ACT-PRESTO: Biological Clearing tessuti e Metodi immunomarcatura per Volume Imaging

Una delle sfide nel campo delle neuroscienze è la visualizzazione di cablaggio del circuito neuronale e le cellule individuali all'interno di tessuto cerebrale intatto. Fino a poco tempo, dimostrando le connessioni tra i neuroni in questo modo richiesto 1) sezionamento serie di tessuti; 2) l'etichettatura molecolare di obiettivi specifici, come gli assoni o proteine; e 3) la visualizzazione per la ricostruzione 3D di tutto il cervello attraverso la registrazione di calcolo o l'allineamento di immagini seriali 2D ^1. Questi passaggi sono laboriosi, richiedono una grande quantità di tempo, e rischiano di perdere informazioni durante il sezionamento e l'etichettatura, rendendo la mappatura della rete neuronale estremamente difficile. Tuttavia, sono stati sviluppati molti metodi che consentono la visualizzazione del tessuto intatto senza sezionamento. Tessuti biologici possono essere resi otticamente trasparente mediante tecniche tessuto sgombero ^2-10. Uno dei principali metodi è quello di ridurre le differenze di indice di rifrazione tra il tessuto intatto e la soluzione di immersione in ordineper ridurre la dispersione della luce nel tessuto intatto, rendendo così il tessuto trasparente e consentire l'osservazione delle strutture profonde. Alcuni tipi di soluzioni ad immersione hanno proprietà idrofobiche, che determinano quenching fluorescente veloce durante la procedura di disidratazione. Pertanto, tali metodi non sono compatibili con l'imaging a fluorescenza per un lungo periodo di tempo ^11,12. Invece di reagenti idrofobiche, altri metodi utilizzano reagenti idrofili per la compensazione dei tessuti, come ad esempio SeeDB ⁴ e Sca l e ^6, che mantengono le informazioni strutturali e fluorescenza del ^4,6,8 tessuto biologico. Tuttavia, macromolecole, compresi gli anticorpi, non possono raggiungere il nucleo di tessuto intatto sola diffusione. Pertanto, la pre-etichettatura delle molecole bersaglio in zone profonde dei tessuti densamente imballati è tecnicamente impegnativo.

In un metodo tessuto-clearing recentemente sviluppato, CLARITY ^3, a i tessuti biologici idrogel-embeddeds formate con acrilammide, e lipidi vengono rimossi mediante elettroforesi in sodio dodecil solfato (SDS) soluzione -contenenti. Il campione viene quindi immerso in una soluzione con un indice di riflessione di corrispondenza per ridurre la luce dispersione ^3. Il sistema di rimozione dei lipidi è stato successivamente modificato in CHIAREZZA avanzate ¹³ e PACT (tecnica chiarezza passiva) ^10. Dopo la polimerizzazione, catene di acrilammide reticolare con le proteine, formando idrogel-tessuto. componenti lipidici non può reticolare con acrilammide; pertanto, lipidi possono essere eliminati mediante elettroforesi in tampone SDS contenente. Attraverso l'eliminazione attiva dei lipidi, tessuto cerebrale aumenta marcatamente in trasparenza ^9. Tuttavia, questi metodi non affrontano l'impossibilità di profonda etichettatura per diffusione libera. Per superare questa limitazione, sono necessarie tecniche di trasporto attivo di reagenti nelle parti più profonde dei tessuti spessi.

Anche se CHIAREZZA permette compensazione dei tessuti e dei tessuti profondivisualizzazione, non è una procedura semplice e veloce. Si può richiedere diverse settimane per cancellare un intero ^7,14 cervello di topo. compensazione rapida dei tessuti è essenziale per l'applicazione di tali metodi per impostazioni di base o clinica di laboratorio per la ricerca delle scienze della vita o la diagnosi del volume. Il protocollo attuale prevede una procedura semplificata per la liquidazione tessuto biologico e l'individuazione di proteine ​​successiva consegna da immuno-colorazione pressione assistita. È adatto per imaging volumetrico ad alta risoluzione di grandi depositato e 3D sistemi di elaborazione dei dati attraverso la combinazione con metodi di imaging.

Gli esperimenti sugli animali devono essere conformi a tutte le normative governative e istituzionali competenti.

1. Preparazione dei reagenti

1. Per la soluzione di idrogel monomero (A4P0): Aggiungere 20 g di acrilamide per 450 ml di 0.1x PBS (PBS) e regolare il volume a 500 ml con 0.1x PBS.
   ATTENZIONE: monomeri Acrylamide sono tossici. Eseguire tutte le procedure in una cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale, tra cui una visiera, un camice da laboratorio, guanti e scarpe chiuse.
   1. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere 100 mg di 2,2'-azobis [2- (2-imidazolin-2-il) propano] dicloridrato di 40 mL di soluzione di idrogel monomero (A4P0) in una provetta da 50 ml sotto cappa aspirante .
2. Per la compensazione tessuto elettroforetica tampone (ETC): Aggiungere 40 g di sodio dodecil solfato (SDS) e 12,37 g di acido borico a 800 mL di H ₂ O deionizzata (dH ₂ O). Regolare il pH a 8,5 con NaOH e regolare il volume di1 L con l'aggiunta di dH ₂ O.
   ATTENZIONE: SDS è una sostanza chimica nociva; Pertanto, maneggiarlo con cura.
3. Per la soluzione CUBIC montaggio: Aggiungere 250 g di saccarosio, 125 g di urea, e 125 g di N, N, N ', N' -tetrakis (2-idrossipropil) etilendiammina a 150 ml di dH ₂ O e portare il volume a 500 ml con dH ₂ O.

2. Preparazione del campione & Fixation

1. L'eutanasia del mouse.
   1. Preparare la alfaxalone (1 mg / kg) e xilazina (0,5 mg / kg) nella stessa siringa.
   2. Intraperitoneale iniettare la miscela di alfaxalone e xilazina e consentono 3 min per il mouse per perdere conoscenza.
   3. Attendere fino a quando il mouse anestetizzato non risponde più agli stimoli dolorosi, come un pizzico di coda, prima di procedere.
      ATTENZIONE: Seguire appropriate linee guida istituzionali per la gestione degli animali.
2. Transcardially profumato il mouse con 100 ml di NaCl allo 0,9% (pH 7,4-7,5) soluzionecontenente eparina (100 U / ml) per Exsanguinate, seguito da 100 mL di 4% paraformaldeide (PFA) in PBS 1x (pH 7,4) ^14.
   ATTENZIONE: soluzione PFA è tossico. La preparazione della soluzione PFA e tutte le successive manipolazioni deve essere condotta in una cappa aspirante e con dispositivi di protezione individuale.
3. Tagliare la testa del mouse, aprire la pelle, e rompere il cranio tra gli occhi con piccole forbici.
4. Rimuovere pezzi del cranio con piccoli, pinze curve.
5. Estrarre il cervello o organi desiderati.
6. Incubare il cervello e gli organi in post-fix 4% soluzione PFA a 4 ° C durante la notte.
   NOTA: Per regione specifica compensazione dei tessuti, sezionare la regione specifica o tagliare il tessuto dopo la fissazione dei tessuti.
   ATTENZIONE: soluzione PFA è tossico. La perfusione transcardial e tutte le successive manipolazioni del mouse devono essere condotte in una cappa aspirante e con dispositivi di protezione individuale.

3. Hydrogel monomero infusione e Polymerization

1. Incubare gli organi fissi in soluzione idrogel monomero A4P0 a 4 ° C per 12-24 ore con un leggero scuotimento.
2. Idrogel monomero-infuso polimerizzazione dei tessuti.
   1. Trasferire il campione in una provetta a fondo rotondo da 10 ml con 5 ml di soluzione di idrogel monomero. Avvolgere la parte superiore del tubo a fondo rotondo con parafilm.
   2. Rimuovere l'ossigeno dal tubo a fondo rotondo contenente tutta topo campione cervello idrogel infuso facendo gorgogliare azoto attraverso il liquido per 1 min. Rapidamente e chiudere ermeticamente la provetta contenente.
3. Trasferire la provetta in un bagnomaria (37 ° C) per 2 ore.
4. Lavare il campione polimerizzato brevemente con 0.1x PBS per rimuovere l'eccesso idrogel.
   ATTENZIONE: monomeri idrogel sono tossici. Per evitare il contatto della pelle con idrogel monomero, eseguire tutte le procedure in una cappa aspirante e con dispositivi di protezione individuale, tra cui una visiera, un camice da laboratorio e guanti.
   NOTA: polimerizzati tessutipossono essere memorizzati in 0.1x PBS contenente sodio azide per più di 2 settimane a 4 ° C.
   ATTENZIONE: sodio azide è altamente e tossicità acuta. Eseguire tutte le procedure in una cappa aspirante e con dispositivi di protezione individuale, tra cui una visiera, un camice da laboratorio e guanti.

4. elettroforetico tessuto Clearing (ETC)

1. Trasferire il campione polimerizzato ad un contenitore di tessuto e posizionare il contenitore tessuto nella camera ETC.
2. Riempire la camera ETC ETC con il tampone usando pompa peristatic.
3. Impostare le condizioni di ETC ed eseguire il ETC. Utilizzare le seguenti impostazioni.
   1. Per le impostazioni ecc per organi interi, utilizzare le seguenti impostazioni: (1,5 amp), la temperatura (37 ° C), il tempo (6,0 h), la velocità della pompa (30 rpm) in esecuzione.
   2. Per le impostazioni ecc per 1 a 2 mm di spessore fette di cervello del mouse, utilizzare le seguenti impostazioni: corrente (1,5 amp), la temperatura (37 ° C), il tempo (2,0 h), la velocità della pompa (30 rpm) in esecuzione.
4. Trasferimento tsi schiarì campione ad un tubo conico da 50 ml con 45 ml di PBS 0.1x. Lavare più volte campione eliminato con 0.1x PBS fino a quando non si vedono bolle quando il tubo viene agitato brevemente (per confermare la rimozione completa del SDS).

5. immunomarcatura di tessuti ACT-lavorati

1. Per topo intero cervello: incubare il campione in un volume di 3 ml di soluzione di anticorpo contenente PBS 1x, 6% di siero albumina bovina (BSA), 0,1% Triton X-100, e sodio azide 0,01% (Diluente anticorpo) con una diluizione fattore di 1/500 per tirosina idrossilasi (TH) anticorpo per 4 giorni a 37 ° C con agitazione delicata. Sostituire la soluzione di anticorpi a fine giornata 2.
   1. Lavare il campione in una provetta conica da 50 ml con 45 ml di PBS 0.1x per 3 - 5 h e modificare il buffer ogni ora.
   2. Incubare il campione in un volume di 3 ml di soluzione di diluizione di anticorpo con un fattore di diluizione di 1/500 di asino anti-coniglio 488 anticorpo secondario per 4 giorni a 37 ° C con agitazione delicata. Replasso le soluzioni di anticorpi diluito su giorno 2.
2. Per 1 a tessuto cerebrale a fette di spessore 2 mm: incubare il campione durante la notte o per un massimo di 1 giorno in una da 0,5 a 1 ml volume di soluzione di diluizione degli anticorpi con un fattore di diluizione di 1/500 di collagene di tipo IV anticorpo a 37 ° C con agitazione mite.
   1. Lavare il campione in una provetta conica da 15 ml con un volume di 12 mL di PBS 0.1x per 1-2 h. Modificare il buffer di ogni ora.
   2. Incubare il campione in una da 0,5 a 1 mL di una soluzione di diluizione di anticorpo con un fattore di diluizione di 1/500 per Cy3-coniugato anti-coniglio anticorpo secondario durante la notte o fino a 1 giorno a 37 ° C con agitazione delicata.
3. Lavare il campione in 0.1x PBS per 3-5 ore; modificare il buffer ogni ora.
4. Prima di imaging, incubare il campione in una quantità appropriata di soluzione cubi di montaggio per 1 ora a temperatura ambiente agitando delicatamente. Sostituire con soluzione fresca cubi di montaggio e incubare per un ulteriore 1 h.
   NOTA: 14. Pre-marcato tessuto può essere combinato con il immunomarcatura di altri due fluorocromi nel tessuto ACT-trattati.

6. immunomarcatura di Dense tessuti (PRESTO)

1. c-PRESTO
   NOTA: c-PRESTO è adatto per le piccole dimensioni dei campioni, come ad esempio tutta testicolo, tutto il rene, o piccole sezioni di organi più grandi.
   1. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 mL, aggiungere 500 ml di soluzione di diluizione di anticorpo con un fattore di diluizione di 1/500 per anticorpi collagene di tipo IV e centrifugare la provetta a 600 g per 2 h.
   2. Lavare il campione colorato con 0.1x PBS mediante centrifugazione a 600 g per 30 min.
   3. Aggiungere 500 ml di soluzione di diluizione degli anticorpi con un fattore di diluizione di 1/500 per l'anticorpo secondario anti-coniglio Cy3-coniugato e centrifugare a 600 g per 2 ore.
   4. Lavare il campione colorato con 0.1x PBS mediante centrifugazione a 600 g per 30 min.
2. s-PRESTO
   NOTA: s-PRESTO è adatto per i tessuti più grandi.
   1. Preparare una siringa (volume 30 ml) e collegarlo ad una valvola a 3 vie (Figura 1A). Colla la valvola con una pistola per colla per le condizioni di alta pressione (Figura 1B).
   2. Trasferire il campione nella siringa a 3 vie valvola collegata in posizione di chiusura della valvola.
   3. Aggiungere 5 - 7 mL di soluzione di diluizione anticorpo con un fattore di diluizione di 1/500 di collagene di tipo IV anticorpi. Rilasciare la soluzione di anticorpi nel campione aprendo la valvola.
   4. Impostare il pistone della siringa alla posizione 17 mL per fornire spazio sufficiente per il movimento di infusione / ritiro. Questo può essere fatto in posizione di apertura della valvola. Chiudere la valvola a 3 vie dopo l'impostazione della siringa è terminata.
   5. Mettere la siringa contenente il campione in una pompa a siringa. Impostare le condizioni pompa siringa per un volume di soluzione / ritiro di 10 ml / min e un 4-min tempo di pausa in modalità ciclo continuo (Figura 1C).
      NOTA: La pompa infonde fino a raggiungere il volume bersaglio (10 mL), e quindi la direzione di flusso cambia dopo una breve pausa (4 min).
   6. Far funzionare la pompa a siringa per 3 - 24 ore a temperatura ambiente (Figura 1F).
   7. Aprire la valvola a 3 vie e sostituire la soluzione con 0.1x PBS.
   8. Lavare il campione macchiato due volte con 0.1x PBS per 1 ora ogni volta usando la pompa a siringa.
   9. Cambiare con la soluzione di diluizione di anticorpi contenente Cy3-coniugato anti-coniglio anticorpo secondario (fattore di diluizione di 1/500) e far funzionare la pompa a siringa per 3-24 ore.
   10. Aprire la valvola a 3 vie e sostituire la soluzione con 0.1x PBS.
3. Prima di imaging, incubare il campione macchiato in una quantità appropriata di soluzione cubi di montaggio per 1 ora a temperatura ambiente agitando delicatamente. Sostituire con soluzione fresca cubi di montaggio e incubare per un ulteriore 1 h.

7. IMaging

1. Posizionare il tessuto etichettato in un piatto confocale e aggiungere CUBIC-mount soluzione fino a quando il tessuto è coperto. Collocare un coprioggetto sul tessuto. Utilizzare un microscopio confocale per l'immagine del tessuto ¹⁴ sotto l'obiettivo 10X.

Clearing ACT-tessuto

Un fattore importante che influenza compensazione dei tessuti è la fissazione dei tessuti. PFA fissazione e infusione di acrilamide sono fasi distinte in questo protocollo. Dopo la fase di polimerizzazione dei tessuti-idrogel, la soluzione A4P0 libero non è polimerizzato, sebbene idrogel di tessuto-infuso sono reticolato con macromolecole endogene. Pertanto, nessun gel deve formare all'esterno del tessuto (Figura 2A). I risultati della procedura di ACT a meno cross-linking tra proteine ​​e acrilamide rispetto al protocollo di chiarezza. Di conseguenza, il campione di tessuto-idrogel è più poroso. Questa caratteristica consente l'estrazione rapida di lipidi e la diffusione di macromolecole. Le sezioni di cervello di topo da 1 a 2 mm di spessore sono stati sufficientemente liquidati entro 1 - 2 h (Figura 2B), e 5 - 6 h di ETC era sufficiente per clearance di cervelli di topo interi (Figura 2C). Idrogel mediata compensazione tessuto indotto l'espansione del tessuto dopo la fase ETC, ma il tessuto riportata alla sua dimensione originale in soluzione index-matched riflettente. Il campione di tessuto-idrogel formata nel procedimento ACT è altamente porosa, e quindi, piccoli composti e macromolecole può penetrare in modo efficiente e diffondere facilmente (Figura 3). Dopo 2 ore di incubazione delle fettine cerebrali 1 mm con tirosina idrossilasi (TH) e collagene tipo anticorpi IV, una successiva 2 h di incubazione con un anticorpo secondario era sufficiente per etichettare i neuroni dopaminergici a una profondità di 500 micron (Figura 3) .

Immunomarcatura PRESTO-tessuto

organi Dense hanno generalmente alte concentrazioni di fibre ECM, che colpisce la penetrazione di anticorpi nei tessuti. Così, gli anticorpi Penetvalutazione ad una profondità di soli 20-30 micron di tessuti densi, come il tessuto renale, dopo 12 ore di incubazione. Per superare questa limitazione, abbiamo progettato metodi penetrazione macromolecola attivi che consentono l'erogazione dei reagenti nei tessuti profondi, cioè PRESTO (pressione correlato trasferimento efficiente e stabile di macromolecole in organi) (Figura 4). Rispetto alla incubazione statica del tessuto renale ACT-trattati con soluzioni di anticorpi, l'applicazione di forze centrifughe (600 xg) con una centrifuga da tavolo (PRESTO centrifuga, c-PRESTO) notevolmente migliorato consegna anticorpi in tessuti profondi (Figura 5). Quando abbiamo applicato la procedura di c-PRESTO ai tessuti densi, 3 ore di incubazione era sufficiente per etichettare 250 a strutture profonde di 300 micron. Per migliorare la distorsione dei tessuti senza significative danni ai tessuti, abbiamo anche progettato una macchina che fornisce il flusso di convezione con una pompa a siringa (siringhe PRESTO, s-Presto). Questo processo simile migliorato pe anticorpinetration rispetto a diffusione passiva (Figura 5).

Figura 1. Preparazione dell'apparecchiatura s-PRESTO. A. Una siringa (30 ml) e tre vie rubinetto. B. La valvola a tre vie collegata e incollato alla siringa. C. La siringa contenente la soluzione campione e l'anticorpo, e la siringa posto sulla pompa a siringa. D. La pompa a siringa e di lavoro di installazione condizione. E. La pompa infonde una soluzione contenente i reagenti di etichettatura nel campione. Quando il volume designato è raggiunto, i cambi di direzione di pompaggio e ritira la soluzione dopo un determinato periodo di tempo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. immunomarcatura con il tessuto di cervello di topo ACT-eliminato. Immagini di 1 mm fettine di cervello di topo ACT-elaborati che mostrano la corteccia cerebrale del mouse macchiato con un anticorpo di collagene di tipo IV e parte del mesencefalo macchiato di un anticorpo per la tirosina idrossilasi (TH). barra della scala, 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura metodi immunomarcatura 4. PRESTO. Gli anticorpi non possono penetrare nei tessuti densi di diffusione. metodi PRESTO immunomarcatura sono stati progettati per infondere attivamente macromolecole e di consegnare i reagenti intessuti densi. L'applicazione di forze centrifughe utilizzando una centrifuga da tavolo standard (PRESTO centrifuga, c-PRESTO) notevolmente facilitato la consegna di anticorpi. Applicando il flusso di convezione con una pompa a siringa (siringhe PRESTO, s-PRESTO) migliore penetrazione degli anticorpi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. PRESTO immunomarcatura di tessuto denso ACT-eliminato. Per c-PRESTO, tessuti sono stati centrifugati a 600 xg per 3 h usando un tavolo centrifuga standard per accelerare la penetrazione degli anticorpi primari e secondari. Per s-PRESTO, una pompa a siringa è stato usato per fornire anticorpi. organi mouse, come i reni e il fegato, sono stati etichettati con collagene di tipo IV. Rispetto ai metodi convenzionali, 3 h diC o s-PRESTO migliora notevolmente la profondità di etichettatura. Nel rene ed il fegato, la profondità Z raggiunge i 300 - 350 micron o più in profondità nei campioni Presto (destra), mentre i campioni di controllo sono etichettati a una profondità di soli 40 - 50 micron (a sinistra). Una immagine ricostruita 3D è stata ottenuta con un microscopio confocale. barra della scala, 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.