Abstract
Mesenquimales del estroma células madre / (MSC) son una gran promesa en la bioingeniería y la medicina regenerativa. MSCs se pueden aislar a partir de múltiples tejidos adultos a través de su fuerte adherencia a plástico de cultivo tisular y luego se expandieron adicionalmente in vitro, más comúnmente usando suero bovino fetal (FBS). Desde FBS puede causar MSCs para ser inmunogénico, su presencia en los cultivos de MSC limita las aplicaciones clínicas y experimentales de las células. (XF) medios libres de xeno Por lo tanto, los estudios que emplean definidos químicamente para cultivos de MSC son extremadamente valiosos. Muchos de los efectos beneficiosos de las MSC se han atribuido a su capacidad para regular la inflamación y la inmunidad, principalmente a través de la secreción de factores inmunomoduladores tales como necrosis tumoral gen del factor estimulada 6 (TSG6) y la prostaglandina E2 (PGE2). Sin embargo, las MSC requieren activación para producir estos factores y dado que el efecto de las MSC es a menudo transitoria, un gran interés ha surgido para descubrir maneras de pre-activación de las células prior a su uso, eliminando así el tiempo de retraso para la activación in vivo. Aquí presentamos los protocolos de activar de manera eficiente o MSC principales en tres dimensiones (3D) de las culturas XF en condiciones definidas químicamente y administrar estos MSC pre-activadas in vivo. Específicamente, primero se describen los métodos para generar MSC esférica micro-tejidos o "esferoides 'en gotas colgantes usando medio XF y demostrar cómo las esferas y el medio acondicionado (CM) se pueden cosechar para diversas aplicaciones. En segundo lugar, describimos pantallas de la expresión génica y en ensayos funcionales in vitro para evaluar rápidamente el nivel de activación MSC en esferoides, haciendo hincapié en el potencial anti-inflamatorio y anti-cáncer de las células. En tercer lugar, se describe un nuevo método para inyectar esferoides MSC intactas en la cavidad peritoneal del ratón para ensayos de eficacia in vivo. En general, los protocolos en este documento superar los principales retos de la obtención de las MSC pre-activadas bajo con XF químicamente definidocondiciones y proporcionan un sistema flexible para administrar esferoides MSC para las terapias.
Introduction
Mesenquimales madre / células del estroma (MSC) han mostrado un gran potencial para los diversos enfoques de medicina regenerativa. MSCs fueron aislados inicialmente como un componente del estroma de médula ósea, pero desde entonces se han obtenido a partir de numerosos otros tejidos adultos, incluyendo el tejido adiposo 1, 2, 3. Curiosamente, el método de aislamiento principal abarca la notable propiedad de MSCs se adhiera firmemente en plástico de cultivo de tejidos en presencia de suero bovino fetal (FBS). Si bien esta técnica de aislamiento tradicional permite la expansión fácil y rápida de las MSC en dos dimensiones-cultivo (2D), que también es muy artificial y no tiene en cuenta importancia del medio ambiente nativo en tres dimensiones (3D) que conduce a la pérdida potencial de importante características celular 4, 5 , 6. Por lo tanto, el estudio de las MSC en cultivos 3D, queson más fisiológica que los cultivos tradicionales en 2D, ha surgido en búsqueda de características MSC "perdidos / parcial". Por otra parte, un gran interés ha aumentado para identificar condiciones (XF) libre de xeno químicamente definido para el cultivo de MSC y activación, y de este modo hacer que las células sean más susceptibles para aplicaciones clínicas.
Muchos estudios se han publicados que demuestran la cultura 3D de MSCs tanto en biomateriales y como agregados esféricos o esferoides. MSC en biomateriales fueron diseñados inicialmente para los enfoques de ingeniería de tejidos para reemplazar tejidos dañados con andamios sembrado de células, mientras que no se observaron cultivos de esferoides de MSC como una manera de entender el comportamiento de MSC in vivo después de la administración de las células para terapias en ensayos preclínicos o clínicos 4, 5, 7. Curiosamente, MSC formar esferoides espontáneamente cuando no está permitido adherencia al plástico de cultivo de tejidos8, 9, 10. Tradicionalmente, la agregación de células fue facilitado por métodos matraz de agitación o técnicas de superposición líquidos, métodos utilizados inicialmente en la biología del cáncer en los esfuerzos para tratar de imitar el microambiente tumoral. Más recientemente, métodos adicionales han surgido que demuestran la agregación de células en placas de cultivo pre-recubierto con productos químicos específicos para evitar que la célula-a-plástico de adhesión 4, 5, 6. Uno de los métodos más simples y más económicos para generar esferoides MSC es a la cultura en gotas colgantes, una técnica que a menudo se utiliza para producir cuerpos embrioides a partir de células madre embrionarias. Con colgando técnica de cultivo gota, adherencia de las células al plástico de cultivo de tejidos se evita mediante la suspensión de las células en una gota de medio en la parte inferior de una tapa de placa de cultivo de tejido y permitiendo que la gravedad para facilitar AGGREG célulaación en el ápice de la gota. El tamaño esferoide puede ser manipulado fácilmente por el cambio de la concentración de células o el volumen de la gota, haciendo culturas gota colgante especialmente fácil de controlar.
Los primeros estudios sobre la cultura 3D de MSCs demostraron diferencias radicales en las características de las células en 3D en comparación con sus contrapartes 2D 6, 8, 9. Al mismo tiempo, los informes demostraron que los efectos beneficiosos de las MSC in vivo se basó en su capacidad de activarse por señales micro-ambientales y, en respuesta, para producir anti-inflamatorio e inmunomodulador factores de 11. Curiosamente, muchos de estos factores, tales como la prostaglandina E2 (PGE2), tumor necrosis gen del factor estimulada 6 (TSG6), y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) se produjeron en cantidades mucho mayores por esferoides MSC que MSCs 2D tradicionales allanando el camino para el idea deutilizando cultivos 3D para activar las células 8, 12, 13. Por otra parte, la activación de genes en cultivos 3D apareció recapitular mecanismos, al menos en parte, de la activación de células después de la inyección en ratones 12. Mediante la activación de las MSC antes de su uso en los experimentos, los efectos de las células podrían ser prolongados y más prominente como el efecto MSC tradicional in vivo a menudo se retrasa y transitorios, y puede ser descrito como "golpear y correr". Durante los últimos años, los estudios funcionales importantes utilizando esferoides MSC han demostrado que pueden suprimir las respuestas inflamatorias y modular la inmunidad in vivo al influir en las células efectoras, tales como macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, y células T que hacen esferoides una forma atractiva de MSCs imprimados 2 , 3. Además, la producción de moléculas anti-cáncer, tales como interleukin-24 (IL-24) y la necrosis tumoral relacionado con el factor inductor de apoptosis ligando (TRAIL), se incrementan en cultivos 3D de las MSC en relación con monocapa MSCs, un fenómeno que podría ser explotado para terapias contra el cáncer dirigidas 8, 10, 14.
A medida que la cultura tradicional de MSC requiere no sólo el uso de plástico de cultivo de tejidos, sino también de FBS, otro obstáculo para hacer esferoides MSC más favorable para el uso clínico se tuvieron que superar. Para hacer frente a este obstáculo, que recientemente mostró la formación de esferoides de MSC en condiciones específicas XF definidos químicamente y estableció que los esferoides MSC resultantes se activan para producir las mismas moléculas contra el cáncer anti-inflamatorio y como los esferoides generados en condiciones con FBS al 14. En este caso, estos resultados se presentan en varios protocolos detallados que demuestran la generación de MSC pre-activadas en cultivos 3D usando XFmedios de comunicación. Además, los protocolos se presentan que describen formas eficaces para evaluar los niveles de activación de las MSCs en cuanto a sus efectos antiinflamatorios, inmunomoduladores y anti-cáncer de efectos, junto con un método práctico para entregar los esferoides intactas en ratones.
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Protocol
1. Aislamiento de MSC y Expansión
- Obtener MSC principios de paso desde el Centro para la preparación y distribución de células madre adultas ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html~~number=plural ) 15 viales como congelados. Alternativamente, aislar las MSC de aspirados de médula ósea después de un protocolo de rutina 14 y conservar los viales como congelados.
- Preparar medio de cultivo completo (CCM), que es mínimo alfa medio esencial (aMEM) suplementado con prima de 15 a 20% seleccionar FBS, 2 mM L-glutamina y 1x de penicilina-estreptomicina. Esterilizar el medio por filtración.
- Colocar 30 ml de CCM en una placa de cultivo celular 150 mm y se incuba la placa durante 30 min a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO 2.
- Incubar el vial congelado que contiene aproximadamente 10 6 MSCs para 2 min en un baño de agua C 37 °.
- Transferir el contenido del vial a la placa de cultivo utilizando una pipeta serológica de 5 ml y lavar el vial varias veces con 1-2 ml CCM de la antena para capturar las células residuales. Coloque la noche a la mañana plato en una incubadora apropiada.
- lavar cuidadosamente la cultura dos veces con solución salina tamponada con fosfato temperatura ambiente (PBS) y separar las MSC con 3 ml de solución de pre-calentado 0,25% de tripsina / ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). El desapego por lo general tarda aproximadamente 3-4 minutos en la incubadora.
- Neutralizar la tripsina en el plato con 6 ml CCM pre-calentado a 37 ° C y la transferencia de la suspensión celular en un tubo cónico de 50 ml. Combinar con lavados de PBS para maximizar el rendimiento celular.
- Centrifugar las células (450 xg) durante 10 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las células en un pequeño volumen de CCM y contar las células viables utilizando un hemocitómetro y azul de tripano.
- Sembrar un número apropiado de placas de 150 mm a 100 células / cm 2
- Recoger las células como anteriormente con tripsina / EDTA y se combinan todas las células en un solo tubo cónico con el medio apropiado. Centrifugar de nuevo y volver a suspender las células en un pequeño volumen del mismo medio para el recuento de células. Utilice CCM estándar (que contiene FBS) o diversas formulaciones de medios XF disponibles en el mercado, aquí se hace referencia como XF medio-1 (XFM-1) y XF medio-2 (XFM-2), con y sin albúmina de suero humano (HSA, 13 mg / ml) la suplementación.
2. Preparación de esferoides Activado MSC en 3-D gota colgante cultivos bajo condiciones XF
- Para generar esferoides de aproximadamente 25.000 células, diluir las MSCs cosechadas en CCM, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 mg / ml), XFM-2, o XFM-2 + HSA (13 mg / ml) a 714 células / l.
- Pipetear 35 l / gotas de las células sobrela parte inferior de una cultura invertida tapa de la placa 150 mm. Varias gotas pueden ser fácilmente pipeta usando una pipeta multicanal.
NOTA: Si se desean esferoides más grandes o más pequeños, cambiar la concentración de células o el volumen de la gota (25-45 l) de manera apropiada. - Transferir 20 ml de PBS temperatura ambiente en la base del plato y en un movimiento continuo y constante voltear la tapa, que contiene las gotas, de modo que los ápices de la gota se enfrentan hacia abajo. Coloque la tapa cuidadosamente sobre la base de la placa de cultivo.
- Se pasa la placa en la incubadora durante 3 días sin perturbarla para permitir el montaje de la esfera apropiada.
- Después de 72 horas, comenzará la cosecha esferoide retirando la tapa con cuidado y se invierte para que las gotas, una vez más, la cara hacia arriba.
- Ángulo de la tapa de aproximadamente 10-20 ° y empujar las gotas, que contienen los esferoides, al borde de la placa de utilizar una grúa móvil.
- La transferencia de las esferas y medio en un tubo cónico de 15 ml con un tubo de 1.000 lTTE. Uso temperatura ambiente PBS y la pipeta con la misma punta para lavar la placa y asegurar la recuperación máxima de esferoides.
- Para los ensayos de PCR en tiempo real (protocolo 3), centrifugar la suspensión esfera a 450 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante. Lavar los esferoides con PBS y repetir los dos pasos de centrifugación y aspiración. Para la entrega en animales (protocolo 8), permiten que las esferas se asienten en el fondo del tubo (~ 3-4 min), sin centrifugación.
3.-PCR en tiempo real de los marcadores inflamatorios y anti-anti-cáncer
- Utilice el kit de extracción de ARN con columnas homogeneizador y DNasa libre de RNasa Set para aislar ADN libre de ARN total a partir de las MSC en monocapa (Protocolo 1) y esferoides MSC (Protocolo 2) que se lavaron con PBS y se centrifugó.
- Lyse al menos 100.000 MSCs monocapa y 20 esferoides de cada condición en distintos tubos de 15 ml cónicos con tampón RLT que contiene β-mercaptoetanol (1: 100).
- Transfer los lisados bien mezclados en tubos de 1,5 ml sin RNasa y colocar en un congelador (-80 ° C) durante al menos 3 horas para ayudar en la lisis esferoide.
- Descongelar los lisados de células en hielo y agitar brevemente, y siga las instrucciones del fabricante para el aislamiento de ARN utilizando un kit de aislamiento de ARN total de mamíferos disponibles comercialmente.
- Cuantificar y evaluar la calidad del ARN aislado utilizando un espectrofotómetro.
- Utilice el kit de cDNA de transcripción inversa o equivalente de acuerdo alta capacidad con las instrucciones del fabricante para generar ADNc para PCR en tiempo real.
- Colocar las muestras de ADNc, cebadores de PCR diseñados comercialmente en tiempo real / sondas (ensayos de expresión génica) y PCR Master Mix en hielo. Utilizar imprimaciones / sondas para GAPDH (control), PTGS2 (COX-2, anti-inflamatorio), TNFAIP6 (TSG6, anti-inflamatorio), TRAIL (contra el cáncer), e IL-24 (contra el cáncer).
- Preparar en tiempo real las reacciones de PCR según las instrucciones del fabricante para la expresión génica Ensayos y rápida UniveRsaI Master Mix.
- Siga las directrices para el instrumento en tiempo real PCR para generar los documentos de experimentación y la realización de la carrera.
- Analizar los datos utilizando el método ΔΔC T mediante el cálculo de los cambios relativos (cantidad relativa, RQ) en la expresión génica utilizando GAPDH como los MSCs de control y de monocapa endógenos como una línea de base 8, 14.
4. Recolección de CM para ensayos de inmunomoduladora y anti-cáncer de Potencial
- Cosechar los esferoides y CM como se describió anteriormente en un tubo cónico de 15 ml, de utilizar una grúa móvil y una pipeta, sin embargo, no se lava las tapas de los recipientes con PBS ya que esto va a diluir el CM.
- Centrifugar a 450 xg durante 5 min a temperatura ambiente, recoger cuidadosamente el sobrenadante libre de células con una pipeta, y transferir el sobrenadante a tubos de 1,5 ml.
- Se centrifuga a 10.000 xg durante 5-10 minutos a temperatura ambiente, recoger cuidadosamente el clCM arified con una pipeta, y transferir el CM en nuevos tubos de 1,5 ml para el almacenamiento en un congelador (-80 ° C). Preparar alícuotas de la CM antes de la congelación cuando se utiliza por múltiples ensayos.
NOTA: Antes de realizar ensayos de aguas abajo, la concentración de PGE2, un buen indicador del potencial antiinflamatorio de CM, se puede determinar utilizando un kit de ELISA comercial según las instrucciones del fabricante. Concentración TSG6 se puede determinar usando un protocolo publicado 14.
5. macrófagos Ensayo para evaluar el potencial antiinflamatorio del MSC-CM
- Preparar medio de macrófagos, que consiste en medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contiene L-alanil-L-glutamina y complementado con 10% prima seleccionar FBS y 1x de penicilina-estreptomicina. Filtros de esterilizar el medio.
- Obtener un vial congelado de aproximadamente 10 6 J774 macrófagos de ratón y se incuba el vial durante 2 min en un baño de agua C 37 °.
- Aspirar el sobrenadante, suspender los macrófagos en 1 ml de medio de macrófagos, y transferir los macrófagos en un 150 mm placa de Petri que contiene 30 ml de medio de macrófagos.
- Cambiar el medio cada 2 días y se incuban las células en la incubadora hasta que aproximadamente el 70-80% de confluencia.
NOTA: Los macrófagos no se adhieren firmemente a la placa de Petri, por lo tanto se debe tener cuidado de no perder las células con cambio de medio. - Cosecha de los macrófagos mediante la pulverización del medio de macrófagos en las células con una pipeta. Transferencia de las células en un tubo cónico de 50 ml y centrifugar durante 5 min a 200 a 300 xg y la temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y suspender las células en un pequeño volumen de medio de macrófagos para el recuento de células con un hemocitómetro. Ajustar la concentración de 200.000 células / ml con macrófagos míDium.
- Para iniciar la puesta a punto para el ensayo de macrófagos, añadir 480 l de medio de macrófagos en pocillos de una placa de 12 pocillos.
- Añadir 20 l de medio de macrófagos en los pocillos de control no estimulados y 20 l de no acondicionado o medio MSC-acondicionado, preparado anteriormente, en los pozos experimentales. Mezclar el medio en los pocillos golpeando suavemente la placa.
- Transferir 500 l de la suspensión celular de macrófagos a los pocillos de control no estimulados macrófagos.
- Estimular los macrófagos restantes con adición de 1: 500 a 1: 1000 de 0,1 mg / ml de lipopolisacárido (LPS) y se incuba 5-10 min a temperatura ambiente.
- Transferir 500 l de los macrófagos estimulados en los pocillos con medio no acondicionado o MSC acondicionado. Mezclar los pozos, colocándola de forma constante la placa varias veces.
- Colocar la placa en una incubadora durante 16-18 horas.
- Se recoge el medio acondicionado de macrófagos y centrifugar a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
- Transferirel sobrenadante a tubos nuevos y ensayo de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y (IL-10) contenido interleucina-10 por kits comerciales de ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante.
6. Splenocyte Ensayo para evaluar el potencial inmunomodulador de esferoide-CM
- Preparar medio de esplenocitos completa, que consiste en Rosewell Parque Memorial Institute (RPMI) -1640 medio suplementado con inactivado por calor 10% de FBS, 1x penicilina-estreptomicina, y 2-mercaptoetanol. Filtros de esterilizar el medio.
- Bazos cosecha de ratones machos sacrificados-BALB / C a través de una incisión preparada en el lado izquierdo del abdomen sobre el bazo, aproximadamente a medio camino entre la patas delanteras y traseras 14. Transferir el bazo a un filtro de células de 70 m para aislar los esplenocitos 14.
- Aislar los esplenocitos / linfocitos empujando los bazos a través del filtro de 70 micras en una placa de Petri estéril using del caucho blando / extremo de plástico de un émbolo de una jeringa de 14 ml 2-3. Utilice un movimiento circular de molienda para disociar los bazos.
- Lavar el filtro de células varias veces con PBS frío y transferir las células de la placa de Petri en un tubo cónico de 50 ml. Llenar el tubo con PBS frío y se centrifuga (500 x g) a 4 ° C durante 10 min.
- Aspirar el sobrenadante y borrar las células de los eritrocitos por incubación con 5-10 ml de solución de lisis de glóbulos rojos (por bazo) durante 5-10 minutos.
- Detener la lisis mediante la adición de PBS frío al tubo y centrifugar durante 5-10 min a 500 x g y a 4 ° C.
- Suspender las células aisladas en medio de esplenocitos completa, se filtra a través de un colador de 40 micras, y contar las células usando un hemocitómetro. Añadir medio de esplenocitos a la suspensión celular para lograr una concentración final de células de 10 6 células / ml
NOTA: Esta técnica produce típicamente aproximadamente 3 x 10 7 esplenocitos por bazo de ratón. - Transferencia 10 6 esplenocitos (estimulado o no estimulado) en pocillos de una placa de 12 pocillos y añadir no acondicionado (controles) o MSC-CM en los pocillos a una dilución final de 1: 10-1: 20.
- Se recoge el CM de esplenocitos después de 24 horas y se centrifuga a 500 g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Transferir el sobrenadante a nuevos tubos y ensayo para interferón gamma (IFN-γ) contenido por kit ELISA comercial siguiendo las instrucciones del fabricante.
7. Ensayo de cáncer de próstata para evaluar el potencial anti-cáncer de esferoide-CM
- Preparar medio completo de crecimiento RPMI que es medio RPMI-1640 suplementado con 10% de SFB, 1x penicilina-estreptomicina.
- Obtener un vial congelado de células de cáncer de próstata LNCaP y se incuba el vial durante 2 min en un baño de agua a 37 ° C.
- Transferir el contenido del frasco en una placa de cultivo que contiene 30 ml de medio de cultivo RPMI completo usando una pipeta motorizada y una pipeta serológica de 5 ml. Lavar los vial varias veces con el medio de la placa y se coloca el plato en la incubadora.
- Justo antes de que las células alcanzan la confluencia, se lava el cultivo dos veces con PBS temperatura ambiente y separar las células LNCaP con 3 ml de solución de tripsina / EDTA pre-calentado 0,25%.
- Neutralizar la tripsina en el plato con el medio completo de crecimiento RPMI y transferir las células junto con los lavados en un tubo cónico de 50 ml.
- Centrifugar las células a 450 xg durante 10 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante.
- Volver a suspender las células en pequeño volumen de medio completo de crecimiento RPMI y contar las células cancerosas usando un hemocitómetro.
- Para llevar a cabo un ensayo de crecimiento celular usando un kit de ensayo de proliferación celular, aspirar el medio de los pozos y la transferencia de la placa en un congelador (-80 ° C) durante al menos 3 h.
- Descongelar la placa y lisar las células de cada pocillo mediante la adición de 100 l de reactivo de lisis celular que contiene NaCl 180 mM, EDTA 1 mM, y 0,2 mg / ml de RNasa A.
- Para obtener una curva estándar, cantidades conocidas de lisar las células LNCaP tal como se describe anteriormente.
- Después de 1 hora, añadir 100 l de tampón de lisis celular 1x que contiene 1: 100 dilución de reactivo de ensayo de proliferación celular y medir la fluorescencia en cada pocillo para determinar la cantidad de células.
8. intraperitoneal de entrega de esferoides Intactos
- Preparar las MSC esferoides como se describió anteriormente (protocolo 2) y resuspender tél Esferas en solución estéril salina equilibrada de Hank (HBSS) suplementado con 0,2-0,5% de HSA para mantener las condiciones XF. HSA en la solución ayuda a evitar la adhesión esfera al plástico durante la inyección.
- Transferencia 40-120 esferoides en tubos de 15 ml cónicos y se lavan las células mediante la adición de 6 ml de HBSS / HSA a los tubos. Permitir 3-4 min para las esferas que descienden. Preparar un tubo cónico independiente de esferoides para cada animal. Además, se preparan tubos adicionales de esferoides para los ensayos de determinación de la retención de esferoides (véase 8.18 más adelante) y la producción de factores terapéuticos después de la transferencia (véase 8.19 más adelante) si se desea.
- Aspirar el sobrenadante, superponer los esferoides con 100-200 l de HBSS estéril suplementado con 0,2-0,5% de HSA, y colocar los tubos en hielo.
- Brevemente anestesiar los animales con 2% de isoflurano en oxígeno al 100% hasta la desaparición de reflejo de pinch-dedo del pie durante aproximadamente 2 min en la cámara de inducción.
- Colocar el animal en el interior del armario de BSL-2, Aspe dorsalct abajo (lado ventral hacia arriba), con el flujo continuo de la mezcla de isoflurano / oxígeno 1,5% a través de un cono de nariz.
- Limpiar la parte inferior del abdomen del ratón con un alcohol antiséptico como el 70%.
- Retire la tapa de la 20 G intravenosa (iv) de catéter y realizar la inyección intraperitoneal con el conjunto de catéter-estilete. Utilice una mano para sostener la piel del ratón y otra para realizar la inyección. Localizar el punto de la inyección aproximadamente en el centro de una línea artificial que conecta un área conjunta y genital rodilla flexionada con la punta de la aguja apuntando hacia la línea media.
NOTA: El conjunto de catéter-estilete tiene una resistencia más alta que una aguja normal, por lo tanto, la atención tiene que ser tomado como no inyectar la aguja demasiado profunda en el abdomen, lo que podría provocar lesiones a los órganos internos. La penetración de la piel y luego membrana peritoneal músculos / se puede sentir durante la colocación del catéter. - Retire con cuidado el estilete de metal / aguja del conjunto de catéter-estilete. Check el estilete de la sangre, la orina y las heces y lo descarta. Blood en la aguja de punción indica de órgano (s) interna.
- Mantenga el catéter de plástico en una posición vertical durante las inyecciones para permitir el flujo de fluido.
- Confirmar la colocación apropiada del catéter de plástico por inyección de aproximadamente 100 l de HBSS estéril / HSA a través del catéter utilizando una pipeta con una punta de 100 a 200 l. Coloque el extremo de la punta de la pipeta en el interior del adaptador de jeringa catéter de formación de un sello hermético. inyectar lentamente el fluido dentro de la cavidad peritoneal.
NOTA: El líquido en un catéter colocado correctamente fluirá libremente dentro de la cavidad peritoneal con solamente ajustes menores del catéter. La colocación incorrecta del catéter (subcutánea o intra-intestinal, o si la punta de la aguja heridos órganos peritoneales como el riñón) aumentará la resistencia y reducir el flujo. colocación subcutánea dará lugar a una formación de una "burbuja" obvio debajo de la piel. - recoger tél MSC esferoides, preparados de 100 a 200 l de HBSS / HSA (etapa 8.3), usando una punta de pipeta 200 l, y la transferencia de todo el volumen de las esferas (40-120 esferas) en la cavidad peritoneal a través del catéter como se describe anteriormente.
- Lavar el tubo que contiene esferas con 100 l de HBSS / HSA utilizando la misma punta como anteriormente para recoger cualquier esferoides residuales e inyectarlos en la cavidad peritoneal.
- (Opcional) Inyectar una 100 l adicionales de HBSS / HSA en la cavidad peritoneal para lavar el catéter.
- Coloque la almohadilla de gasa empapada en antiséptico sobre el catéter y retirar lentamente el catéter de la cavidad peritoneal y lo descarta.
- masajear suavemente la cavidad peritoneal con los dedos para asegurar una distribución uniforme de los esferoides.
- Deje que el animal se recupere bajo una estrecha supervisión y controle si tiene sangrado en el lugar de la inyección.
- Inspeccionar el catéter y el tubo de 15 ml de las esferoides restantes. Es normal observar algunas esferas de lacatéter / tubo.
NOTA: La técnica descrita para la entrega esferoide MSC se puede adoptar para su uso en animales normales o en una variedad de modelos de lesión. Esta técnica se ha utilizado con éxito para inyectar esferoides en la lesión corneal ratón y modelos de endotoxemia, así como en un modelo de peritonitis inducida por zymosan 8. - Para cuantificar el número de esferoides retenidas (opcional), utilice un número de células kit de cuantificación / reactivo basado en el ADN. Mantenga el catéter usado sobre el tubo 15 ml y dispensar vigorosamente HBSS / HSA a través del catéter para forzar cualquier esferas restantes de nuevo en el tubo de 15 ml.
- Centrifugar el tubo de 15 ml a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante. Transferir el tubo que contiene el sedimento esferoide en un congelador (-80 ° C) durante al menos 3 h.
- Descongelar el tubo y la lisis de las esferas mediante la adición de 500 l de reactivo de lisis celular que contiene NaCl 180 mM, EDTA 1 mM, y 0,2 mg / ml de RNasa A.
- Para un control, freeze y lisar una cantidad conocida de esferoides (preferiblemente equivalente al número de esferoides preparados para una sola inyección) como se describe anteriormente.
- Después de 1 hr, la transferencia de 100 l de lisado celular, por duplicado, en una microplaca de 96 pocillos y añadir a cada pocillo 100 l de tampón de lisis celular 1x que contenía una dilución 1:50 de reactivo de ensayo de proliferación celular del kit. Después de 10 min, se mide la fluorescencia en cada pocillo para determinar el número de esferas que no se inyecta mediante la comparación de la muestra experimental (s) con la muestra de control.
- Evaluar el nivel de activación de esferoides preparados para inyección (opcional) mediante la medición de la concentración de PGE2 y TSG6 producido por esferas transferidos. Transferencia 40-120 esferas a través del catéter, como se describe anteriormente, en una placa de 12 pocillos o 6 pocillos que contiene 1 o 2 ml aMEM suplementado con 2% de FBS y 1x penicilina / estreptomicina. Colocar las placas en la incubadora durante 6 horas.
- Pasar el medio delos pocillos después de 6 h en 1,5 o tubos de 15 ml y centrifugar los tubos a 450 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
- Transferir el sobrenadante libre de células en tubos de 1,5 ml frescos utilizando una pipeta y se centrifuga a 10.000 xg durante 5 a 10 min a temperatura ambiente.
- Transferir el CM clarificado (sobrenadante) en nuevos tubos de 1,5 ml y el ensayo para la concentración de PGE2 (buen indicador del potencial antiinflamatorio de CM) usando un kit de ELISA comercial según las instrucciones del fabricante. Concentración TSG6 se puede determinar usando un protocolo publicado 14.
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Representative Results
En el presente trabajo, se emplearon cultivos que cuelgan de gota compactos para generar micro-tejidos esféricos o esferoides '' de MSC activa en condiciones XF. La hoja de ruta de investigación en la Figura 1 muestra que las MSC se les anima a la auto-ensamblan para formar esferoides cuando se suspenden en cuelgan gotas durante 72 horas, después de lo cual los esferoides, o el CM cargados de factores terapéuticos esfera derivados, se pueden recoger y potencialmente utilizados en los dos investigación y aplicaciones clínicas. El gran número de células necesarias para la producción de esfera puede ser adquirido dentro de una semana por la siembra de las MSCs a baja densidad, típicamente 100-200 células por cm 2, y luego expandir las células durante 6-7 días hasta que aproximadamente 80% de confluencia (Figura 2 ). Cinética de crecimiento celular, determinado por el recuento de células viables al día, indicaron que una fase de fuerte expansión (día 3-7) sigue una breve fase de latencia de 1-2 días (Figura 2C </ Strong>). MSC en el paso 2 o 3 generalmente producen 50-100 millones de células a partir de un único vial de 1 millón de células criopreservadas cuando se cultivan en CCM.
Después de la expansión y la cosecha, las MSC se suspenden en alta concentración celular para generar esferoides, típicamente 500-1000 células por microlitro. Colgantes culturas gota se preparan mediante la transferencia de 25-40 gotas mu l de medio que contiene las MSCs en la parte inferior de una tapa de la placa de cultivo de tejidos, que posteriormente se da la vuelta y apropiadamente posicionada en la base del plato (Figura 3). Cuando se suspenden en 35 gotas l de CCM a 714 células por l (es decir, 25.000 células por gota), MSCs primero se ensamblan para formar pequeños agregados que eventualmente se unen para generar una sola esfera compacta en 72 horas en el vértice de la gota (Figura 3C). Esferoides también forman más de 72 horas en varios tipos de medios disponibles en el mercado XF optimizados para la expansión de MSC, Aquí se hace referencia como XFM-1 y XFM-2. Sin embargo, la formación de esferas compactas individuales en XFM-1 requiere la suplementación con 13 mg / ml de albúmina de suero humano (HSA), una concentración que refleja el contenido de proteína total estimado en CCM (Figura 3D). Esferas compactas individuales no forman fácilmente en XFM-1 básica sin HSA o en aMEM libre de proteínas (Figura 3D). Durante el montaje esfera, los cambios de fenotipo MSC radicalmente (Figura 4), y cuando en el medio XF definido químicamente apropiado (es decir XFM-1 + HSA), la expresión de numerosos factores anti-inflamatorios son upregulated incluyendo PGE2 y TSG6 (Figura 4C). Sin embargo, la producción de PGE2 y TSG6 no es aumentado notablemente en las MSC cultivadas como esferas en XFM-2 o XFM-1 sin HSA (Figura 4C). Cabe destacar que estos factores anti-inflamatorios, así como los factores anti-cáncer TRAIL y IL-24, se altamente upregulated en MSCs esferoide con relación a monocapa MSCs, cuando tEsferas que se cultivaron en XFM-1 suplementado con HSA recombinante (HSAr) o grado clínico HSA (CHSA) preparado a partir de sangre humana (Figura 4D).
Para evaluar el potencial terapéutico de las esferas de MSC se prepara en diversas formulaciones de medios, varias pruebas prácticas se llevan a cabo (Figura 5). Las propiedades inmuno-moduladores de esferoides se determinan primero in vitro mediante la medición de los efectos de la esfera CM en los niveles de citoquinas producidas por macrófagos estimulados con LPS y los esplenocitos estimulados con CD3 / linfocitos (Figura 5). CM de MSC esferas cultivaron en CCM y XFM-1 / HSA producción notablemente reprimida de macrófagos TNF y IFN de esplenocitos, mientras que al mismo tiempo niveles mejorados de la citoquina antiinflamatoria IL-10 (Figura 5A y 5B). Las propiedades anti-cáncer de esferas se evalúan mediante la medición de los efectos de la esfera o CMcrecimiento n y la morfología de las células de cáncer de próstata LNCaP. El medio XF XFM-1 / HSA reduce eficazmente la proliferación de LNCaP similar a la que contenía FBS al CCM (Figura 5C y 5D).
Es importante destacar que, esferas MSC intactos se pueden administrar en la cavidad peritoneal de los ratones para probar la actividad anti-inflamatoria de las células in vivo (Figura 6). Para estos experimentos, las esferas se preparan para inyección en HBSS que contiene una baja concentración de HSA, lo que minimiza su adhesión a un tubo de plástico preservando al mismo tiempo un estado XF. Posteriormente, las esferas se pueden inyectar fácilmente después de la transferencia desde el tubo de recogida (Figura 6A), utilizando una pipeta (Figura 6B), a través de un conjunto de aguja / catéter (Figura 6C y 6D) colocado apropiadamente para una inyección intraperitoneal estándar. Usando este enfoque, esferoides MSC pueden ser regularmentetransferido a un rendimiento superior al 90% (Figura 6E y 6F) sin interrumpir su integridad (Figura 6G y 6H). La colocación incorrecta de la punta del catéter dentro de la cavidad peritoneal conduce a la mala entrega esfera y alta retención (Figura 6F). Es importante destacar que, el nivel de retención de esfera dentro de la pipeta / catéter se puede determinar cualitativamente mediante inspección visual, o cuantitativamente mediante la recopilación / lisis de las esferas retenidas y medir el número de células con un reactivo de cuantificación de células basada en el ADN / kit disponible comercialmente (Figura 6F). El análisis de retención de esfera después de la inyección ayuda a crear criterios de inclusión / exclusión durante la experimentación. En particular, la capacidad de MCP-1 y XFM / HSA esferoides para secretar altos niveles de PGE2 TSG6 y se mantienen al menos 6 horas después de la transferencia de las esferas de colgar las culturas de caída (Figura 6I). Similar a su in vitro efdefectos, esferas XFM-1 / HSA inyectados en la cavidad peritoneal de los ratones, inmediatamente después de la inducción de la inflamación sistémica por administración iv de LPS, el aumento de PGE2 y los niveles de IL-10 en el peritoneo mientras que disminuye pro-inflamatoria TNF (Figura 6J).
Figura 1: Representación esquemática de la plataforma desarrollada para aprovechar el secretoma de MSC cebados como esféricas micro-tejidos en condiciones XF. Después de la expansión como cultivos monocapa (1), las MSC se suspenden en colgando gotas de la tapa de una placa de cultivo (2) a una concentración celular alta para activar / cebar las células. Después de 72 horas, tanto el (3) medio condicionado (CM) y (4) esferoides intactos pueden ser cosechadas a partir de las gotitas y se utilizan en diversas aplicaciones posteriores. El CM es rico en factores inmunomoduladores, así como otra COMPON terapéuticoentos. Los esferoides compactos que se forman en gotas colgantes se pueden transferir fácilmente utilizando una pipeta (5) y efectivamente administrado in vivo a través de un catéter (6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: características de crecimiento de las MSC derivadas de médula ósea en cultivos en monocapa. MSCs en el paso 2 se sembraron a baja densidad (100 células por cm 2) en 15 platos cm (15.000 células por placa) y se cultivaron durante 7 días en CCM. El medio se cambió en el día 3 y de nuevo el día 5 o 6 (24 a 48 h antes de la cosecha). Representativos micrografías de contraste de fase de las MSC de 3 días (A) y 7 días (B) después de la siembra de las células. Barra de escala = 200 micras. (C) Cinética de crecimiento de MSCobtenido a partir de 3 donantes se determinó contando el número de células adherentes viables diariamente desde el día 2 hasta el día 7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Preparación de colgar las culturas de caída para la imprimación de esferoides de MSC en un medio XF. (A) fotografía que representa la técnica a la capa rápidamente colgando gotas en la parte inferior de una tapa de placa de cultivo tisular. (B) Fotografía que ilustra colgante cae después de la inversión y el posicionamiento de la tapa sobre la base de plato. (C) los cambios dependientes del tiempo en la agregación de 25.000 MSC en una gota que cuelga como se visualiza mediante microscopía de contraste de fase. El objetivo se centró en el ápice de la gota. Barra de escala = 500 micras. (D) Images de esferas MSC formaron después de 3 días en las culturas que cuelga gota utilizando diversas formulaciones de medios que incluyen aMEM con y sin FBS (es decir CCM), XFM-1 con y sin HSA, y XFM-2 con y sin HSA. Barra de escala = 200 micras. Los datos en el panel D se obtuvieron del artículo original con el permiso del editor 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación de la activación de MSC en 3-D culturas XF. (A) Esferas / CM se cosechan después de 72 horas por inversión / inclinación de la tapa de la placa y obligando a las gotas hasta el borde de utilizar una grúa móvil. Esferas ensambladas a partir de 25.000 células se pueden visualizar fácilmente durante la recogida. (B) Fotografía de aproximaciónmadamente 500 esferas recogidas de tapas de numerosas placas de cultivo de tejidos. Esferas descienden rápidamente a la parte inferior del tubo sin centrifugación. (C) Nivel de PGE2 secretada a partir de esferas de MSC después de 72 hr se midió por ELISA. Real-time RT-PCR se utilizó para medir los niveles de TSG6. Tanto TSG6 y PGE2 son marcadores valiosos para la detección de la activación de MSC en esferoides. El medio XF XFM-1 + HSA mostró alto nivel de PGE2 y la producción TSG6 (cajas de color rojo). Los datos se muestran como media ± desviación estándar y se analizaron mediante la prueba t de Student (*** p <0,001, en comparación con la muestra aMEM). (D) los ensayos de ELISA y PGE2 en tiempo real de RT-PCR en esferas producidas en CCM y XFM-1 suplementado específicamente con 13 mg / HSA recombinante ml (rHSA), o HSA (CHSA) grado clínico preparado a partir de sangre venosa humana. Plegables cambios fueron determinados a partir de MSCs monocapa adherentes (RQ = 1). Los datos se muestran como media ± desviación estándar y se analizaron mediante la prueba t de Student (** p <0,01, *** p <0,001, en comparación conmonocapa MSC). Algunos datos en los paneles C y D se obtuvieron del artículo original con el permiso del editor 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: En ensayos funcionales in vitro para la evaluación de las propiedades anti-inflamatorias y anti-cáncer de MSC-CM recogidos de las culturas que cuelga gota. (A) Los resultados representativos de los ELISA que muestran los efectos de la esfera CM (CCM y XFM-1 / HSA) sobre la producción de TNF e IL-10 por los macrófagos de ratón estimulados con LPS (MQ). (B) Los resultados representativos de ELISA que muestran los efectos de la esfera CM (CCM y XFM-1 / HSA) sobre la producción de IFN por esplenocitos de ratón (SPL) estimulados con un anticuerpo anti-CD3. Micrografías (C) de contraste de fase de células de cáncer de próstata LNCaP tratadas con CCM básica y XFM-1 / HSA o medio condicionado (CM) a partir de esferas MSC preparados en CCM y XFM-1 / HSA. células LNCaP se cultivaron en medio RPMI (control). La barra de escala es de 200 micras. (D) los cambios cuantitativos en el crecimiento de las células de cáncer de próstata LNCaP se determinó con un reactivo basado en el ADN cuantificación de células / kit disponible en el mercado. La línea punteada indica densidad de siembra de 5.000 células por pocillo. Los datos de todos los paneles se muestran como media ± desviación estándar, y se analizaron mediante la prueba t de Student (*** p <0,001). Algunos datos de todos los paneles se obtuvieron de los artículos originales con permiso de la editorial 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 6: Transferencia Eficiente de esferoides MSC intactas, preparadas bajo condiciones XF, utilizando un sistema de aguja 20G IV / catéter. (A) fotografía representativa de un tubo cónico de 15 ml con XFM-1 / HSA MSC esferas preparadas para la inyección en HBSS que contienen 0,2% de HSA. (B) fotografía representativa de las esferas de MSC después de la aspiración en una punta de pipeta de 200 l. (C) Imagen de la asamblea 20 G aguja / catéter utilizado para administrar esferoides MSC intactas en ratones. (D) La imagen que demuestra la colocación apropiada de la punta de la pipeta en el adaptador del catéter de poliuretano. (E) La imagen de las esferas MSC inmediatamente después de pasar a través del catéter en una placa de cultivo. Aproximadamente se transfirieron 95 esferas de 100. (F) La eficiencia de la entrega esfera en la cavidad peritoneal de los ratones se determinó mediante la recopilación / esferas de lisis retenidos en elel número de células de medición de pipeta / catéter y, a través de un ensayo de cuantificación de células basada en el ADN comercial, en relación con el número de células obtenidas de un complemento completo de esferas lisadas. Línea roja punteada indica un índice de transferencia del 90%. se observó entrega esfera Poor (71%) con una inyección (flecha). (G) micrografías de contraste de fase de esferas en el panel E (vista ampliada). Barra de escala = 200 micras. (H) Micrografía de contraste de fases de un XFM-1 / HSA esfera 16 hr después de la transferencia a una placa de cultivo tisular. El fibroblástica, la morfología en forma de huso de las MSC se mantiene en las células que migraron fuera de la esfera. Barra de escala = 200 micras. Ensayos (I) ELISA para los factores anti-inflamatorios TSG6 y PGE2 se realizaron en CM recogieron 6 horas después de la transferencia de las esferas en placas de 6 pocillos que contenían 2 ml aMEM / 2% de FBS. Esferas preparadas en el medio XF XFM-1 / HSA mostraron mayor nivel de TSG6 y secreción de PGE2 (cajas de color rojo). Los datos, expresados como la mediaSD ±, se analizaron mediante la prueba t de Student (*** p <0,001, en comparación con la muestra aMEM). Algunos datos se obtuvieron del artículo original con el permiso del editor 14. (J) gráficos representativos que ilustran la capacidad de los esferoides, se inyecta en la cavidad peritoneal, para aumentar PGE2 peritoneal y IL-10, mientras que la disminución de nivel de TNF en ratones estimulados por inyección intravenosa de endotoxina (LPS). Las muestras se obtuvieron por lavado peritoneal 6 hr después de la inducción de la inflamación y la entrega de 80 esferoides. Los datos, expresados como media ± desviación estándar, fueron analizados por la prueba t de Student (* p <0,05, ** p <0,01, en comparación con el control). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El MSC óptima para su uso en algunas aplicaciones de investigación y clínicos debe ser altamente activa para maximizar su beneficio, y preferentemente prepara en condiciones XF definidos químicamente para reducir al mínimo la entrega de antígenos potenciales a partir de los componentes del medio xenogénicos tales como FBS. En los protocolos descritos aquí, hemos demostrado a los métodos 1) activar las MSC en cultivo 3D mediante la formación de esferoides, 2) lograr la activación 3D de las MSC en condiciones XF, 3) evaluar los niveles de activación de las MSC esferoide en cuanto a su anti- inflamatorio, inmuno-modulador, y el potencial anti-cáncer, y 4) entregar MSCs activados como esferoides intactas en ratones.
MSCs son células madre multipotentes que se pueden aislar a través de la adherencia de plástico de numerosos tejidos de adultos, incluyendo la médula ósea y el tejido adiposo. MSCs se propagan fácilmente en plástico de cultivo de tejido bajo relativamente alta (10-20%) concentraciones de FBS, expresar un conjunto distinto de marcadores de superficie, yse pueden diferenciar al menos en adipogénica, osteogénica y condrogénica linajes 1, 16, 17, 18. MSCs se ha demostrado que ejercen efectos beneficiosos en varios modelos animales de enfermedades humanas, a pesar de que parecen persistir sólo transitoriamente después de su administración in vivo. Por lo tanto, el efecto de las MSC se ha llamado "Hit and Run" y es a menudo mediada por los factores paracrinos antiinflamatorias e inmunomoduladoras, tales como PGE2, TSG-6, y indoleamine 2,3-dioxigenasa (IDO), secretadas por las MSC 2 , 3, 11, 19, 20, 21. Sin embargo, con el fin de producir estos factores, las MSC requiere activación, ya sea a través de señales de un tejido dañado o de c inmuneells del destinatario. Posteriormente, ha habido un interés creciente para desarrollar protocolos de pre-activación o cebado MSC antes de la entrega de las células en animales o pacientes 22. Además, la presencia de componentes antigénicos FBS en preparaciones estándar MSC ha expresado su preocupación. Por lo tanto, se han realizado estudios para determinar las condiciones XF definidos químicamente óptimas para los cultivos de MSC. En nuestro trabajo reciente, primero mostramos que las MSC pueden ser activados en 3D mediante la formación de esferoides, y luego descubrimos que la activación de células también se puede lograr en condiciones específicas XF 8, 12, 13, 14.
Las técnicas de cultivo de células en 3D se han utilizado durante décadas con el objetivo de proporcionar verdaderas condiciones fisiológicas en la investigación basada en células. Los cultivos en 2D caso omiso de la naturaleza 3D de los tejidos y por lo tanto no siempre se recapitulanla célula de la célula a y las interacciones célula a matriz importantes en la señalización celular. Muchas técnicas de cultivo 3D utilizan vasos rotativos, matraces de agitación, o varias superficies no adherentes, sin embargo, el mayor inconveniente en muchos de estos métodos es la heterogeneidad del tamaño del esferoide generado y / o el requisito de un equipo costoso específico. La investigación también se ha realizado usando cultivos gota colgante que fomentan esencialmente MSCs a espontáneamente agregado en una sola esferoide 4, 5, 6, 7, 8, 9, 23. Cabe destacar, que cuelgan culturas gota de la ayuda de montaje de micro-tejidos / agregados relativamente uniformes, con el beneficio añadido de ser capaz de manipular fácilmente el tamaño del agregado de células mediante el ajuste de la concentración de células y / o volumen de la gota. Por otra parte, el dominio de la cortina dROP técnica de cultivo no requiere una amplia formación. Las gotas de 25 a 40 l se pueden preparar fácilmente con MSCs a altas concentraciones de células, típicamente 500-1.000 células por l. Las gotas más pequeñas de 20 l tienden a evaporarse rápidamente, y con más de 45 l menudo manchan a través de la tapa durante la inversión. Sin embargo, cuando lanzar una tapa que contiene gotitas de cualquier tamaño, velocidad y direccionalidad son parámetros críticos a considerar para el mantenimiento de la tensión superficial y la forma apropiada de la caída / esferoide. cultura ininterrumpida y flujo de aire adecuado en la incubadora también son importantes para asegurar el agregado MSC en una sola esfera dentro de cada gota.
Una desventaja de esta técnica es que las placas que contienen gotas colgantes no deben ser apilados en la incubadora o se mueve durante el montaje esfera, haciendo escala-up para las terapias de pacientes difíciles. Por otra parte, el cambio medio en el que cuelga culturas gota es extremadamente difícil, por lo tanto cultivos a largo plazo debe ser avoided. Además, la baja relación de medios a célula en gotas colgantes puede causar agotamiento de los nutrientes y la acumulación de residuos que finalmente llevan a la pérdida de importantes funciones celulares y / o muerte celular.
Sin embargo, con la técnica apropiada gota colgante, hemos demostrado que las MSC en esferoides se convierten en altamente activo o cebado, en que las células se vuelven fábricas de las moléculas potentes anti-inflamatorios PGE2 y TSG6, así como las moléculas anti-cáncer de IL-24 y SENDERO. Hemos demostrado que esferoides MSC son, en efecto antiinflamatorio e inmunomodulador, y tienen propiedades anti-cáncer superiores a sus homólogos de una sola capa 2D en numerosos ensayos funcionales utilizando macrófagos cultivados, los esplenocitos y células de cáncer de próstata 8, 12, 13, 14. Además, hemos demostrado que esferoides MSC pueden ejercer efectos antiinflamatorios potentes cuando se administranen la cavidad peritoneal de ratones con peritonitis 8. Específicamente, se demostró que grandes esferoides de aproximadamente 400 a 500 micras de diámetro (25.000-30.000 MSC cada uno) se pueden entregar de manera eficiente en un pequeño volumen de HBSS usando un conjunto de aguja 20G / catéter y una pipeta estándar. Con esta técnica, la colocación del catéter inadecuada, lo que resulta en una alta resistencia al flujo de fluido, se puede determinar fácilmente antes de esferoide transferencia inyectando primero un pequeño volumen de HBSS / HSA tal como se describe en los protocolos. Los esferoides en un catéter colocado correctamente fluirán libremente, siempre que el HBSS se complementa con HSA para reducir al mínimo la adherencia esfera para el tubo de plástico, y se puede visualizar fácilmente. Además, esta técnica evita la tensión de corte sobre las células que se pueden producir usando una aguja / jeringa estándar para inyección, y evita la necesidad de una incisión quirúrgica que conlleva un mayor riesgo de infección y es técnicamente más difícil. Una desventaja importante es tsombrero de un gran número de esferoides sólo pueden ser inyectados en las cavidades del cuerpo amplias, tales como la cavidad peritoneal, como la resistencia contra la transferencia de la esfera a través del catéter es alta en áreas estrechas.
También hemos demostrado que el mismo nivel de activación de MSC en esferoides se podría lograr mediante el uso de un medio de XF disponible en el mercado específico, denominado aquí como XFM-1, con tal de que se complementó con HSA obtenidos a partir de sangre humana o preparados a través de técnicas recombinantes 14. Es importante señalar aquí que esferoides MSC no producen altos niveles de PGE2 y TSG6 en todos los tipos de medios de XF 14, probablemente porque la mayoría de medios XF para MSCs se formularon inicialmente para la expansión óptima de las células en 2D. También es importante tener en cuenta que los diferentes tipos de HSA varían en su potencia 14. Además, el nivel absoluto de PGE2 detectó en CM de esferoides activadas pueden variar ligeramenteLy como el ELISA empleado para PGE2 es de hecho un ensayo de competición. Por lo tanto, es crucial para incluir controles adecuados en cada PGE2 ELISA y evitar directamente la comparación de datos entre las muestras ensayadas en diferentes momentos o en diferentes placas. Por otra parte, las MSC se lavarán a fondo en un medio XF antes de preparar colgante gotas con el fin de eliminar CCM residual y, por lo tanto, limitar el arrastre de componentes de FBS. Los protocolos descritos aquí se pueden adoptar fácilmente para evaluar otras formulaciones de medios en la formación de la esfera y la expresión del gen terapéutico.
Claramente, numerosos eventos de señalización celular que normalmente no se producen en 2D MSC se ponen en marcha cuando las MSC se cultivan en 3D. Cell-a-célula y las interacciones célula a matriz, mediada por la formación de esferoides cadherinas e integrinas guía y compactación 24, 25, 26 y es probable crítico para la terapia esferoide. Como las células agregada y coMpact en esferoides, varias señales de estrés, incluyendo apoptosis menor, ayuda en el proceso de la activación del MSC que da como resultado la producción de numerosos factores potencialmente terapéuticos 4, 5. Anteriormente puso de manifiesto el papel fundamental de autocrina de IL-1 de señalización en la activación y la producción de PGE2 y TSG6 12 MSC. Aunque queda mucho por conocer acerca de las diversas vías de señalización que ayuda en la activación del MSC, la plataforma de la cultura de la gota colgante proporciona una forma práctica de estudiar este fenómeno y mejorar las terapias basadas en MSC. En general, hemos descrito, en los protocolos de aquí, los medios de activación o cebado MSCs en cultivos 3D, en condiciones XF definidos químicamente, para producir anti-inflamatoria, inmunomoduladora, y factores anti-cáncer. También hemos descrito cómo estos esferoides MSC intactos se pueden entregar en vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-α (minimal essential medium alpha) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM) |
| FBS (fetal bovine serum), premium select | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | component of complete culture media for all types of cells |
| L-glutamine | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | component of complete culture media for all types of cells |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | component of complete culture media for all types of cells |
| Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | media sterilization |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | D8554 SIGMA | cell culture |
| Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Model 3110 | incubation of cultured cells |
| Early passage MCSs | Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White | NA | preparation of 2D and 3D cultures of MSCs |
| water bath | VWR | 89501-468 | warming media to 37 °C |
| Pipettes | Eppendorf | 492000904 | manual liquid handling |
| Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | handling sereological pipetes |
| Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | liquid handling |
| PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | cell culture processing |
| 0.25% trypsin/EDTA solution | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | lifting adherent cells and dispersing cell aggregates |
| 15 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352097 | cell centrifugation |
| 50 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352098 | cell centrifugation |
| Eppendor refrigerated centrifuge | Eppendorf/Fisher Scientific | Model 5810R | cell centrifugation |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 26716 | cell counting |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer |
| Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells |
| Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells |
| HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Component of xeno-free MSC media |
| rHSA (recombinant Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Component of xeno-free MSC media |
| Total RNA isolation Mini Kit | Qiagen | 74104 | Total RNA extraction |
| Qiashredder | Qiagen | 79654 | Sample homogenization prior to total RNA extraction |
| RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | On-column DNA elimination during total RNA extraction |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 ALDRICH | inhibition of RNAses in RLT buffer |
| Vortex | VWR | 97043-562 | mixing sample |
| Spectrophotometer | Biorad | NA | RNA concentration and quality |
| High capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | transcription of total RNA into cDNA |
| Gene Expression Assays | ThermoFisher/Applied Biosystems | varies | primer/probe combination for real-time PCR |
| Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | master mix for real-time PCR reaction |
| Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | real-time PCR |
| 1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | cell centrifugation, sample collection and storage |
| (-80 °C) freezer | Thermo Fisher | Model Thermo Forma 8695 | sample storage |
| PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit | R&D Systems | KGE004B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024;10566-032 | macrophage culture media |
| J774 mouse macrophages | ATCC | TIB-67 | mouse macrophage cell line |
| 12-well plate | Corning | 3513 | in vitro macrophage stimulation |
| LPS (lipopolysaccharide) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro macrophage stimulation |
| Mouse TNF-a ELISA kit | R&D Systems | MTA00B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit | R&D Systems | M1000B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| RPMI-1640 medium | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | splenocyte culture media |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation |
| Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | in vitro splenocyte stimulation |
| 70 μm strainer | Corning | 352350 | Splenocyte preparation |
| Red blood cell lysis solution (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | removal of red blood cells during splenocyte isolation |
| Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit | R&D Systems | MIF 00 | estimation of cytokine concentration in the sample |
| LNCaP prostate cancer cells | ATCC | CRL-1740 | study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro |
| DNA-based cell proliferation assay kit | ThermoFisher | C7026 | cell number measurement based on DNA content |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | component of lysis reagent |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | ThermoFisher | FERR1021 | calcium chelator, component of lysis reagent |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | RNA degradation for measurement of DNA |
| Filter-based multi-mode microplate reader | BMG Technology | NA | Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.) |
| HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections |
| Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthesia for in vivo injections |
| Oxygen, compressed gas | Praxair | NA | For use with isoflurane |
| Thermo Forma BSL-2 cabinet | Thermo Fisher | Model 1385 | Sterile cell culture |
| Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | Delivery of shperoids into peritoneal cavity |
| Sterile micropipette tips | Eppendorf | varies | liquid/cells handling |
References
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