支配する可能性があります。 - 簡単に水に沈めることによって幼虫を洗ってください。
- カットチャネルに幼虫を配置した後、軽くチャネルの木立の中に幼虫をいじめるために鉗子タインの先端を使用します。
注：ほとんどのアプリケーションでは幼虫の幅とチャネルの幅が一致している必要があります。開発のさまざまな段階での幼生の平均幅は次のとおりです。0時間の孵化後- 140μmで、24時間の孵化後- 180μmで、48時間の孵化後- 320μmで、72時間の孵化後- 500ミクロン、96時間孵化後- 750μmの8。以下の幅で来るチャンネル：100、150、200、250、および300μmであり、すべてのチャネルが150μmの深さ。 - チャネル内の幼虫の位置を調整するために鉗子タインや絵筆の先端を使用してください。これは、任意の方向に配向させることができる。腹画像化されるべきもの構造に応じて、一方の側に、腹、腹上下。
- 幼虫を圧迫しないでください。鉗子の歯の先端で穏やかにそれを拾います。細かい点で絵筆で幼虫を操作することも可能です。
- 鉗子を使用して、そっと幼虫はカバーガラス上に今あるようなの上にチャネルを反転させます。それは水（ 図2D）で満たすようにチャネルの両端に水の1または2滴を置きます。
- 静かに気泡を除去するために、チャネルの側面を持ち上げます。
- 幼虫の向きを調整します。これを行うには、そっと幼虫をロールバックするチャネルではなく、カバーガラスを微調整。これは向きを変更しない場合は、カバーガラスを削除し、幼虫の位置を調整します。幼虫は、画像化する準備ができました。
- 画像倒立顕微鏡上のチャネル/カバースリップ。正立顕微鏡でのイメージング場合は、単にチャンネル/カバースリップを反転。
行動記録への関心の4測定機能
- 関心のある構造（ 例えば 、尾、CNS）の場合は、 例えば （関心のある特徴を測定します経時的な蛍光強度、場所）。
注：このような頭と尾のような構造を手動で注釈を付けることができます。例えば、ヘッドは濃いH状口フックを含むものとして識別することができ、そして尾部は後部気管spiriclesを含むものとして同定することができます。本稿では神経索に焦点を当てています。蛍光中枢神経系（CNS）をラベルするためにUAS-MYR-GFP導入遺伝子（ELAV> GFP）9,10を駆動するために神経GAL4ラインELAV-GAL4を使用してください。 CNSは、後方（ 図3）にまで及ぶ神経索に取り付けられた2つの前方脳ローブが含まれています。 - 各時点（T）での神経索（F（NC））の画素の強度を測定します。以下の手動注釈のアプローチを説明していますが、この手順を自動化することができました。
- フィジー（または類似のソフトウェア）の「分析」メニュー内の平均グレー値とSLICを報告するために、「測定の設定...」ダイアログボックスを使用します電子位置。
- 手動映画（ 図3）の最初のフレームにおける神経索の中央にボックスを描画します。このステップは、画像セグメンテーションと登録アルゴリズムで自動化することができました。
- 関心の箱入りの領域における平均画素強度を報告するために「分析」メニューの「測定」コマンドを使用します。これは、「結果」ウィンドウを生成します。
- 次のフレームでは、手動で矢印キーを使用してサイズ変更することなく、ボックスを再配置します。再び「メジャー」コマンドを使用します。更新された結果は、「結果」ウィンドウに表示されます。関心の各フレームに対して、この手順を繰り返します。
- ファイルメニューから「結果」は、「名前を付けて保存...」を使用してコマンドを保存します。結果は、.xlsファイルとしてエクスポートされます。
5.測定値を分析
- 0及び1（Z（t）の間の値にそれぞれFを（NC）の値を正規化</ em>の）。
- スプレッドシート（または他のプログラム）では、Results.xlsファイルを開きます。このファイルには、フレーム番号および平均蛍光強度を表す2つの列があります。
- 新しい列を作成し、式Z（t）は正規化された蛍光値を生成する（[NC] F）は、f（NC [トン]）-min（F [NC]）/最大（F [NC]）-min =を使用各時点に対応します。
- 記録の各ストライドのためのストライド期間を決定します。
注：ストライドサイクルは前進のための反復的な全身運動の単位です（リバース）クロール。慣例により、このような腸やCNS 1と尾、頭、および他の内臓の前方への移動と前方ストライド開始（および終了）。- 手動で各ストライドの開始時間（i）を行動記録を検査し、記録する（I（ストライドサイクル[N]））。
注：以下の例では、前方への移動CNSの歩幅サイクルの開始（ 図3）を用いました。 - 各ストライドのための期間を計算する：Δはトン（ストライドサイクル）= I（ストライドサイクル[N + 1]）-i（ ストライドサイクル[N]）。
- 手動で各ストライドの開始時間（i）を行動記録を検査し、記録する（I（ストライドサイクル[N]））。
- 記録の各時点での経過ストライドサイクルの割合を計算します。
- ストライドサイクル（C）の開始からの経過時間を表すスプレッドシートファイルに追加の列を作ります。設定した時間、各ストライドの開始時にゼロにストライド開始以来（C（ストライドサイクル[N]）= 0）。それに応じて開始後の時間を調整します。
- 経過経過％のストライド・サイクル（％ストライドサイクル）を表すスプレッドシートファイルに追加の列を作るストライド期間によって調整された時間を分割し、ストライドサイクルのパーセンテージに変換するために100を掛け：％ストライドサイクル =（C（ストライドサイクル[n]を））/（Δtの（ストライドサイクル）* 100）。
6.ポーラーを生成クロールサイクルにわたって利息の構造のダイナミクスを表現するためにプロット座標
- MATLABでは、更新Results.xlsをインポートするには、[ホーム]タブの[データのインポート」ダイアログを使用します。
- パーセントストライドサイクル値（％ストライドサイクル）を含む新しい配列「シータ」を作ります。 （var1が％ストライドサイクルを表す「シータ= VAR1 "）。
- 新しいアレイ「ロー」を作る正規化された蛍光値（Z（t）を ）が含まれています。 （VAR2は、z（t）を表し、「ロー= VAR2」）。
- 角度パーセントストライドサイクル、および半径（「polarplot（シータ、ロー）」）としての蛍光と極座標プロットを作るために「polarplot 'コマンドを使用します。
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Representative Results
この記事では、アガロースチャネルを使用してショウジョウバエ幼虫の行動を案内するとクロールサイクルにわたって幼虫構造のダイナミクスを測定する方法を説明します。リニアチャンネルにおける幼虫は、リズミカルなクロール（ 図3）の持続的な発作を行います。幼虫とチャネルの両方が光学的に透明であるので、チャネルは、関心のある任意の構造で表さ蛍光プローブを発現する幼虫を使用することができます。 （ELAV-GAL4 / +; UAS-MYR-GFP / +）私たちはすべてのニューロンにGFPを発現する幼虫を記録し、クロールサイクルにわたる神経索における蛍光強度の動的変化を監視しました。私たちは、CNSは、幼虫の頭と尾（ 図4A-B）のように前方にほぼ同時に移動させることを示しています。筋収縮の波が体軸に沿って通過すると、CNSは、神経索の蛍光は（ 図4）を変更させることで、フォーカスの平面から移動します。ちゃんを定量化しますいくつかの動物のいくつかの進歩のための神経索の蛍光強度のGESは、我々は極座標プロット（ 図4C）上のデータを表します。極座標プロット上のデータをプロットすると、ストライドサイクルにわたる神経索蛍光のダイナミクスが再現可能なパターンに従っていることを示しています。
図1： ショウジョウバエの幼虫クロールの動作をガイドするリニアチャンネルの設計 （A）線形アガロースチャンネルを作るために使用されるマイクロ流体デバイスの設計が示されています。このデバイスのチャネル幅は50μmの単位で、100〜300ミクロンごとに異なります。深さは150μmです。 （B） ショウジョウバエの幼虫を、アガロースのチャネルにロードされます。背側のビューは、右の前部（ヘッド）で示されています。スケールバー=200μmです。4892 / 54892fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：チャンネルに幼虫をロードする方法を説明するための図詳細については、プロトコルセクション3を参照してください。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。図3：持続アガロースチャネル内に置かれたときに左側に蛍光標識したショウジョウバエの幼虫が行い、リズミック、リニアクロールは 、すべてのニューロンにGFPを発現する幼虫の概略（ELAV> GFP）が示されています。ボックスは、神経索の蛍光強度は、（そのによって識別領域を示します長尺形態）を測定することができます。右側には1秒間隔でチャネルを介してクロール幼虫の一例です。背側のビューは、前方を上にして示されています。矢印は、ストライドの開始を示しています。スケールバー=200μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：クロールサイクルにわたって神経索における蛍光変化のダイナミクスは、プロットを極座標で表示されている （A）単一のストライドの図。パーセンテージは、完成したストライドサイクルのパーセントを参照してください。テール、ヘッド、およびそのようなCNSなどの内臓の慣例前進することにより、ストライド（またはストライドサイクルの0％）の開始をマークします。 CNS（白）は上下だけでなく、前方と後方に移動することに注意してください。側は争いますWが右に前方で示されています。 （B）カイモグラフは、頭、尾、およびCNSの動きを示しています。ストライドサイクル中の神経索の蛍光強度が動的であることに注意してください。 （C）極座標プロットは、歩幅サイクルにわたる神経索の正規化された蛍光強度の動的な変化を示しています。各点は、単一の時点（n = 3の幼虫、3ストライドずつ）での単一の幼虫の正規化された蛍光強度を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
マイクロ流体デバイスは、 ショウジョウバエの幼虫（ 図1）を収容することができるリニアアガロースチャンネルを作るために建てられました。 ショウジョウバエの幼虫は、これらの線形アガロースのチャネル内に配置されている場合、それらの行動レパートリーは、クロールサイクルにわたる幼虫構造のダイナミクスの詳細な観察を可能にする、クロールに限定されています。
幼虫は、リズミカルなストライド（ 図3）のシリーズを実行すると、成功した記録が発生します。これが発生しない場合、チャネル内の気泡のような障害物をチェックし、幼虫の状態をチェック。成功した記録のもう一つの重要な要素は、幼虫は、関心の構造を可視化するために最適に配向されることです。幼虫が正しい向きにされていない場合は幼虫がチャネルのうちクロール場合、または、単にカバースリップを削除し、幼虫を再マウントします。我々の経験では、〜幼虫の20％は、当初、収率優れた行動の記録を取り付けられwithouトン調整。
過去には、測定値は、そのような行動をクロール時に口のフック、腸、および腹部のセグメントとして幼虫の構造物の位置を撮影しました。クロール歩幅周期にわたってこれらの構造の動きを可視化するために、極座標プロットを生成しました。本論文では、神経索の蛍光強度を測定し、極座標プロットは、クロールストライドサイクル（ 図4）の上に蛍光の動態を可視化するために使用します。極座標プロット上のデータを表すには、いくつかの利点があります：それは変数としてクロール速度を排除し、それは多くの動物や多くのストライドからのデータを要約することができ、それが全体的な傾向とデータ11の変化の両方の可視化を可能にします。特に、目的の任意の蛍光標識された構造のダイナミクスを測定することが可能です。原則的に、この分析は、クロールサイクルにわたって生じる動的な変化の任意のタイプの追跡にも適用可能です。 この論文に記載された方法のための用途の広い配列があります。過去には、線形アガロースチャネルは全生物、セグメントと個々の筋肉レベル1での幼虫の行動を記録するために使用されてきました。これらのデータは、幼虫が両方の前方には、「内臓-ピストニング」機構を使用して、クロール逆転することを示した、と彼らは神経筋機構が前方の両方を駆動させ、1を決定するクロール逆。将来的には、研究者らは、異なる遺伝的背景にクロールを勉強するチャネルを使用することができます。また、クロール時にカルシウムイメージングを使用して、幼虫のニューロンの活性を分析するためにチャネルを使用することが可能であるべきです。これは、ニューロンがクロールサイクルの特定の動きと同位相で発火するの理解につながるはずです。最後に、チャネルはこの論文で提示線形設計に従わなければならない理由はありません。寸法の異なるチャネルを使用することは間違いなく、VARにお答えしません全体として、 ショウジョウバエの幼虫運動とモータ制御についての質問のiety。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 oz square Drosophila bottle | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sucrose | sigma | S9378 | |
| apple juice | not from concentrate | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | methyl-p-hydroxybenzoate |
| 35 x 10 mm round petri dish | Fisher | 351008 | |
| baker's yeast | |||
| PDMS casting mold | FlowJem | can be requested from authors | |
| Isopropyl alcohol | Fisher | A417-1 | |
| laboratory wipes | Fisher | 06-666-11 | |
| canned air | Fisher | 18-431 | |
| 10 cm petri dish | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agarose | Fisher | 50-444-176 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| forceps | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 cover glass, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fiji (version 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
References
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