ACT-PRESTO: Biological Clearing tessuti e Metodi immunomarcatura per Volume Imaging

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere il tessuto pulito e intatto e visualizzare le sue informazioni molecolari tridimensionali utilizzando metodi di immunomarcatura. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi delle neuroscienze e della biologia dello sviluppo, come le connessioni neuronali, la categorizzazione molecolare e il cambiamento strutturale durante lo sviluppo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tessuto consente chiaramente l'analisi a livello subcellulare di campioni di grandi dimensioni senza sezionamento.

Per iniziare questa procedura, incubare gli organi fissi in una soluzione di monomero di idrogel A4P0 a quattro gradi Celsius per 12-24 ore agitando delicatamente. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di soluzione monomerica di idrogel a un tubo inferiore rotondo da 10 millilitri. Quindi, trasferire il campione di cervello di topo su di esso e avvolgere la parte superiore del tubo con Parafilm.

Quindi, far bollire l'azoto attraverso il liquido con il campione di cervello infuso di idrogel per un minuto. Chiudere rapidamente e ermeticamente la provetta contenente il campione. Trasferire il tubo a bagnomaria per due ore.

Successivamente, controllare la viscosità dell'idrogel e quindi lavare brevemente il campione polimerizzato con 0,1 X PBS per rimuovere l'idrogel in eccesso. In questa fase, trasferire il campione polimerizzato in un contenitore di tessuto. E posizionare il contenitore del tessuto nella camera ETC.

Quindi, riempire la camera ETC con tampone ETC utilizzando una pompa peristaltica. Imposta le condizioni ETC e accendilo. Fette di cervello spesse da uno a due millimetri vengono eliminate entro due ore.

E un intero cervello viene sufficientemente ripulito entro cinque o sei ore. Successivamente, trasferire il campione in una provetta conica da 50 millilitri con 45 millilitri di 0,1 X PBS. Lavare il campione più volte con 0,1 X PBS fino a quando non si vedono bolle quando la provetta viene agitata brevemente per confermare la completa rimozione della SDS.

Per eseguire c-PRESTO, trasferire un piccolo campione in una provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di diluizione degli anticorpi con un fattore di diluizione da uno a 500 per gli anticorpi di collagene di tipo quattro e centrifugare la provetta a 600 volte g per due ore. Successivamente, lavare il campione colorato con 0,1 X PBS mediante centrifugazione a 600 volte g per 30 minuti.

Quindi, aggiungere 500 microlitri di soluzione di diluizione anticorpale con un fattore di diluizione da uno a 500 per l'anticorpo secondario Anti Rabbit coniugato Cy3 e centrifugarlo 600 volte g per due ore. Successivamente, lavare il campione colorato con 0,1 X PBS mediante centrifugazione a 600 volte g per 30 minuti. Per eseguire s-PRESTO su tessuti più grandi, trasferire il campione in una siringa collegata a una valvola a tre vie in posizione di valvola chiusa.

Aggiungere da cinque a sette millilitri di soluzione di diluizione degli anticorpi con un fattore di diluizione da uno a 500 per gli anticorpi del collagene di tipo quattro. Successivamente, aggiungere la soluzione di anticorpi nel campione aprendo la valvola. Quindi, nella posizione della valvola aperta, impostare il pistone della siringa sulla posizione di 17 millilitri per fornire spazio sufficiente per il movimento di estrazione dell'infusione.

Quindi, chiudere la valvola a tre vie al termine dell'impostazione della siringa. Posizionare la siringa contenente il campione su una pompa a siringa. Impostare le condizioni della pompa a siringa su un volume di prelievo dell'infusione di dieci millilitri al minuto e un tempo di pausa di quattro minuti in modalità ciclo continuo.

Successivamente, far funzionare la pompa a siringa per tre-24 ore a temperatura ambiente. Successivamente, aprire la valvola a tre vie e sostituire la soluzione con 0,1 X PBS. Lavare il campione colorato due volte con 0,1 X PBS per un'ora ogni volta, utilizzando la pompa a siringa.

Quindi, sostituire il PBS con la soluzione di diluizione dell'anticorpo contenente l'anticorpo secondario Anti Rabbit coniugato Cy3 e far funzionare la pompa a siringa per tre-24 ore. Successivamente, aprire la valvola a tre vie e sostituire la soluzione con 0,1 X PBS. Prima dell'imaging, incubare il campione colorato in una quantità appropriata di soluzione a montaggio cubico per un'ora a temperatura ambiente agitando delicatamente.

Dopo un'ora, sostituire la soluzione con una soluzione fresca a montatura cubica e incubare per un'altra ora. Poiché gli anticorpi non possono penetrare nei tessuti densi per diffusione, i metodi di immunomarcatura PRESTO sono progettati per infondere attivamente macromolecole e per fornire reagenti nei tessuti densi. L'applicazione delle forze centrifughe utilizzando una centrifuga da tavolo standard ha notevolmente facilitato la somministrazione di anticorpi.

L'applicazione del flusso di convezione con una pompa a siringa ha anche migliorato la penetrazione degli anticorpi. Per s-PRESTO, è stata utilizzata una pompa a siringa per erogare gli anticorpi. Gli organi del topo, come i reni e il fegato, sono stati marcati con collagene di tipo 4.

Rispetto ai metodi convenzionali, tre ore di c o s-PRESTO aumentano notevolmente la profondità di etichettatura. Nei reni e nel fegato, la profondità dell'asse z raggiunge i 300-350 micrometri o più in profondità nei campioni PRESTO, mentre i campioni di controllo sono marcati a una profondità di soli 40-50 micrometri. Una volta padroneggiate, queste tecniche possono essere eseguite in un giorno per i tessuti chiaramente se eseguite correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere chiaramente il tempo di fissazione dei tessuti Emulsione di monomero idrogel e tessuto elettroforetico. Dopo la procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunomarcatura per rispondere a ulteriori domande come l'analisi della dinamica cellulare e l'identificazione di un'alveolo neuronale in più organi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della scienza medica per esplorare la diagnosi delle malattie.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'inclusione di idrogel e la polimerizzazione dei tessuti. Non dimenticare che lavorare con la soluzione di monomero idrogel può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura.