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Biology

अधिनियम-सफ़ाई: जैविक ऊतक समाशोधन और मात्रा इमेजिंग के लिए immunolabeling के तरीके

Published: December 31, 2016 doi: 10.3791/54904
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy, Korea University College of Medicine

Summary

अधिनियम-हाथ की सफ़ाई (सक्रिय स्पष्टता तकनीक दबाव संबंधित कुशल और स्थिर अंगों में अणुओं का हस्तांतरण) निष्क्रिय प्रसार या दबाव की मदद से प्रसव के द्वारा मंजूरी दे दी ऊतकों में तेजी से, कुशल, लेकिन सस्ती ऊतक समाशोधन और तेजी से एंटीबॉडी प्रवेश सक्षम बनाता है। इस विधि का प्रयोग, ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला को मंजूरी दे दी जा सकती है कई एंटीबॉडी द्वारा immunolabeled, और मात्रा-imaged।

Abstract

पहचान और अंगों की या सेलुलर स्तर पर पूरे शरीर की विस्तृत संगठन के अन्वेषण के जीव विज्ञान के क्षेत्र में मौलिक चुनौतियां हैं। संक्रमणकालीन तरीकों समय और एक 3 डी छवि प्राप्त करने के लिए प्रयास की एक पर्याप्त राशि और बरकरार ऊतक सेक्शनिंग immunolabeling सहित, और इमेजिंग क्रमानुसार-sectioned ऊतक, जो इस प्रक्रिया के हर कदम पर जानकारी का नुकसान पैदा करता है की आवश्यकता होती है। बरकरार ऊतक के भीतर उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए हाल ही में विकसित दृष्टिकोण में, आणविक लक्षण वर्णन प्रोटीन की लेबलिंग के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया है। हालांकि, अंग समाशोधन के लिए वर्तमान में उपलब्ध प्रोटोकॉल एक काफी लंबी प्रक्रिया के समय की आवश्यकता है, यह मुश्किल प्रयोगशाला में ऊतक समाशोधन तकनीकों को लागू करने के लिए कर रही है। हमने हाल ही में स्थापित एक तेजी से और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य करार दिया प्रोटोकॉल अधिनियम-हाथ की सफ़ाई (एक ctive ग larity टी echnique- पी ressure आर ई fficient और एस तालिका टी ransfer उत्तेजितओ rgans) है, जो कई घंटे के भीतर ऊतक मंजूरी के लिए अनुमति देता में अणुओं की। इसके अलावा, अधिनियम-सफ़ाई पारंपरिक तरीकों के साथ तेजी से immunolabeling सक्षम बनाता है और घनी का गठन, मोटी नमूनों की गहरी परत में दबाव या संवहन प्रवाह को लागू करने से एंटीबॉडी प्रवेश accelerates। हम कैसे ऊतकों, वैद्युतकणसंचलन का उपयोग लिपिड हटाने से साफ करने के लिए कैसे तैयार करने के लिए का वर्णन है, और एक दबाव की मदद से प्रसव के द्वारा कैसे इम्युनो-दाग। तेज़ी और प्रोटोकॉल की निरंतरता 3 डी ऊतकीय अनुसंधान और मात्रा के आधार पर निदान के प्रदर्शन में तेजी लाने जाएगा।

Introduction

तंत्रिका विज्ञान में चुनौतियों में से एक neuronal सर्किट तारों और बरकरार मस्तिष्क ऊतक के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं के दृश्य है। अभी हाल तक, इस तरह से न्यूरॉन्स के बीच कनेक्शन का प्रदर्शन अपेक्षित 1) ऊतकों के धारावाहिक सेक्शनिंग; 2) इस तरह एक्सोन या प्रोटीन के रूप में विशिष्ट लक्ष्यों की आणविक लेबलिंग; और 3) कम्प्यूटेशनल पंजीकरण या 2 डी छवियों सीरियल 1 के संरेखण के माध्यम से पूरे दिमाग के 3D पुनर्निर्माण द्वारा दृश्य। ये कदम, श्रमसाध्य हैं समय का एक बड़ा सौदा की आवश्यकता है, और सेक्शनिंग और लेबलिंग, न्यूरोनल नेटवर्क मानचित्रण बेहद मुश्किल बना दौरान जानकारी खोने के लिए उत्तरदायी हैं। हालांकि, कई तरीकों कि सेक्शनिंग बिना बरकरार ऊतक के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किया गया है। जैविक ऊतकों ऊतक समाशोधन तकनीक 2-10 द्वारा ऑप्टिकली पारदर्शी बनाया जा सकता है। प्रमुख तरीकों में से एक बरकरार ऊतक और व्यवस्था में विसर्जन के समाधान के बीच अपवर्तनांक मतभेदों को कम करने के लिए हैबरकरार ऊतक में प्रकाश बिखरने को कम करने के लिए, इस प्रकार के ऊतकों पारदर्शी प्रतिपादन और गहरी संरचनाओं का अवलोकन सक्षम करने से। विसर्जन के समाधान के कुछ प्रकार के हाइड्रोफोबिक गुण है, जो निर्जलीकरण की प्रक्रिया के दौरान तेजी से फ्लोरोसेंट शमन में परिणाम है। इसलिए, उन तरीकों समय 11,12 की एक लंबी अवधि में फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ संगत नहीं हैं। हाइड्रोफोबिक अभिकर्मकों के बजाय, अन्य तरीकों जैसे SeeDB 4 और SCA एल ई 6 ऊतक समाशोधन के लिए हाइड्रोफिलिक अभिकर्मकों, जो जैविक ऊतक 4,6,8 के संरचनात्मक जानकारी और प्रतिदीप्ति बनाए रखने का उपयोग करें। हालांकि, बड़े अणुओं, एंटीबॉडी सहित बरकरार ऊतक के कोर प्रसार से अकेले नहीं पहुँच सकते हैं। इसलिए, घनी पैक ऊतकों की गहरी क्षेत्रों में लक्ष्य अणुओं की पूर्व लेबलिंग तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है।

एक हाल ही में विकसित ऊतक समाशोधन विधि में, स्पष्टता 3, एक हाइड्रोजेल एम्बेडेड जैविक ऊतक मैंएक्रिलामाइड के साथ बनाई है, और लिपिड सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) युक्त समाधान के तहत वैद्युतकणसंचलन से हटा रहे हैं। नमूना तो एक मेल चिंतनशील सूचकांक के साथ एक समाधान में डूब जाता है प्रकाश बिखरने 3 कम करने के लिए। लिपिड हटाने की व्यवस्था बाद में उन्नत स्पष्टता 13 और संधि (निष्क्रिय स्पष्टता तकनीक) 10 में संशोधित किया गया था। polymerization के बाद, एक्रिलामाइड चेन प्रोटीन के साथ crosslink, बनाने हाइड्रोजेल-ऊतक। लिपिड घटकों एक्रिलामाइड साथ crosslink नहीं कर सकते हैं; इस प्रकार, लिपिड एसडीएस युक्त बफर के तहत वैद्युतकणसंचलन से समाप्त किया जा सकता है। लिपिड के सक्रिय उन्मूलन के माध्यम से, मस्तिष्क के ऊतकों स्पष्ट रूप से पारदर्शिता 9 में बढ़ जाती है। हालांकि, इन तरीकों मुक्त प्रसार से गहरे लेबलिंग के असंभव पता नहीं है। इस सीमा को पार करने के लिए, मोटी ऊतकों के गहरे भागों में अभिकर्मकों के सक्रिय परिवहन के लिए तकनीक की आवश्यकता है।

स्पष्टता ऊतक समाशोधन और गहरी ऊतक की अनुमति देता हैदृश्य, यह एक आसान या तेजी से प्रक्रिया नहीं है। यह कई सप्ताह लेने के लिए एक पूरे माउस मस्तिष्क 7,14 स्पष्ट कर सकते हैं। ऊतकों की रैपिड समाशोधन जीवन विज्ञान अनुसंधान या मात्रा निदान के लिए बुनियादी या नैदानिक ​​प्रयोगशाला सेटिंग्स करने के लिए इस तरह के तरीकों के आवेदन के लिए आवश्यक है। वर्तमान प्रोटोकॉल दबाव की मदद से प्रसव इम्युनो-धुंधला द्वारा जैविक ऊतक निकासी और बाद में प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक सरल प्रक्रिया है। यह इमेजिंग तरीकों के साथ संयोजन के माध्यम से बड़ी दायर की और 3 डी डेटा प्रोसेसिंग सिस्टम के उच्च संकल्प मात्रा इमेजिंग के लिए उपयुक्त है।

Protocol

पशु प्रयोगों सभी प्रासंगिक सरकारी और संस्थागत नियमों का पालन करना चाहिए।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. हाइड्रोजेल मोनोमर समाधान (A4P0) के लिए: 0.1x फॉस्फेट बफर खारा के 450 एमएल (पीबीएस) को एक्रिलामाइड के 20 ग्राम जोड़ें और 0.1x पीबीएस के साथ 500 एमएल मात्रा समायोजित करें।
    चेतावनी: एक्रिलामाइड मोनोमर विषाक्त कर रहे हैं। एक चेहरा शील्ड, एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और बंद पैर की अंगुली जूते सहित, व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ एक धूआं हुड में सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन।
    1. इसके तत्काल बाद, का उपयोग एक धूआं हुड के नीचे एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 2,2'-Azobis [2 (2-imidazolin-2-YL) प्रोपेन] हाइड्रोजेल मोनोमर समाधान के 40 एमएल (A4P0) को dihydrochloride के 100 मिलीग्राम जोड़ने से पहले ।
  2. Electrophoretic ऊतक समाशोधन (ईटीसी) बफर के लिए: सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) और विआयनीकृत एच 2 ओ (DH 2 हे) के 800 एमएल के लिए बोरिक एसिड का 12.37 जी की 40 ग्राम जोड़ें। NaOH के साथ 8.5 पीएच को समायोजित करने के लिए और मात्रा को समायोजितअतिरिक्त DH 2 ओ के साथ 1 एल
    चेतावनी: एसडीएस एक हानिकारक रसायन है; इसलिए, यह ध्यान के साथ संभाल।
  3. घन माउंट समाधान के लिए: सुक्रोज की 250 ग्राम, यूरिया की 125 ग्राम, और एन, एन, एन के 125 जी ',' एन -tetrakis (2-hydroxypropyl) DH 2 हे के 150 एमएल के लिए ethylenediamine जोड़ें और मात्रा लाने DH 2 ओ के साथ 500 एमएल के लिए

2. नमूना तैयार और फिक्सेशन

  1. माउस की इच्छामृत्यु।
    1. एक ही सिरिंज में alfaxalone (1 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (0.5 मिलीग्राम / किग्रा) तैयार करें।
    2. Intraperitoneally alfaxalone और xylazine का मिश्रण इंजेक्षन और माउस के लिए 3 मिनट के बेहोश बनने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. जब तक anaesthetized माउस नहीं रह गया है, इस तरह के एक पूंछ चुटकी के रूप में दर्द उत्तेजनाओं, का जवाब है आगे बढ़ने से पहले रुको।
      चेतावनी: पशुओं को संभालने के लिए उपयुक्त संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करें।
  2. Transcardially 100 0.9% की एमएल सोडियम क्लोराइड (पीएच 7.4-7.5) समाधान के साथ माउस छिड़कनाहेपरिन (100 यू / एमएल) रक्तहीन करने के लिए, 1x पीबीएस में 4% paraformaldehyde के 100 एमएल (पीएफए) (7.4 पीएच) 14 के द्वारा पीछा युक्त।
    चेतावनी: पीएफए समाधान विषैला होता है। पीएफए ​​समाधान और बाद के सभी से निपटने की तैयारी एक धूआं हुड में और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ आयोजित किया जाना चाहिए।
  3. माउस का सिर काटा, त्वचा के ऊपर खुला, और छोटे कैंची का उपयोग आंखों के बीच खोपड़ी टूट गया।
  4. खोपड़ी छोटे, घुमावदार संदंश का उपयोग के टुकड़े निकालें।
  5. मस्तिष्क या वांछित अंगों बाहर ले जाओ।
  6. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क और बाद तय 4% पीएफए ​​समाधान में अंगों को सेते हैं।
    नोट: विशिष्ट क्षेत्र ऊतक समाशोधन के लिए, विशिष्ट क्षेत्र काटना या ऊतक निर्धारण के बाद ऊतक ट्रिम।
    चेतावनी: पीएफए समाधान विषैला होता है। transcardial छिड़काव और बाद के सभी माउस हैंडलिंग एक धूआं हुड में और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ आयोजित किया जाना चाहिए।

3. हाइड्रोजेल Monomer आसव और पोलymerization

  1. कोमल झटकों के साथ 12-24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर A4P0 हाइड्रोजेल मोनोमर समाधान में तय अंगों को सेते हैं।
  2. हाइड्रोजेल मोनोमर संचार ऊतक polymerization।
    1. हाइड्रोजेल मोनोमर समाधान के 5 एमएल के साथ एक 10 एमएल दौर नीचे ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण। Parafilm के साथ दौर नीचे ट्यूब के शीर्ष लपेटें।
    2. दौर नीचे ट्यूब 1 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन के माध्यम से बुदबुदाती हाइड्रोजेल संचार पूरे माउस मस्तिष्क नमूना युक्त से ऑक्सीजन निकालें। जल्दी और कसकर नमूना युक्त ट्यूब को बंद करें।
  3. 2 घंटे के लिए एक पानी में स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए ट्यूब स्थानांतरण।
  4. 0.1x पीबीएस के साथ संक्षिप्त polymerized नमूना धो अतिरिक्त हाइड्रोजेल हटा दें।
    चेतावनी: हाइड्रोजेल monomers विषाक्त कर रहे हैं। हाइड्रोजेल मोनोमर के साथ त्वचा के संपर्क से बचने के लिए एक धूआं हुड में है और एक चेहरा शील्ड, एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और सहित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, के साथ सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन।
    नोट: Polymerized ऊतकों4 डिग्री सेल्सियस पर अधिक से अधिक 2 सप्ताह के लिए 0.1x पीबीएस युक्त सोडियम azide में संग्रहित किया जा सकता है।
    चेतावनी: सोडियम azide अत्यधिक तीव्रता से और विषैला होता है। एक चेहरा शील्ड, एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और सहित, एक धूआं हुड में और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन।

4. Electrophoretic ऊतक समाशोधन (ईटीसी)

  1. एक ऊतक कंटेनर के लिए polymerized नमूना स्थानांतरण और ईटीसी कक्ष में ऊतक कंटेनर जगह है।
  2. peristatic पंप का उपयोग आदि बफर आदि के साथ चैम्बर भरें।
  3. आदि की स्थिति सेट आदि चलाने निम्नलिखित सेटिंग्स का प्रयोग करें।
    1. (1.5 एएमपी), तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) समय (6.0 ज), पंप की गति (30 आरपीएम) चल रहा है: पूरे अंगों के लिए आदि सेटिंग्स के लिए, निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें।
    2. , वर्तमान (1.5 एएमपी), तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) समय (2.0 ज), पंप की गति (30 आरपीएम) चल रहा है: 1- करने के लिए 2 मिमी मोटी माउस मस्तिष्क स्लाइस के लिए आदि सेटिंग्स के लिए, निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें।
  4. स्थानांतरण टीवह 0.1x पीबीएस के 45 एमएल के साथ एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब नमूना मंजूरी दे दी। जब तक कोई बुलबुले में देखा जाता है जब ट्यूब संक्षेप हिल रहा है 0.1x पीबीएस के साथ मंजूरी दे दी नमूना कई बार धोएं (एसडीएस का पूरी तरह हटाने की पुष्टि के लिए)।

5. अधिनियम संसाधित ऊतकों की immunolabeling

  1. माउस पूरे दिमाग के लिए: एंटीबॉडी 1x पीबीएस, 6% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), युक्त समाधान की एक 3-एमएल मात्रा में नमूना सेते 0.1% ट्राइटन X-100, और 0.01% सोडियम azide (एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान) एक कमजोर पड़ने के साथ tyrosine hydroxylase (ध) 4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हल्के झटकों से एंटीबॉडी के लिए 1/500 का कारक है। 2 दिन के अंत में एंटीबॉडी समाधान बदलें।
    1. 45 0.1X एमएल 3 के लिए पीबीएस के साथ एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में नमूना धो - 5 घंटे और बफर हर एक घंटे में बदल जाते हैं।
    2. एक 3 एमएल 1/500 के कमजोर पड़ने कारक के साथ एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान का गधा विरोधी खरगोश 488 माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए 4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हल्के झटकों साथ मात्रा में नमूना सेते हैं। repl2 दिन पतला एंटीबॉडी समाधान ऐस।
  2. 2 मिमी मोटी कटा हुआ मस्तिष्क के ऊतकों के लिए 1- लिए: नमूना रातोंरात या एक 0.5- 1-एमएल के लिए एक कमजोर पड़ने 37 पर कोलेजन प्रकार चतुर्थ एंटीबॉडी के लिए 1/500 के कारक के साथ एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान की मात्रा में करने के लिए 1 दिन के लिए सेते हल्के झटकों के साथ सी °।
    1. 1-2 घंटे के लिए 0.1x पीबीएस के एक 12 एमएल मात्रा के साथ एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में नमूना धो लें। बफर हर एक घंटे में बदलें।
    2. एक 0.5- 1-एमएल के लिए Cy3 संयुग्मित विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी रातोंरात या हल्के झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 1 दिन के लिए के लिए 1/500 के कमजोर पड़ने कारक के साथ एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान की मात्रा में नमूना सेते हैं।
  3. के लिए 3 0.1x में नमूना धो पीबीएस - 5 h; बफर हर एक घंटे में बदल जाते हैं।
  4. इमेजिंग के लिए पहले, कोमल झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए घन माउंट समाधान का एक उचित मात्रा में नमूना सेते हैं। ताजा घन माउंट समाधान के साथ बदलें और एक अतिरिक्त 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    ध्यान दें: 14 भी शामिल है। पूर्व लेबल ऊतक अधिनियम संसाधित ऊतक में दो और fluorochromes की immunolabeling के साथ जोड़ा जा सकता है।

6. घने ऊतकों की immunolabeling (PRESTO)

  1. सी-हाथ की सफ़ाई
    नोट: सी-सफ़ाई जैसे पूरे वृषण, पूरे गुर्दे, या बड़ा अंगों के छोटे वर्गों के रूप में छोटे आकार के नमूने, के लिए उपयुक्त है।
    1. एक 1.5 एमएल ट्यूब में नमूना हस्तांतरण, कोलेजन प्रकार चतुर्थ एंटीबॉडी के लिए 1/500 के कमजोर पड़ने कारक के साथ एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान के 500 μL जोड़ने के लिए, और 2 घंटे के लिए 600 × छ ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    2. 30 मिनट के लिए 600 × छ centrifugation द्वारा 0.1x पीबीएस के साथ दाग नमूना धो लें।
    3. 2 घंटे के लिए 600 × छ पर Cy3 संयुग्मित विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी और सेंट्रीफ्यूज के लिए 1/500 के कमजोर पड़ने कारक के साथ एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान के 500 μL जोड़ें।
    4. 0 के साथ दाग नमूना धो लें।1x पीबीएस पर 30 मिनट के लिए 600 × छ centrifugation द्वारा।
  2. एस-हाथ की सफ़ाई
    नोट: S-सफ़ाई बड़ा ऊतकों के लिए उपयुक्त है।
    1. एक सिरिंज (30 एमएल मात्रा) को तैयार है और यह एक 3-तरह वाल्व (चित्रा 1 ए) से कनेक्ट। उच्च दबाव की स्थिति (चित्रा 1 बी) के लिए एक गोंद बंदूक के साथ वाल्व गोंद।
    2. बंद वाल्व स्थिति में 3 तरह वाल्व से जुड़े सिरिंज में नमूना हस्तांतरण।
    3. एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान के 7 एमएल कोलेजन प्रकार चतुर्थ एंटीबॉडी के लिए 1/500 के कमजोर पड़ने कारक के साथ - 5 जोड़े। वाल्व खोलने के द्वारा नमूना में एंटीबॉडी समाधान रिलीज।
    4. आसव / आहरण आंदोलन के लिए पर्याप्त कमरे उपलब्ध कराने के लिए 17 एमएल की स्थिति के लिए सिरिंज पिस्टन सेट करें। इस खुले वाल्व स्थिति में किया जा सकता है। 3 तरह वाल्व बंद करने के बाद सिरिंज सेटिंग समाप्त हो गया है।
    5. एक सिरिंज पंप पर नमूना युक्त सिरिंज रखो। 10 एमएल / मिनट की एक प्रेरणा / आहरण की मात्रा और एक 4 के लिए सिरिंज पंप सेट की स्थितिमिनट सतत चक्र मोड (चित्रा 1 सी) पर समय को थामने।
      ध्यान दें: पंप रहता है जब तक यह लक्ष्य की मात्रा (10 एमएल), और फिर एक संक्षिप्त ठहराव (4 मिनट) के बाद प्रवाह में परिवर्तन की दिशा में पहुंचता है।
    6. कमरे के तापमान (चित्रा 1F) में 24 एच - 3 के लिए सिरिंज पंप चलाने के लिए।
    7. 3 तरह वाल्व खोलें और 0.1x पीबीएस के साथ समाधान की जगह।
    8. दाग नमूना दो बार 0.1x पीबीएस के साथ 1 घंटे के लिए हर बार धो सिरिंज पंप का उपयोग कर।
    9. एंटीबॉडी कमजोर पड़ने Cy3 संयुग्मित विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी (1/500 के कमजोर पड़ने कारक) युक्त समाधान के साथ बदलें और 3 के लिए सिरिंज पंप चलाने - 24 h।
    10. 3 तरह वाल्व खोलें और 0.1x पीबीएस के साथ समाधान की जगह।
  3. इमेजिंग के लिए पहले, कोमल झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए घन माउंट समाधान का एक उचित मात्रा में दाग नमूना सेते हैं। ताजा घन माउंट समाधान के साथ बदलें और एक अतिरिक्त 1 घंटे के लिए सेते हैं।

7. मैंmaging

  1. एक confocal पकवान में लेबल के ऊतकों की जगह और घन माउंट समाधान जोड़ने जब तक ऊतक कवर किया जाता है। ऊतक पर एक coverslip रखें। 10X उद्देश्य के तहत ऊतक 14 छवि के लिए एक confocal खुर्दबीन का प्रयोग करें।

Representative Results

अधिनियम ऊतक समाशोधन

एक महत्वपूर्ण कारक ऊतक समाशोधन प्रभावित करने वाले ऊतक निर्धारण है। पीएफए ​​निर्धारण और एक्रिलामाइड आसव इस प्रोटोकॉल में अलग कदम उठाए हैं। ऊतक हाइड्रोजेल polymerization के कदम के बाद, मुक्त A4P0 समाधान polymerized नहीं है, हालांकि ऊतक संचार हाइड्रोजेल पार से जुड़े अंतर्जात अणुओं के साथ हैं। इसलिए, कोई जेल ऊतकों (2A चित्रा) के बाहर फार्म चाहिए। प्रोटीन और एक्रिलामाइड के बीच कम पार से जोड़ने में अधिनियम प्रक्रिया का परिणाम स्पष्टता प्रोटोकॉल की तुलना में। तदनुसार, ऊतक हाइड्रोजेल नमूना अधिक असुरक्षित है। यह सुविधा लिपिड की तेजी से निकासी और बड़े अणुओं के प्रसार में सक्षम बनाता है। 2 घंटे (चित्रा 2 बी), और 5 - - माउस मस्तिष्क 1- 2 मिमी मोटी पर्याप्त भीतर मंजूरी दे दी थी 1 के धारा 6 आदि की ज ग के लिए पर्याप्त थापूरे माउस दिमाग (चित्रा 2 सी) के learance। हाइड्रोजेल की मध्यस्थता ऊतक समाशोधन आदि कदम के बाद ऊतक के विस्तार के लिए प्रेरित किया, लेकिन ऊतक चिंतनशील सूचकांक मिलान समाधान में अपने मूल आकार में लौट आए। ऊतक हाइड्रोजेल नमूना अधिनियम प्रक्रिया में गठित अत्यधिक असुरक्षित है, और इस तरह, छोटे और बड़े अणुओं यौगिकों कुशलता से घुसना और आसानी से (चित्रा 3) फैलाना सकता है। Tyrosine hydroxylase (ध) और कोलेजन प्रकार चतुर्थ एंटीबॉडी के साथ 1 मिमी मस्तिष्क स्लाइस की एक 2-एच ऊष्मायन के बाद, एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ बाद में एक 2-एच ऊष्मायन एक 500 माइक्रोन गहराई पर डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए पर्याप्त था (चित्रा 3) ।

हाथ की सफ़ाई-ऊतक immunolabeling

घने अंगों आम तौर पर ईसीएम फाइबर, जो ऊतकों में एंटीबॉडी के प्रवेश को प्रभावित करता है की उच्च सांद्रता है। इस प्रकार, एंटीबॉडी penetऊष्मायन के 12 घंटे के बाद, केवल 20-30 माइक्रोन जैसे गुर्दे ऊतक के रूप में घने ऊतकों में की गहराई तक मूल्यांकन किया गया। इस सीमा को पार करने के लिए, हम सक्रिय macromolecule पैठ तरीकों कि गहरी ऊतकों में अभिकर्मकों के वितरण, अर्थात् हाथ की सफ़ाई (अंगों में संबंधित अणुओं के कुशल और स्थिर हस्तांतरण दबाव) (चित्रा 4) को सक्षम बनाया गया है। एंटीबॉडी समाधान, (चित्रा 5) एक टेबल टॉप सेंट्रीफ्यूज के साथ केन्द्रापसारक बल (600 XG) के आवेदन (केन्द्रापसारक सफ़ाई, सी-PRESTO) बहुत गहरी ऊतक में एंटीबॉडी वितरण में सुधार के साथ कार्य संसाधित गुर्दे ऊतक के स्थिर ऊष्मायन की तुलना में। हम घने ऊतकों को सी-सफ़ाई प्रक्रिया आवेदन किया है, ऊष्मायन के 3 घंटे के लिए 300 माइक्रोन गहरी संरचनाओं के लिए 250 लेबल करने के लिए पर्याप्त था। महत्वपूर्ण ऊतकों को नुकसान के बिना ऊतक विरूपण में सुधार करने के लिए, हम भी एक मशीन है कि एक सिरिंज पंप (सिरिंज सफ़ाई, एस-PRESTO) के साथ संवहन प्रवाह प्रदान करता बनाया गया है। यह प्रक्रिया इसी तरह एंटीबॉडी पे में सुधारnetration निष्क्रिय प्रसार (चित्रा 5) की तुलना में।

आकृति 1
चित्रा 1. एस PRESTO तंत्र की तैयारी। ए एक सिरिंज (30 एमएल) और तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी। बी तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी जुड़ा हुआ है और सिरिंज से चिपके। सी सिरिंज नमूना और एंटीबॉडी समाधान युक्त, और सिरिंज सिरिंज पंप पर रखा। डी सिरिंज पंप और काम करने की हालत सेटअप। ई पंप एक समाधान नमूना में लेबलिंग अभिकर्मकों युक्त रहता। जब नामित मात्रा पहुंच गया, पम्पिंग दिशा परिवर्तन और समय की एक निर्दिष्ट अवधि के बाद समाधान निकाल लेता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


माउस मस्तिष्क के चित्रा 2. अधिनियम ऊतक समाशोधन। ए polymerization के बाद, नि: शुल्क A4P0 समाधान polymerized नहीं कर रहे हैं; ऊतक संचार हाइड्रोजेल अंतर्जात अणुओं के साथ पार से जोड़ने के द्वारा gelated रहे हैं। बी 1- 2 मिमी मोटी स्लाइस मस्तिष्क के लिए 1 के लिए मंजूरी दे दी थी - 2 घंटे, और विस्तार और चिंतनशील सूचकांक में आकार वसूली की हद (आरआई) -matching समाधान दर्ज किए गए। आदि के 6 घंटे के पूरी तरह से स्पष्ट हो गया था मस्तिष्क को पर्याप्त - सी पूरे माउस मस्तिष्क की मोटाई के बारे में 0.8 सेमी, और 5 है। आदि के 3 घंटे के बाद, वहाँ गैर मंजूरी दे दी ऊतक का एक महत्वपूर्ण राशि थी। आदि के 6 घंटे तक, तथापि, पूरे मस्तिष्क के समाशोधन हुआ था। ईटीसी बफर में कार्रवाई के बाद ऊतकों का रंग सफेद या अपारदर्शी है। आरआई समायोजन करके, ऊतकों पारदर्शी हो। उसकी क्लिक करेंई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्र तीन
चित्रा 3. अधिनियम को मंजूरी दे दी माउस मस्तिष्क के ऊतकों के साथ immunolabeling। अधिनियम संसाधित 1 मिमी माउस मस्तिष्क दिखा माउस मस्तिष्क प्रांतस्था कोलेजन प्रकार चतुर्थ और मध्यमस्तिष्क एक एंटीबॉडी के साथ दाग के हिस्से के लिए एक एंटीबॉडी के साथ दाग स्लाइस की छवियाँ hydroxylase (ध) tyrosine करने के लिए। स्केल पट्टी, 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. PRESTO immunolabeling तरीकों। एंटीबॉडी प्रसार द्वारा घने ऊतकों में घुसना नहीं कर सकते। हाथ की सफ़ाई immunolabeling तरीकों को सक्रिय रूप से बड़े अणुओं तर करने के लिए और में अभिकर्मकों देने के लिए डिजाइन किए गए थेघने ऊतकों। एक मानक टेबल टॉप सेंट्रीफ्यूज (केन्द्रापसारक सफ़ाई, सी-PRESTO) का उपयोग केंद्रत्यागी बलों के आवेदन में स्पष्ट रूप से एंटीबॉडी के वितरण में मदद की। एक सिरिंज पंप (सिरिंज सफ़ाई, एस-सफ़ाई) में सुधार एंटीबॉडी पैठ के साथ संवहन प्रवाह Appling। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा अधिनियम को मंजूरी दे दी घने ऊतक के 5. हाथ की सफ़ाई immunolabeling। सी-हाथ की सफ़ाई के लिए, ऊतकों आदेश प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के प्रवेश में तेजी लाने के लिए एक मानक टेबल टॉप सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर 3 घंटे के लिए 600 XG पर centrifuged थे। एस-हाथ की सफ़ाई के लिए, एक सिरिंज पंप एंटीबॉडी वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस तरह के गुर्दे और जिगर के रूप में माउस अंगों, कोलेजन प्रकार चतुर्थ के साथ लेबल रहे थे। पारंपरिक तरीकों की तुलना में 3 घंटे के लिएसी या एस PRESTO स्पष्ट रूप से लेबलिंग गहराई को बढ़ाता है। 350 माइक्रोन या हाथ की सफ़ाई के नमूने (दाएं) में गहरी नियंत्रण नमूने केवल 40 की गहराई में चिह्नित कर रहे हैं, जबकि - - गुर्दे और जिगर में, जेड अक्ष की गहराई तक पहुँच जाता है 300 50 माइक्रोन (बाएं)। एक 3 डी खंगाला छवि एक confocal खुर्दबीन के साथ प्राप्त हुई थी। स्केल पट्टी, 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

गरीब निर्धारण या ऊतकों में हाइड्रोजेल विसर्जन प्रोटीन की हानि और ऊतक समाशोधन प्रक्रिया के दौरान ऊतक की विकृति पैदा कर सकता है। पूरे वयस्क माउस मस्तिष्क रात भर 4% paraformaldehyde में incubated किया जाना चाहिए, 12 के लिए हाइड्रोजेल मोनोमर समाधान के 20 एमएल की एक न्यूनतम मात्रा में विसर्जन के द्वारा पीछा किया - कोमल झटकों के साथ 18 घंटे। इस तरह के मस्तिष्क के स्लाइस और रीढ़ की हड्डी के रूप में बड़े ऊतकों, मानव ऊतक सहित, हाइड्रोजेल मोनोमर समाधान में समय भिगोने की आवश्यकता है बढ़ाया। अधिनियम प्रोटोकॉल तय ऊतकों के समाशोधन के लिए आसानी से लागू है क्योंकि ऊतक निर्धारण और बहुलक अर्क कदम अलग हो रहे हैं। ऊतक साफ़ करने के बाद, मानव ऊतकों कई एंटीबॉडी के साथ अच्छी तरह से दाग रहे थे। ध्यान दें कि अधिनियम समाशोधन तकनीक जैसे इथेनॉल और मेथनॉल के रूप में शराब fixatives, के साथ संगत नहीं है।

ऊतक हाइड्रोजेल polymerization कदम भी समाशोधन प्रक्रिया के बाद अच्छी गुणवत्ता वाले ऊतक का निर्माण करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलियेऑक्सीजन एक्रिलामाइड के polymerization रोकता है, यह एक नाइट्रोजन गैस संचार व्यवस्था के तहत ऊतक युक्त समाधान degassing से हटाया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, डे-oxygenation 23 घंटे के लिए एक गर्मी ब्लॉक के साथ एक निर्वात चैम्बर का उपयोग कर मार डाला जा सकता है।

समाशोधन दर अंग आकार, लिपिड या ईसीएम रेशेदार प्रोटीन की सामग्री, निर्धारण की स्थिति, आदि अधिकांश वयस्क माउस ऊतकों रात भर आदि द्वारा मंजूरी दी जा सकती सहित कई कारकों पर निर्भर है। हालांकि, वहाँ के एक जोखिम है पर समाशोधन और ऊतकों में सूजन अनावश्यक; इस प्रकार, समाशोधन समय में मतभेद महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं। ऊतक समाशोधन की स्थिति अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण बात है, ईसीएम की सामग्री को मंजूरी दे दी ऊतक की उपस्थिति को प्रभावित कर सकता है। ऊतकों के रंग क्योंकि अधिनियम घने प्रोटीन फाइबर स्पष्ट नहीं है सफेद या अपारदर्शी बनी हुई है, आदि बफर में अधिनियम के बाद भी। हालांकि, जब इन अंगों आरआई मिलान समाधान में डूब रहे थे,Y पारदर्शी बन गया।

ऊतक सूजन के ऊतकों की दर ईसीएम सामग्री, और इस तरह के मस्तिष्क के रूप में मुलायम अंगों पर निर्भर होने के लिए, घने अंगों की तुलना में एक अधिक से अधिक सूजन अनुपात का प्रदर्शन होता है। क्योंकि वृद्धि ऊतक ऊतक समाशोधन प्रक्रिया में मदद मिलेगी सूजन, अधिनियम नियमित तौर पर ज्यादातर मामलों में पानी आधारित बफर आसुत इस्तेमाल करता है। कुछ मामलों में, जब ऊतक सूजन या क्षणिक विकृति ऐसे भ्रूण के रूप में वांछनीय नहीं है, बफर युक्त 0.1x पीबीएस उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए आवेदन किया जा सकता है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए बफर में उच्च नमक सांद्रता ऊतकों की सिकुड़न का कारण बन सकता है।

अधिनियम विधि पूरे अंगों और एक माउस 14 के भी पूरे शरीर को स्पष्ट कर सकते हैं। हालांकि, पारदर्शी ऊतकों की गहरी ऊतक इमेजिंग विशेष माइक्रोस्कोप और उद्देश्यों की आवश्यकता है। इस प्रकार, मस्तिष्क के ऊतकों 1- करने के लिए 2 मिमी मोटी एक पारंपरिक confocal खुर्दबीन के साथ इमेजिंग के लिए सबसे प्रभावी है। हमारे हाथ में, लेबल को हटाने केअधिनियम संसाधित ऊतकों से एड एंटीबॉडी एंटीबॉडी निर्भर है, और विभिन्न एंटीबॉडी लेबलिंग के दौर की सिफारिश नहीं कर रहे हैं। ऐसी वें और GFAP के रूप में कई एंटीबॉडी, पूरे मस्तिष्क immunolabeling 14 के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से काम किया। दूसरी ओर, इस तरह के Tuj1 या MAP2 के रूप में कुछ एंटीबॉडी, अक्सर ही ऊतकों की सतह लेबल। इस तरह के स्विच 15 के रूप में अन्य तरीकों से सुधार किया जा सकता है। एक अन्य संभावित सीमा है कि यह क्योंकि ऊतक ऊतक समाशोधन चरण के दौरान सूजन और सिकुड़न के अधिनियम संसाधित ऊतक में ठीक प्रोटीन संरचनाओं की रक्षा करने के लिए मुश्किल हो सकता है।

हाथ की सफ़ाई तकनीक ऊतक लेबलिंग तकनीक की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू है। उदाहरण के लिए, इस तरह के SeeDB 4 और iDISCO 7 के रूप में पूर्व लेबल ऊतक का उपयोग ऊतक पारदर्शी तरीके, में, घने ऊतक के immunolabeling सप्ताह के लिए कई दिनों से अधिक समय ऊष्मायन अवधि की आवश्यकता है। हालांकि, हाथ की सफ़ाई कई घंटे ऊष्मायन समय कम कर सकते हैं, ई1-मिमी मोटी घने ऊतक के साथ एक दिन के भीतर पूरी प्रक्रिया के पूरा होने के nabling। हाथ की सफ़ाई गहरे लेबलिंग घने ऊतकों, या यहां तक ​​कि संयुक्त राष्ट्र को मंजूरी दे दी मोटी ऊतकों की प्रभावकारिता को बढ़ा सकते हैं। क्योंकि हाथ की सफ़ाई एक टेबल टॉप सेंट्रीफ्यूज या सिरिंज पंप का उपयोग करता है और किसी भी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है, यह नियमित प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के साथ इस तकनीक को लागू करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है।

Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde Lugen SCI  LGB-1175-4B sample fixation 
Acrylamide Affymetrix 75820 Hydrogel monomer solution 
2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride Wako Pure Chemical Industries   VA-044 Hydrogel monomer solution 
Boric acid Affymetrix 76324 ETC buffer
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix 18220 ETC buffer
Sodium hydroxide pellets Junsei chemical 1310-73-2 ETC buffer
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz Biotechnology sc-2323A Immunolabeling
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Immunolabeling
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Immunolabeling
Tyrosine hydroxylase (TH) Millipore AB152 Antibody/immunolabeling
Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-165-152 Secondary antibody/ immunolabeling
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Life Technologies - Molecular Probes A21206 Secondary antibody/ immunolabeling
Confocal dish SPL lifesciences 101350 Imaging
Confocal microscope Leica SP8 Imaging
Sucrose Junsei chemical 31365-0301 CUBIC-mount solution 
Urea Affymetrix 23036 CUBIC-mount solution 
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine Sigma-Aldrich 122262 CUBIC-mount solution 
ECT chamber Logos Biosystems, Inc. C10101 ETC system
ECT chamber controller Logos Biosystems, Inc. C10201 ETC system
Temperature probe Logos Biosystems, Inc. C12101 ETC system
Peristatic pump Baoding longer precision pump Co., Ltd YZ1515X ETC system
Buffer reservoir Logos Biosystems, Inc. C10401 ETC system
Tissue container  Logos Biosystems, Inc. C12001 ETC system
Container holder for 1 tissue container Logos Biosystems, Inc. C12002 ETC system
Mouse brain slice holder Logos Biosystems, Inc. C12004 ETC system
Whole rat brain holder Logos Biosystems, Inc. C12007 ETC system
Peristaltic pump tubing Logos Biosystems, Inc. C12104 ETC system
Tabletop-centrifuge Hanil science industrial Co., Ltd MICRO 12 c-PRESTO
Syringe pump Baoding longer precision pump Co., Ltd LSP02-1B s-PRESTO
Syringe (30 mL) Korea vaccine Co., Ltd. KV-S30 s-PRESTO
3-way stopcock Hyupsung medical Co.,Ltd. HS-T-01N s-PRESTO

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References

  1. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  2. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  3. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. NATURE. 497, 332-337 (2013).
  4. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  5. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  6. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  7. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
  8. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  9. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  10. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  11. Kim, S. -Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends Cogn Sci. 17, 596-599 (2013).
  12. Yushchenko, D. A., Schultz, C. Tissue clearing for optical anatomy. Angew Chem Int Edit. 52, 10949-10951 (2013).
  13. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
  14. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631 (2016).
  15. Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163, 1500-1514 (2015).

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जैव अभियांत्रिकी अंक 118 ऊतक समाशोधन immunolabeling 3 डी इमेजिंग ऊतक हाइड्रोजेल ऊतक इंजीनियरिंग तंत्रिका विज्ञान अधिनियम-सफ़ाई एक्स स्पष्टता
अधिनियम-सफ़ाई: जैविक ऊतक समाशोधन और मात्रा इमेजिंग के लिए immunolabeling के तरीके
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Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO:… More

Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. J. Vis. Exp. (118), e54904, doi:10.3791/54904 (2016).

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