Abstract
Studi di proteine integrali di membrana in vitro sono spesso complicata dalla presenza di un dominio transmembrana idrofobico. A complicare ulteriormente questi studi, reintegrazione delle proteine di membrana detergente-solubilizzato in liposomi è un processo stocastico in cui topologia di proteine è impossibile da far rispettare. Questo articolo offre un metodo alternativo per queste tecniche impegnative che utilizza un ponteggio a base di liposomi. Protein solubilità è esaltata dalla delezione del dominio transmembrana, e questi amminoacidi sono sostituiti con un residuo tethering, ad esempio un His-tag. Questo tether interagisce con un gruppo di ancoraggio (Ni 2+ coordinato da acido nitrilotriacetico (NTA (Ni 2+)) per His-tag proteine), che impone una topologia proteine uniforme sulla superficie del liposoma. Un esempio è presentato in cui l'interazione tra proteine Dynamin legati 1 (DRP1) con una proteina integrale di membrana, mitocondriale fissione Factor (QFP), era investigated utilizzando questo metodo impalcatura liposomi. In questo lavoro, abbiamo dimostrato la capacità di QFP di reclutare in modo efficiente DRP1 solubile alla superficie dei liposomi, che ha stimolato la sua attività GTPasi. Inoltre, DRP1 era in grado di tubulate il modello di lipidi MFF-decorato in presenza di lipidi specifici. Questo esempio dimostra l'efficacia di liposomi impalcature utilizzando saggi strutturali e funzionali e mette in evidenza il ruolo del QFP nella regolazione dell'attività DRP1.
Introduction
Studiare le interazioni proteina-proteina di membrana-prossimale è uno sforzo impegnativo a causa della difficoltà di ricapitolare l'ambiente nativo delle proteine integrali di membrana coinvolte 1. Ciò è dovuto alla necessità di detersivo solubilizzazione e l'orientamento incoerente delle proteine in proteoliposomi. Per evitare questi problemi, abbiamo utilizzato una strategia quale i domini solubili di proteine integrali di membrana sono espressi come proteine di fusione His-tag, e questi frammenti solubili sono ancorati liposomi ponteggio tramite interazioni con NTA (Ni 2+) headgroups al lipide superficie. L'utilizzo di questi ponteggi, interazioni proteina-lipidi prossimale possono essere indagati in un intervallo di lipidi e proteine composizioni.
Abbiamo effettivamente applicato questo metodo per studiare le interazioni critiche proteina-proteina che regolano il montaggio del complesso fissione mitocondriale ed esaminare le interazioni lipidi che modulano questo process 2. Durante la fissione mitocondriale, una conservata proteina rimodellamento della membrana, chiamata Dynamin-related protein 1 (DRP1) 3, viene reclutato per la superficie del mitocondriale esterna della membrana (OMM) in risposta a segnali cellulari che regolano l'omeostasi energetica, segnale apoptotico, e molti altri processi mitocondriali integrali. Questo grande, GTPase citosolica viene reclutato alla superficie dei mitocondri attraverso le interazioni con proteine OMM integrali 4 - 8. Il ruolo di una tale proteina, mitocondriale fissione Factor (QFP), è stato difficile chiarire causa di una debole interazione evidente con DRP1 in vitro. Tuttavia, studi genetici hanno chiaramente dimostrato che QFP è essenziale per il successo 7,8 fissione mitocondriale. Il metodo descritto in questo manoscritto è stato in grado di superare le carenze precedenti introducendo le interazioni lipidi simultanee che promuovono le interazioni DRP1-QFP. Nel complesso, questo nuovo metodo di analisi REVEAportato interazioni fondamentali che guidano il montaggio del complesso fissione mitocondriale e ha fornito una nuova fase per gli studi strutturali e funzionali in corso di questa macchina molecolare essenziale.
Fino ad oggi, l'esame delle interazioni tra DRP1 e QFP sono state complicate dalla flessibilità intrinseca del QFP 9, l'eterogeneità dei polimeri DRP1 2,10, e la difficoltà di purificazione e di ricostituzione full-length QFP con un dominio transmembrana intatto 11. Abbiamo affrontato queste sfide utilizzando liposomi NTA (Ni 2+) ponteggio per ricostituire His-tag QFP manca il suo dominio transmembrana (MffΔTM-His 6). Questa strategia è stata vantaggioso perché MffΔTM era estremamente solubile quando sovra-espresso in E. coli, e questa proteina isolata è stato facilmente ricostituiti in liposomi patibolo. Quando legato a questi modelli di lipidi, MFF ha assunto un identico, rivolto verso l'esterno orientamento sulla superficie della membrana.Oltre a questi vantaggi, lipidi mitocondriali, come cardiolipina, sono stati aggiunti per stabilizzare QFP piegatura e di associazione con la membrana 11. Cardiolipin interagisce anche con il dominio variabile della DRP1 2,12 che può stabilizzare questa regione disordinato e facilitare il montaggio della macchina fissione.
Questo metodo robusto è ampiamente applicabile per gli studi futuri che cercano di valutare le interazioni delle proteine di membrana-prossimale. Attraverso l'uso di ulteriori interazioni tethering / affinità, la sofisticazione di questi studi ricostituzione membrana può essere migliorato per imitare ulteriori complessità trovato alla superficie delle membrane all'interno delle cellule. Allo stesso tempo, composizioni lipidiche possono essere modificati per imitare più accuratamente gli ambienti nativi di questi complessi macromolecolari. In sintesi, questo metodo fornisce un mezzo per esaminare i relativi contributi di proteine e lipidi nel plasmare morfologie membrana a durante proc cellulare criticaesses.
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Protocol
1. Ponteggio liposomi Preparazione
NOTA: Idealmente, esperimenti iniziali dovrebbe usare un'impalcatura relativamente semplice e informe (composto da DOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine o PC) e DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-dioleoyl - sn -glycero-3 - [(N - (5-ammino-1-carbossipentil) acido imminodiacetico) succinil]. (nickel sale)) Edificio fuori di questi esperimenti, carica lipidi, flessibilità e curvatura può essere introdotto come singoli fattori con il potenziale per alterare le interazioni membrana-prossimale. Queste modifiche possono essere realizzati aggiungendo quantità definite di specifici componenti lipidici, inclusi fosfatidilserina o cardiolipina (CL), fosfatidiletanolammina (DOPE o PE), o galactosyl ceramide (β).
- Combinare lipidi disciolti in cloroformio in una provetta di vetro pulito. Evaporare il solvente con azoto secco, mentre la rotazione del tubo per formare un sottile film lipidico. Rimuovere solvente residuo con una centrifugal evaporatore per 1 ora a 37 ° C.
NOTA: Varie formulazioni di liposomi vengono utilizzati nei protocolli di seguito descritto: liposomi ponteggi (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 96,7 mol% DOPC), liposomi ponteggi con cardiolipina (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% cardiolipina / 86,7 mol% DOPC), liposomi ponteggio flessibili con cardiolipina (3.3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10% mol cardiolipina / 35 mol% DOPE / 51,7 mol% DOPC), e impalcatura arricchito liposomi (10 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 15% mol cardiolipina / 35 mol% DOPE / 40 mol% DOPC). - Aggiungere tampone A (25 mM HEPES (4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic), 150 mM KCl, pH regolato a 7,5 con KOH) preriscaldato a 37 ° C in modo che la concentrazione di lipidi finale 1 - 2 mM. Incubare 30 minuti a 37 ° C con vortex occasionale per risospendere completamente la miscela lipidica (Figura 1a).
- Trasferire in una provetta di plastica, porre il tubo in azoto liquido fino a completo congelamento (roughly 30 s), e posto in un bagno d'acqua C 37 ° fino a quando completamente scongelati (circa 1 - 2 min). Ripetere per un totale di 4 cicli di gelo-disgelo (Figura 1B).
- Preparare un estrusore lipidico immergendo 4 supporti del filtro e un filtro di policarbonato in tampone e assemblare l'estrusore secondo le istruzioni del produttore. Estrudere la soluzione lipidica attraverso il filtro 21 volte. Utilizzare dolce, pressione costante per garantire una distribuzione di dimensione omogenea (Figura 1c).
NOTA: Per tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo, un filtro 1,0 micron in policarbonato è stato utilizzato per l'estrusione. Interazione DRP1 con lipidi anionici può essere osservata con una varietà di diametri di liposomi che variano da 50 nm a 400 nm 12 o superiore 13. Quindi, la dimensione del filtro di 1 micron è stato scelto per essere ideale sia GTPasi attività e per la microscopia elettronica. Se altri diametri di liposomi sono desiderati, preparazione dei giganti vescicole unilamellari 14,15 (GUVs) o piccolo unilamellar vescicole 16 (SUV) può essere utilizzato. Diffusione della luce dinamica può essere utilizzato per valutare l'eterogeneità liposomi dimensioni 13. - Conservare liposomi estrusi a 4 ° C e scartare dopo 3-5 d.
2. L'utilizzo di ponteggi liposomi per la Proteina Analisi Binding
- Preparazione del campione
- Incubare His-tag MffΔTM (5 micron finale) con liposomi ponteggi (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni 2+); 50 um finale) per almeno 15 min a RT in tampone a + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 mM β-mercaptoetanolo (BME), pH regolato a 7,5 con KOH). Per un controllo QFP-libera, incubare liposomi con il suo tag-proteina di controllo (come la GFP) per legare e scudo esposto NTA (Ni 2+).
NOTA: MffΔTM è stato espresso e purificato come descritto in un precedente studio 2. GFP è stato purificato in modo analogo, ma il passo di scambio ionico è stato omesso. BME è stato richiesto per questi experiments perché DRP1 è sensibile all'ossidazione, che possono modificare le sue proprietà di attività e di assemblaggio. - Aggiungere DRP1 (2 mM finale) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
NOTA: DRP1 è stato espresso e purificato come descritto in un precedente studio 2. Dopo incubazione con DRP1, l'effetto vincolante per deformazione della membrana nucleotide può essere studiata incubando un'altra ora con 2 mM MgCl 2 e sia 1 mM GTP, 1 mM GMP-PCP, o tampone A + BME.
- Incubare His-tag MffΔTM (5 micron finale) con liposomi ponteggi (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni 2+); 50 um finale) per almeno 15 min a RT in tampone a + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 mM β-mercaptoetanolo (BME), pH regolato a 7,5 con KOH). Per un controllo QFP-libera, incubare liposomi con il suo tag-proteina di controllo (come la GFP) per legare e scudo esposto NTA (Ni 2+).
- Negativo Stain microscopia elettronica a trasmissione (EM) Analisi
- Transfer 5 microlitri di campione ad un foglio di pellicola di laboratorio, e stabilire una griglia Cu / Rh carbonio rivestito sul campione. Incubare la griglia 1 min sul campione, cancellare via il liquido in eccesso su carta da filtro, e trasferire ad un calo del 2% acetato di uranile. Incubare 1 min, tamponare l'eccesso macchia sulla carta da filtro, e trasferire a una casella della griglia. Conservare sotto vuoto O / N per garantire la piena essiccazione.
- campioni di immagine utilizzando un microsc elettronico a trasmissioneope a 18.500 - 30,000X ingrandimento per osservare i cambiamenti ultrastrutturali di proteine e di liposomi morfologie 17.
Nota: le modifiche ultrastrutturali possono essere quantificati utilizzando immagine software di analisi, come ad esempio ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). decorazione di proteine può essere misurata se confrontato con i modelli di lipidi nudi. Inoltre, i diametri dei segmenti tubolari possono essere misurati dalla porzione più esterna dei complessi 13. Un'analisi più dettagliata può essere effettuata utilizzando crio-microscopia elettronica 17. Questo metodo può essere usato per immagini complessi proteina-lipidi nativi in solvente senza l'uso di coloranti metalli pesanti che rivestono il campione. In questo modo, le caratteristiche strutturali dettagliate non apparenti macchia negativo, inclusi i cambiamenti nella morfologia dei lipidi di fondo, possono essere esaminate e quantificati.
3. L'uso del ponteggio liposomi per enzimatica Assay
Nota: A colorisaggio GTPase metrica 18 è stato utilizzato per misurare la liberazione di fosfato tramite GTP idrolisi. Saggi GTPasi alternativi sono disponibili 19 e possono essere implementati in base alle esigenze.
- Incubare His-tag MffΔTM (QFP), Fis1ΔTM (Fis1), o GFP (5 micron finale per tutti) con liposomi ponteggio (150 micron finali) per 15 minuti a temperatura ambiente in tampone A + BME (volume = 30 ml). Aggiungere DRP1 (500 nM finale) e incubare un ulteriore 15 minuti a temperatura ambiente (volume = 80 ml).
NOTA: Fis1 è stato purificato in modo analogo a MFF 2, ma la fase di cromatografia a scambio ionico è stato omesso. Lo scopo della sua tag-GFP è quello di proteggere il NTA (Ni 2+) headgroups e prevenire le interazioni di carica non specifiche con altre proteine. Se nessun effetto si osserva in assenza di GFP, allora questo controllo può non essere necessaria. Alternativi proteine bloccaggio (di dimensioni paragonabili alla proteina di interesse) possono essere usati pure, ma GFP permette la visualizzazione diretta delle interazioni con scafpiegare liposomi. - Tubi Trasferire un termociclatore impostato a 37 ° C, e avviare le reazioni di aggiunta di GTP e MgCl 2 (1 mM e 2 mM finale, rispettivamente; volume = 120 ml).
- A intervalli di tempo desiderati (cioè T = 5, 10, 20, 40, 60 min), trasferire 20 microlitri di reazione nei pozzetti della micropiastra contenente 5 ml di 0,5 M EDTA per chelare Mg 2+ e fermare la reazione.
- Preparare una serie di standard di fosfato diluendo KH 2 PO 4 in tampone A + BME per calibrare i risultati. Un utile set di standard è 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 e 0 pM. Aggiungere 20 ml di ciascuno per pozzetti contenenti 5 ml di 0,5 M EDTA.
- Aggiungere 150 ml di malachite verde reagente (1 mm di malachite verde carbinolo, 10 mM ammonio molibdato tetraidrato, e 1 N HCl) in ogni pozzetto, e leggere OD 650 5 min dopo l'aggiunta.
NOTA: GTP è acido labile e si idrolizzano in presenza di reagente verde malachite. Assicurarsi che tha il tempo tra l'aggiunta del reagente di malachite e la lettura è costante per garantire la riproducibilità dei risultati. - Generare una curva standard tracciando OD 650 degli standard in funzione della concentrazione di fosfato. Utilizzare la regressione lineare per determinare la relazione tra OD 650 e la concentrazione di fosfato in un campione.
- Utilizzando la regressione lineare, convertire la OD 650 dei campioni di reazione proteina mM fosfato. Determinare la velocità di generazione di fosfato per ciascuna miscela di reazione riportando concentrazione di fosfato in funzione del tempo, e convertire k cat dividendo il tasso dalla concentrazione DRP1 (0,5 mM).
NOTA: Solo la velocità lineare iniziale dovrebbe essere usato per determinare la velocità di generazione di fosfato, e un minimo di 3 punti di dati deve essere utilizzato. Se la velocità di reazione è sufficientemente rapida che i primi tre punti di dati non sono lineari (cioè la r 2 del fit lineare è inferiore a 0,9) di un segnoNaturalmente tempo ificantly breve con almeno 3 punti di tempo deve essere eseguita.
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Representative Results
Mentre l'interazione tra DRP1 e QFP ha dimostrato di essere importante per fissione mitocondriale, questa interazione è stato difficile ricapitolare in vitro. Il nostro obiettivo era quello di emulare meglio l'ambiente cellulare in cui DRP1 e del QFP interagiscono. A tal fine, liposomi contenenti concentrazioni limitanti del NTA (Ni 2+) headgroups sono stati preparati mediante reidratazione un film lipidico come descritto sopra. La soluzione lipidica inizialmente costituito da vescicole unilamellari e multilamellari di diametri eterogenei come dimostra l'opacità della soluzione (Figura 1a). Questa opacità è diminuito di congelamento-scongelamento (Figura 1b), che riduce la prevalenza di vescicole multilamellari. I diametri liposomi sono ulteriormente omogeneizzati mediante estrusione attraverso un filtro di policarbonato, che si traduce in una soluzione limpida (figura 1c).
2. Sulla base di questi risultati, abbiamo utilizzato un nuovo modello composto da PC, PE, Ni, e CL (chiamato Enriched Ponteggio liposomi o ESL) per promuovere il montaggio ordinata di un polimerico DRP1-QFP complesso in grado di indurre la deformazione della membrana. In particolare, maggiore NTA (Ni 2+) e lipidi cardiolipina sono stati utilizzati (10 moli% e il 15% in moli rispettivamente) per questa applicazione. Poi, GFP o MFF è stato impastoiati ai modelli ESL in presenza e in assenza di DRP1 (figura 2), e la capacità di DRP1 di rimodellare membrane era qualitativamente valutati. In assenza di DRP1, né QFP nè GFP provocato deformazione della membrana (Figura 3a, b), e analogamente nel caso di ESL GFP-decorato, sono stati osservati soltanto liposomi piatte (figura 3c). Tuttavia, quando DRP1 è stato aggiunto ai modelli ESL MFF-decorati, rimodellamento dei liposomi era evidente (Figura 3d).
Mentre la formazione del complesso macromolecolare dimostra chiaramente un'interazione tra DRP1 e QFP, questa analisi qualitativa sola è incapace di determinare gli effetti funzionali di tale interazione. Pertanto, abbiamo utilizzato un saggio generazione fosfato verde malachite 18 per valutare alterazioni dell'attività catalitica di DRP1 in risposta all'interazione con QFP. Come descritto in precedenza 2, inizialmente abbiamo utilizzato una semplice impalcatura liposomi (SL; 3,3 moli% DGS-NTA (Ni 2+), 96,7% molare DOPC) per indagare l'effetto del QFP da solo sulla struttura e la funzione DRP1. Interazione aspecifica di DRP1 con NTA (Ni 2+) è stato descritto in precedenza 20, in modo da SL è stato inizialmente progettato per contenere basse concentrazioni di NTA (Ni 2+) per evitare la stimolazione aspecifica attività di Drp1. Con le grandi quantità di NTA (Ni 2+) in ESL, l'uso di His-tag GFP come controllo è risultato essere critico per proteggere il Ni 2+ e prevenire non specifiche interazioni DRP1. Dopo la decorazione di liposomi SL da MFF o GFP (come illustrato in figura 2), il grado di auto-assemblaggio può essere valutata misurando l'attività GTPasi di DRP1. In assenza di liposomi, DRP1 relativamente contenuto GTPasi attività basale, che è leggermente migliorato aggiungendo SL. Decorazione di questi liposomi ponteggio a MFF migliorata attività GTPasica (Figura 4a, 1,8 volte). Al contrario, quando il NTA esposto (Ni 2+) headgroups sono stati bloccati con His-tag GFP, questa attività è stata aumentata GTPase ablated. Abbiamo anche testato il ruolo di Fis1, una proteina OMM che è stato suggerito di avere un ruolo nella fissione mitocondriale 21,22, anche se questo è stato contestato in studi recenti 7,23. Tethering di Fis1 manca il suo dominio transmembranaper SL riuscito anche a suscitare una stimolazione dell'attività GTPase di DRP1 (Figura 4a).
Abbiamo poi utilizzato una leggermente più complessa scaffold lipidico contenente una piccola quantità di cardiolipina (SL / CL: SL con 10 moli% cardiolipina sostituzione DOPC) per determinare il ruolo di questo lipide mitocondriale nell'interazione di DRP1 e QFP. Questa moderata concentrazione di cardiolipina è stato appositamente scelto per limitare la stimolazione del DRP1 da cardiolipina come descritto in precedenza 10. Simile a SL, l'aggiunta di SL / CL per DRP1 ha determinato una lieve stimolazione di attività GTPasi che è stato invertito da legare His-tag Fis1 o GFP ai liposomi. È stata osservata una sinergia tra QFP e cardiolipina come l'attività di GTPase DRP1 è stata stimolata 2,6 volte quando è stato incubato con MFF-decorato SL / CL (Figura 4b).
la fluidità di membrana e la capacità of DRP1 a rimodellare doppi strati lipidici sono stati proposti per migliorare la sua attività GTPasica. Pertanto, abbiamo cercato di esaminare l'effetto di membrana fluidità / flessibilità utilizzando una liposomi impalcatura flessibile. Ciò è stato ottenuto sostituendo il 35% in moli di DOPC in SL / CL con DOPE (SL / PE / CL), che è stato precedentemente dimostrato per consentire DRP1 mediata membrana rimodellamento 10. L'aggiunta di non decorati SL / PE / CL impalcatura liposomi a DRP1 aumenta leggermente attività GTPasica DRP1, e la decorazione di questi liposomi con GFP elimina questo effetto. Quando templates / PE / CL SL sono state decorate con MFF, l'attività è stata rafforzata DRP1 (figura 4c, 2,4 volte). Come abbiamo già dimostrato, la capacità di DRP1 di rimodellare liposomi in tubuli di lipidi è stato potenziato con l'aggiunta di PE ai liposomi ponteggio. È interessante notare, questo miglioramento tubulazione porta alla formazione di un polimero DRP1 elicoidale non ha comportato alcuna maggiore stimolazione rispetto ai liposomi che DRP1 era in grado di rimodellare L'utilizzo di questi modelli di lipidi adattabili, QFP e DRP1 sono stati trovati ad interagire in un ambiente più nativo in vitro. Questa tecnica ci ha permesso di controllare la relativa abbondanza di DRP1, QFP (attraverso NTA (Ni 2+) concentrazione), e lipidi specifici (cardiolipina e PE in particolare) che sembravano regolare l'assemblaggio di questo complesso macromolecolare. Come abbiamo dimostrato, questo metodo può essere utilizzato per visualizzare il rimodellamento membrana QFP reclutati DRP1 mediante microscopia elettronica, e per determinare gli effetti di DRP1 assemblaggio su sua attività catalitica mediante saggio di attività GTPasi. 71fig4.jpg "/> 
Figura 1: Preparazione Lipid schematica. (A) Al momento risospensione, liposomi di diverse dimensioni formano e consistono in unilamellare e multilamelvescicole lar, che si traduce in una soluzione opaca (riquadro). (B) congelamento-scongelamento i risultati della soluzione in una popolazione unilamellare di liposomi, che sono ancora eterogenei di diametro. Congelamento-scongelamento chiarisce la soluzione (nel riquadro). (C) estrusione della soluzione lipidica omogeneizza il diametro liposomi (1,0 micron in questo esempio), e si traduce in una soluzione limpida (inserto). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 2: metodi per valutare il montaggio delle proteine. Un gruppo di proteine socio raffigurante schematica su liposomi impalcatura è presentato. His-tagged proteine partner o GFP vengono incubate con liposomi impalcatura, e poi DRP1 è incubato con lipo decorate o non decorato Somes. Questi liposomi DRP1-preassemblato possono poi essere analizzati con metodi strutturali (microscopia elettronica) e saggi funzionali (test GTPasi). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 3: la valutazione delle strutture di DRP1 reclutamento. Negativo microscopio di trasmissione macchia di GFP o QFP decorate liposomi solo (A, B, rispettivamente) o incubate con DRP1 (C, D, rispettivamente). Barra di scala = 100 nm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Impalcatura liposomi enzimatica Assay. (A - C) La generazione di fosfato nel tempo è stata misurata (riquadro), e il k cat stata determinata. Questo metodo è stato applicato alle proteine SL-tethered (A), proteine SL / CL-tethered (B), o SL / PE / proteine CL-tethered (C). #: P <0.05, *: p <0,0001, **: p <0,000001 come determinato dal test t spaiato. Tutte le barre di errore rappresentano la deviazione standard da 3 campioni indipendenti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo offre un metodo per studiare le interazioni proteina-proteina che coinvolgono proteine integrali di membrana. Utilizzando un ponteggio liposoma modulare, investigatori sono in grado di valutare l'attività di una o più proteine in un ambiente lipidico-prossimale. Studi precedenti hanno dimostrato un metodo simile per gli enzimi del recettore della membrana plasmatica 24 - 26. Abbiamo ampliato questo metodo per incorporare cofattori lipidici ed esplorare le interazioni tra proteine che compongono il nucleo mechanoenzymatic della macchina fissione mitocondriale.
Per il sistema modello presentato sopra, abbiamo scoperto che QFP-decorato SL potenziata DRP1 auto-assemblaggio. Inoltre, ora dimostrare che, i modelli ESL QFP-decorate sono stati efficacemente ristrutturato da wild-type DRP1 per formare strutture tubolari estesi. Abbiamo anche valutato il ruolo dei vari lipidi mitocondriali, tra cui la cardiolipina carica negativa e il PE lipidi conica.Cardiolipin synergizes a MFF per migliorare ulteriormente DRP1 auto-assemblaggio, mentre la flessibilità e la fluidità di membrana impartita dal PE migliora tubulazione membrana, ma non ulteriormente aumentano la stimolazione QFP-indotta.
Per valutare i cambiamenti ultrastrutturali in morfologie membrana, EM analisi sono state richieste. Attività GTPasica DRP1 è stata elevata attraverso il clustering e l'assemblaggio di polimeri filamentosi che non rimodellare il liposomi a qualsiasi grande misura 2. Tuttavia, deformazione della membrana è stata osservata quando è stato utilizzato il più mitocondri-come SL template / PE / CL. È interessante notare che l'attività enzimatica non è stata migliorata. Pertanto, gli studi EM sono essenziali per identificare differenze fondamentali che altrimenti verrebbero perse utilizzando il saggio funzionale.
Mentre questa tecnica è potente per esplorare la funzione e l'interazione di proteine solubili e domini di proteine solubili, questi ponteggi lipidici non possono spiegare il ruolo di dominio transmembranaS. Questa è una considerazione importante perché il dominio transmembrana può effettuare processi proteici dinamiche come auto-assemblaggio 27 e diffusione laterale 28 - 30 in bistrati lipidici. Se questi fattori sono fondamentali per la valutazione delle interazioni proteina sulla superficie della membrana, esperimenti lipidica ricostituzione poi tradizionali con un detergente sarebbero favoriti. pastoie alternativi possono essere esplorati per controllare il reclutamento e la mobilità delle proteine di membrana ancorata.
Oltre a utilizzare le proteine His-tag NTA (Ni 2+) ancore lipidiche, altre pastoie, come 31 o reattivi lipidi gruppo coniugato biotina-coniugato possono essere utilizzati. Queste modifiche covalenti sarebbero più stabile proteine trappola in superficie dei lipidi, ma la mobilità e lo scambio di questi fattori sarebbe probabilmente essere diminuita. Come tale, la cordicella deve essere attentamente valutata nel contesto dei complessi proteici studiati. quando consideanello l'uso di questo metodo, il modo di legare proteine ai modelli lipidi hanno il potenziale per influenzare certi saggi. Per esempio, il His-tag tethering metodo NTA (Ni 2+) può essere più appropriato per saggi in situ piuttosto che esperimenti di separazione, soprattutto nel caso di transitori interazioni proteina-proteina. Questo è chiaramente dimostrato in figura 3 dalla discrepanza tra il negativo microscopia elettronica macchia in situ ed il dosaggio sedimentazione.
In futuro, una combinazione di due o più di questi lipidi di ancoraggio con distinte headgroups bersaglio potrebbe essere implementata per consentire l'assunzione di più proteine a un modello impalcatura senza concorrenza per un unico filo di collegamento dei lipidi. Inoltre, l'abbondanza relativa di ciascun componente può essere gestita modificando la composizione lipidica. Ulteriori cofattori lipidi, come fosfoinositidi, cardiolipina, e fosfatidilserina, possono essere facilmente introdottiin questi modelli per valutare l'impatto isolato di una varietà di fattori.
Nel complesso, questi ponteggi lipidi rappresentano una nuova piattaforma per lo studio delle interazioni delle proteine complesse vicino membrane lipidiche. Questi modelli sono facilmente generati e sono semplici da adattare ad una vasta gamma di diverse applicazioni, tra cui saggi enzimatici, microscopia elettronica, o imaging di fluorescenza. Inoltre, la composizione lipidica può essere formulato per assomigliare un organello o membrana microdomini di interesse ricapitolare migliore funzione proteica a queste regioni specifiche. Usando queste tecniche, biochimici in grado di sondare le complesse interazioni di membrana legato e proteine di membrana associate con i loro partner e il loro ambiente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
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