Summary
Epigenetische Faktoren können mit genetischen Programme zu modulieren Genexpression und regulieren die Funktion der B-Zellen interagieren. Durch die Kombination von in-vitro- B-Zell-Stimulation, qRT-PCR, und Hochdurchsatz-RNA-Sequenz und mRNA-Sequenz Ansätze, analysieren wir die epigenetische Modulation von MiRNA und gen-Expression in B-Zellen.
Abstract
Antikörperreaktionen werden durch mehrere wichtige B-Zell-inneren Prozesse, einschließlich somatische Hypermutation (SHM), Class-Schalter DNA Rekombination (CSR) und Plasma-Zell-Differenzierung durchgeführt. In den letzten Jahren epigenetische Modifikationen oder Faktoren wie Histon Deacetylation und Mikro-RNAs (MiRNAs), nachweislich mit B-Zelle genetische Programme zur Form Antikörperantworten interagieren, während die Dysfunktion des epigenetischen Faktoren gefunden wurde, um zu führen Autoantikörper Antworten. Genomweite MiRNA und mRNA Expression in B-Zellen als Reaktion auf epigenetischen Modulatoren Analyse ist wichtig für das Verständnis der epigenetischen Regulation der B-Zell-Funktion und Antikörper-Reaktion. Hier zeigen wir ein Protokoll für die Induktion B-Zellen zu CSR und Plasmazelle Differenzierung zu unterziehen, behandeln diese B-Zellen mit Histon-Deacetylase (HDAC)-Inhibitoren (HDIs) und Analyse von mRNA und MicroRNA Ausdruck. In diesem Protokoll analysieren wir direkt komplementäre DNA (cDNA) Sequenzen mit mRNA Sequenzierung der nächsten Generation (mRNA-Seq) und MiRNA-Seq Technologien, Zuordnung der Sequenzierung liest, das Genom und quantitative reverse Transkription (qRT)-PCR. Mit diesen Ansätzen haben wir festgelegt, dass in B-Zellen induziert CSR und Plasma-Zell-Differenzierung zu unterziehen, HDI, einen epigenetischen Regulator selektiv MiRNA und mRNA Ausdruck moduliert und CSR und Plasmazelle Differenzierung verändert.
Introduction
Epigenetischen Markierungen oder Faktoren, z. B. DNA-Methylierung und Histon posttranslationale Modifikationen nicht-kodierende RNAs (unter anderem Micro-RNAs) modulieren Zellfunktion durch Veränderung der gen-Expression-1. Epigenetische Modifikationen regulieren die Funktion von B-Lymphozyten, z. B. Immunglobulin Class-Schalter DNA Rekombination (CSR) und somatische Hypermutation (SHM) Differenzierung zu B-Gedächtniszellen oder Plasmazellen, damit Modulation der Antikörper und Autoantikörper Antworten2,3. CSR und SHM erfordern kritisch Aktivierung-induzierte Cytidin Deaminase (AID, kodiert als Aicda), die hoch in B-Zellen als Reaktion auf T-abhängigen und T-unabhängige Antigene4induziert wird. Klasse-geschaltet/Hypermutated B-Zellen weiter differenzieren zu Plasmazellen, die große Mengen von Antikörpern in einer Art und Weise kritisch abhängig von B-Lymphozyten-induzierte Reifung Protein sezernieren 1 (Blimp1, als Prdm1codiert)5. Abnorme epigenetische Veränderungen in den B-Zellen führen aberranten Antikörper/Autoantikörper Antworten, was zu allergischen Reaktion oder Autoimmunität1,4führen kann. Verstehen, wie epigenetische Faktoren, wie z. B. MiRNAs, B-Zell-inneren modulieren Genexpression ist nicht nur wichtig für die Entwicklung von Impfstoffen, sondern ist auch wichtig, die Mechanismen der möglichen abnormalen Antikörper/Autoantikörper Antworten offenbaren.
Histon Acetylierung und Deacetylation sind Modifikationen der Lysin-Reste auf Histonproteine, die in der Regel durch Histon-Acetyltransferase (Hut) und Histon-Deacetylase (HDAC) katalysiert. Diese Änderungen führen zu zunehmender oder abnehmender Zugänglichkeit des Chromatins und weiter zulassen oder verhindern die Bindung von Transkriptionsfaktoren oder Proteinen, DNA und die Veränderung des Gens Ausdruck5,6, 7 , 8. HDAC-Inhibitoren (HDI) sind eine Klasse von Verbindungen, die die Funktion der HDACs stören. Hier haben wir HDI (VPA) die Verordnung von HDAC auf die intrinsische Genexpressionsprofil von B-Zellen und ihr Mechanismus.
MiRNAs sind kleine, nicht-kodierende RNAs ca. 18 bis 22 Nukleotide in der Länge, die in mehreren Phasen generiert werden. MiRNA Host Gene transkribiert werden und bilden Haarnadel primäre Micro-RNAs (Pri-MiRNAs). Sie werden in den Zytoplasma exportiert wo Pri-MiRNAs in Vorläufer MiRNAs (Pre-MiRNAs) weiterverarbeitet werden. Schließlich sind Reifen MiRNAs durch die Spaltung von Pre-MiRNAs gebildet. MiRNAs erkennen die komplementäre Sequenzen innerhalb der 3' untranslatierten Region ihre Ziel mRNAs6,7. Durch posttranskriptionelle zum Schweigen zu bringen, regulieren MiRNAs zelluläre Aktivität, wie z. B. Proliferation, Differenzierung und Apoptose10,11. Da mehrere MiRNAs die gleichen mRNA gezielt können und einem einzigen MiRNA kann potenziell mehrere mRNAs Ziel, ist es wichtig, eine im Kontext der MiRNA-Expressionsprofil zu verstehen, den Wert des einzelnen und die gemeinsame Wirkung von MiRNAs blicken. MiRNAs haben gezeigt, dass B-Zellentwicklung und peripheren Differenzierung als auch B-Zell-Stadium-spezifische Differenzierung, Antikörper-Reaktion und Autoimmunität1,4,9beteiligt werden. In der 3' UTR Aicda und Prdm1gibt es mehrere validierte oder vorhergesagten evolutionär konservierte Websites, die von MiRNAs8ausgerichtet werden können.
Epigenetische Modulation, einschließlich Histon Post-Transkription Modifikation und MiRNAs, eine Zelltyp und Zelle Stadium-spezifische Verordnung Muster gen Ausdruck9anzeigen Hier beschreiben wir Methoden um die HDI-vermittelten Modulation der MiRNA und mRNA Ausdruck, CSR und Plasma-Zell-Differenzierung zu definieren. Dazu gehören Protokolle zur Induktion B-Zellen zu CSR und Plasma-Zell-Differenzierung zu unterziehen; für die Behandlung von B-Zellen mit HDI; und für die Analyse von MiRNA und mRNA Expression von qRT-PCR, MiRNA-Seq und mRNA-Seq10,11,12,8,13.
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Protocol
das Protokoll erfolgt nach den Richtlinien der Tierpflege die institutionelle Tier Pflege und Nutzung Ausschüsse der University of Texas Health Science Center in San Antonio.
1. Stimulation des Maus-B-Zellen für CSR, Plasma-Zell-Differenzierung und HDI Behandlung
- Vorbereitung der Milz Zellsuspensionen
Hinweis: führen Sie alle Schritte in einer Laminar-Flow-Kapuze mit Ausnahme von Maus Sterbehilfe und Dissektion.- Einschläfern der spezifischen Pathogen-freies C57BL/6J Maus (8-12 Wochen alt) durch CO 2 Inhalation.
- Legen Sie die Maus auf sezierenden Board mit dem Bauch nach oben. Heften Sie alle vier Füße der Maus mit 18-Gauge, 1,5 - In Injektionsnadeln.
- Die Haut mit 70 % Ethanol getränkten Tüchern zu sterilisieren.
- Verwenden Sie eine Reihe von autoklaviert chirurgische Instrumente (Zangen und sezierenden Schere) Schnitt durch die Haut knapp unterhalb des Brustkorbs, die Milz (auf der linken Seite des Bauches, direkt unterhalb der Leber) zu visualisieren.
- Verwenden Sie einen anderen sterilen Zange und Schere um die Milz zu extrahieren liegt unterhalb der größere Krümmung des Magens, durch Spannen der Milz vorsichtig mit der Pinzette und das Abschneiden des Bindegewebes mit sezieren Schere. Achten Sie darauf, das verbindende Gewebe zu entfernen.
- Legen die Milz zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 1.000 µL des kompletten RPMI1640 Medium (RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen Kälberserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 µg/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin, 0,25 µg/mL Amphotericin B und 50 µM β-Mercaptoethanol).
- Legen Sie ein 70 µm Zelle Sieb in einen 50-mL-Polypropylen konische Zentrifugenröhrchen und die Milz vom Microcentrifuge Schlauch auf die Zelle Sieb gießen. Mit der Spitze des eine 15 mL Polypropylen konische Zentrifugenröhrchen sanft die Milz durch das Sieb pürieren. Spülen Sie die Zelle-Sieb mit 15 bis 20 mL des kompletten Medium.
- Spin-down der Zellen bei 350 X g für 5 min und entsorgen des Überstands.
- Entfernen Sie die roten Blutkörperchen aus der Milz Zellsuspensionen. Aufschwemmen der Zelle Pellet in ACK Lyse Puffer (5 mL pro Milz). Inkubieren 4 min bei Raumtemperatur mit gelegentlichen schütteln und dann mit 25 mL des kompletten Medium ablöschen.
- Spin hinunter die Zellen bei 350 X g für 5 min und den Überstand verwerfen. Die Zelle Pellet in 1 oder 10 mL komplette Medium aufzuwirbeln. Zählen die lebensfähigen Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer.
- B-Zell-Isolierung
Hinweis: isolieren, B-Zellen durch negative Selektion nach Hersteller ' Anweisungen. Non-B-Zellen sind für die Entfernung mit Biotinylierte Antikörper gegen nicht-B-Zellen (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6 C/G (Gr-1) und TER119) und Streptavidin beschichteten Magnetpartikel ausgerichtet.- Vorbereiten eine 0,25 bis 2 mL Zellsuspension von 1 x 10 8 Zellen/mL in kompletten Medium in eine sterile 5 mL (12 x 75 mm) Polystyrol Rundboden Röhrchen. Hinzufügen von normalen Ratte Serum (50 µL/mL) zum Beispiel.
- Fügen Sie 50 µL/mL Isolierung cocktail zur Probe. Mischen Sie die Zellen, indem Sie sanft Pipettieren oben und unten 2 - 3 Mal und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min.
- Fügen Sie 75 µL/mL Streptavidin beschichteten Magnetpartikel auf die Probe. Mischen Sie die Mischung durch sanft auf und ab pipettieren 2-3mal und 2,5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie komplette RPMI 1640 Medium. Mischen Sie die Zellen durch sanft nach oben und unten 2 - 3 Mal pipettieren.
- Legen Sie den Schlauch (ohne Deckel) in den Magneten und Inkubation bei Raumtemperatur für 2,5 min. Gießen aus der Überstand mit unberührten B-Zellen in eine neue 15 mL konische Röhre.
- Zählen der lebensfähigen Zellen unter Verwendung eines Hemocytometer und Trypan blau Fleck. Beurteilen Sie die Reinheit der B-Zellen durch Flow-Zytometrie-Analyse der B-Zell-Oberflächenmarker wie B220 und CD19.
- B-Zell-Stimulation und HDI Behandlung
- Aufschwemmen der gereinigten B-Zellen bei kompletten RPMI 1640 Medium auf eine Endkonzentration von 0,3 x 10 6 Zellen/mL.
- Verwenden eine 48-Well Zellplatte Kultur für die Zellkultur. Fügen Sie für jedes gut 1 mL der gereinigten B-Zellsuspension (0,3 x 10 6 Zellen/mL), LPS (3 µg/mL Endkonzentration) von Escherichia coli, IL-4 (Endkonzentration 5 ng/mL) und 0 oder 500 µM HDI (Valproinsäure; VPA).
- Brüten die Zellen bei 37 ° C und 5 % CO 2 für 60 h für qRT-PCR und Hochdurchsatz-mRNA und MiRNA-Sequenzierung Analyse oder 96 h für Flow-Zytometrie Analyse.
- Flow Cytometry Analyse von CSR und Plasma-Zell-Differenzierung
- nach 96 h der Kultur, die Zellen von jedem Bohrloch durch Pipettieren der Zellen nach oben und unten mehrmals abnehmen. Übertragen Sie die Zellsuspension in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Spin-down der Zellen bei 350 X g für 5 min mit einem Benchtop-Zentrifuge und entsorgen des Überstands.
- Aufschwemmen der Zellen mit 100 µL HBSS Puffer mit 1 % BSA und 0,5 ng/mL Fluorescein (FITC) - konjugierten Ziege anti-– Maus IgM Antikörper (Ab) , 0,2 ng/mL Allophycocyanin (APC)-Ratte konjugierten Anti-Maus IgG1 monoklonalen Ab (mAb), 0,2 ng/mL Phycoerythrin (PE)-konjugierten Anti-Maus B220 mAb Ratte, 0,2 ng/mL Ratte PE-Cy7-konjugierten Anti-Maus CD138 mAb und 2 ng/mL 7-Aminoactinomycin D (7-AAD).
- Inkubation der Zellen mit Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern (Schritt 1.4.2) im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min.
- Waschen der Zellen mit 1 mL HBSS mit 1 % BSA.
- Spin-down der Zellen bei 1.500 x g für 5 min mit einem Benchtop-Zentrifuge und verwerfen des Überstands.
- Zellen in 300 µL HBSS mit 1 % BSA Aufschwemmen und die Zellsuspension auf ein Rundboden Polystyrol Rohr übertragen. Decken Sie das Rohr mit Folie, um Lichteinfall zu vermeiden.
- Perform Zytometrie Analyse auf eine einzelne Zelle-Suspension. Sammeln Sie 50.000 Veranstaltungen für jede Entschädigung Probe und 250.000 Ereignisse für die anderen Proben. Analysieren Sie die Daten mithilfe von Gerätesoftware.
- Eliminieren den Schutt und Dubletten mit einem Puls-Geometrie-Tor (FSC-H x FSC-A und SSC-H x SSC-A). Entsprechend Tor den Plot auf 7-AAD, abgestorbenen Zellen auszuschließen.
2. Hochdurchsatz-mRNA-Seq
- nach 60 h Kultur, extrahieren Sie die gesamte-RNS aus 2-4 × 10 6 Zellen mit einem total RNA-Isolierung-Kit, die kleine RNA nach Hersteller wiederherstellen können ' Anweisungen. Umfassen eine DNase ich Behandlungsschritt.
- Überprüfung der RNA-Integrität mit einem Bioanalyzer, nach der Hersteller ' Anweisungen s.
- Verwenden Sie 500-1.000 ng von qualitativ hochwertigen Gesamt-RNS (RNA Integrität Anzahl RIN > 8.0) für RNA-Seq sample Bibliothek Vorbereitung mit einem kommerziellen RNA pRep Kit nach dem Hersteller ' Anweisungen s.
- Die einzelnen mRNA-Seq-Bibliotheken basierend auf ihren jeweiligen 6-bp-Index Teile der Adapter zu bündeln und die Bibliotheken an 50 bp/Sequenz Sequenz. Verwenden Sie eine Hochdurchsatz-DNA-System nach Angaben des Herstellers ' s Protokolle.
- Nach dem Lauf Sequenzierung demultiplex mit CASAVA, die Fastq-Datei für jede Probe zu generieren. Liest, die Kartierung und Bioinformatik analysieren, als zuvor skizzierten 11.
- Richten Sie alle Sequenzierung Lesevorgänge mit ihrem Referenz-Genom (UCSC Maus Genom Build mm9) mit TopHat2 Standard Einstellungen 14. Prozess der Bam-Dateien von Achse mit HTSeq-Count die Anzahl pro gen in allen Proben zu erhalten.
3. Hochdurchsatz-MiRNA-Seq
- Verwendung 100 ng-1 µg von qualitativ hochwertigen Gesamt-RNS, wie vorbereitet in Schritt 2.1 Vorbereitung kleiner RNA-Seq Bibliothek mithilfe ein kommerziellen kleine RNA-Seq Kit.
- Ligate die degenerierten 3 '-Adapter auf die 5 ′ Enden beginnen kleine RNA-Moleküle mit einem kommerziellen Ligatur-Kit. Verbinden der degenerierten 5 '-Adapter auf die 3 ′ Enden beginnen kleine RNA-Moleküle mit einem kommerziellen Ligatur-Kit. Konvertieren Sie die RNA in cDNA durch reverse Transkription und verstärken die kleine RNA-Seq-Bibliothek durch PCR-Amplifikation mit kommerziellen Kits.
- Verwenden eine 6 % TBE native Seite Gel, um die letzte kleine RNA-Seq-Bibliothek zu isolieren. Führen Sie das Gel mit 1 X TBE-Puffer bei 200 V bis Bromophenol blauen Farbstoff tracking Band nähert sich die Unterseite des Gels (0,5 - 1 cm).
- Entfernen Sie das Gel aus der Glasplatten und Flecken mit Interkalation Bromid (0,5 µg/mL in Wasser) in einem sauberen Behälter für ca. 2-3 min. visualisieren das Gel auf einem UV-Transilluminator oder ein anderes Gel Dokumentation Instrument Bands.
- Schneiden die ~ 150-bp-Band mit einer sauberen Rasierklinge heraus und legen Sie sie in eine 1,7 mL-Tube.
- Der DNA mit einem Gel Extraction Kit pro Herstellers extrahieren.
- Überprüfen die Größenverteilung der endgültigen Bibliothek mit einem kommerziellen hochempfindlichen DNA-Assay und der Konzentration mit einem kommerziellen DsDNA-Assay pro Hersteller ' Anweisungen.
- Bündeln die Bibliotheken für Verstärkung und eine anschließende Sequenzierung mit einem kommerziellen Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung System pro Hersteller laufen ' s Protokolle.
- Demultiplex mit CASAVA, die Fastq-Datei für jede Probe pro Hersteller erzeugen ' s Protokolle.
- Für kleine RNA-Seq-Analyse jeder einzelnen Probe, verwenden Sie Flimmern für kleine RNA-Ausrichtung pro Hersteller ' s-Protokolle.
- Liest, die rRNA, Grundierungen, um Verunreinigungen, wie Mitochondrien, ausgerichtet sind und so weiter zu entfernen.
- Richten Sie die Daten, um die Reife MiRNA Sequenzen.
- Richten Sie die Daten, die Haarspange Schleife Sequenzen (Precursor MiRNA).
- Ausrichten der Daten zu anderen kleinen RNA-Sequenzen (unter Verwendung der fRNA-Datenbank) 15.
- Nachdem alle Samples quantifiziert werden, definieren die differenzielle ausgedrückt MiRNAs zwischen verschiedenen Gruppen/Proben. Vorhersagen, MiRNAs, die gezielt ausgewählten mRNAs oder mRNAs, die durch eine selektive MiRNA mit Online-MiRNA Ziel Vorhersage-Tools, wie z. B. Zielscan 16, Mikrokosmos 17 und PicTar ausgerichtet werden können 18 .
- Wenn Annotation oder Weg Funktionsanalyse erforderlich ist, übermitteln die vorhergesagten Genen Einfallsreichtum Pathway Analyse (IPA) oder DAVID.
4. Quantitative RT-PCR (qRT-PCR) mRNAs und MiRNAs
- qRT-PCR-Analyse der mRNA
- RNA extrahieren von 0,2 bis 5 × 10 6 Zellen mit einem kommerziellen total RNA Isolierung-Kit, die kleine RNA, nach wiederherstellen können die Hersteller ' Anweisungen. Umfassen eine DNase ich Behandlungsschritt.
- Synthetisieren cDNA von Gesamt-RNS mit einem ersten Strang cDNA Synthese-System mit Oligo-dT Grundierung.
- CDNA mittels qRT-PCR mit geeigneten Primern, mit 2 x Echtzeit-PCR-master-Mix mit das folgende Protokoll zu quantifizieren: 95 ° C für 15 s, 40 Zyklen von 94 ° C für 10 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s.
- Datenerfassung bei 72 ° C Erweiterung Schritt und durchzuführen schmelzende Kurvenanalyse von 72 bis 95 ° c
- qRT-PCR-Analyse von MiRNA
- aliquoten RNA aus Proben, die in Schritt 4.1.1 vorbereitet.
- Reverse Transkription der RNA in cDNA. Verwenden Sie eine kommerzielle MicroRNA reversen Transkription Kit, nach der Hersteller ' Anweisungen s.
- Real-Time PCR für MicroRNA 250 nM Reife MiRNA forward Primer in Verbindung mit einer universal-rückwärts-Primer eine SYBR Green Real-Time PCR master-Mix mit durchführen.
- Tauwetter 2 x PCR Master Mix, MiRNA-spezifische vorwärts Grundierung und universelle Reverse Primer bei Raumtemperatur. Mischen die Einzellösungen.
- Bereiten eine Reaktion Mischung wie folgt für eine 25 µL pro gut Reaktionsvolumen (verwendet in 96-Well-PCR-Platten):
2 x PCR Master Mix 12,5 µL
MiRNA forward Primer (2,5 μM) 2,5 µL
Universal reverse Primer (2,5 μM) 2,5 µL
RN ASE-freie water5 µL - Hinzufügen 22,5 μL Reaktion-Mix, eine 96-Well-PCR-Platte. Hinzufügen der einzelnen Platte Brunnen 2,5 µL Vorlage cDNA (50 Pg-3 ng).
- Verschließen den Platte-Film. Die Platte für 1 min bei 1000 x g und Raumtemperatur zentrifugieren.
- Die Platte in der Echtzeit-Cycler und starten Sie das folgende Programm Radsport: 95 ° C für 5 min, 40 Zyklen von 94 ° C für 15 s, 55 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s.
- Verwenden Sie die ΔΔCt-Methode für qRT-PCR-Daten-Analyse mit einer Tabellenkalkulation. Normalisieren den Ausdruck der entsprechenden MiRNAs, die Ausdruck der kleinen nuklearen/Nukleolus RNAs Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61 Snord68/SNORD68 und Snord70/SNORD70.
- Statistische Analyse
- führen Sie statistische Analyse, um festzustellen, die p-Werte von gepaart und ungepaarten Student ' s t - test mit einer Tabellenkalkulation und p Werte < 0,05 wie bedeutende.
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Representative Results
Mit unserem Protokoll B-Zellen mit LPS platziert gereinigt (3 µg/mL) und IL-4 (5 ng/mL) für 96 h 30-40 % der CSR zu IgG1 und ~ 10 % der Plasma-Zell-Differenzierung induzieren können. Nach der Behandlung mit HDI (500µM VPA), die CSR zu IgG1 auf 10-20 % gesunken, während Plasma-Zell-Differenzierung auf ~ 2 % zurückgegangen (Abbildung 1). HDI-vermittelte Hemmung der CSR wurde weiter bestätigt durch eine verminderte Anzahl von Post-Rekombination Iμ-Cγ1 und Reifen VHDJH-Cγ1-Transkripte, die abgeschlossene CSR zeichnen. QRT-PCR gemessen, die Expression von Aicda, die ist entscheidend für CSR/SHM und Prdm1 und Xbp1, die für Plasma-Zell-Differenzierung wichtig sind, erwiesen sich durch VPA (Abbildung 2) gehemmt werden.
Die Modulation der mRNA Expression von HDI in B-Zellen war sehr selektiv. Gemessen an mRNA-Seq in B-Zellen stimuliert mit LPS und IL-4, nur 0,3 % der diese stark exprimierten mRNAs wurden hochreguliert durch HDI mehr als zwei-Fach und nur 0,36 % der hoch zum Ausdruck (> 20 Kopien/Zelle in B-Zellen HDI unbehandelt) mRNAs, einschließlich Aicda, Prdm1, und Xbp1, verringerten sich von HDI mehr als 50 % (Abbildung 3).
Die Herunterregulierung der Aicda, Prdm1und Xbp1 Ausdruck könnte möglicherweise vermittelt durch MiRNAs, die negativen Regulatoren der Genexpression. Mithilfe von MiRNA targeting Vorhersage-Tools (TargetScan.org, miRNA.org und miRbase.org) haben wir mehrere MiRNAs, die potenziell Aicda oder Prdm1Zielen können. Die MiRNA-Seq-Analyse des MiRNA profiling in B-Zellen mit HDI behandelt oder Null ergab, dass HDIs selektiv Upregulate Aicda - und Prdm1 -targeting MiRNAs (Abbildungen 4-6).
Abbildung 1. Oberflächenexpression von B-Zell-Marker B220, Oberfläche Antikörper IgG1 und Plasma-Zelle Marker CD138 analysiert wurden durch Durchflusszytometrie.
B220+ IgG1+ Zellen wurden B-Zellen zu IgG1 gewechselt. B220niedrigCD138+ Zellen wurden Plasmazellen. Der Anteil der IgG1-Schalter B-Zellen und Plasmazellen von B-Zellen stimuliert mit LPS und IL-4 im Beisein von Null oder HDI (VPA, 500 M) für 96 h werden angezeigt, wie die Zahlen innerhalb der Tore. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Ausdruck der Kennzeichen von abgeschlossenen CSR; Reifen VHDJH-Cγ1 Transkripte und Post-Rekombination-Iμ-Cγ1-Protokolle; und Aicda, Prdm1und Xbp1 waren von qRT-PCR analysiert, normiert auf Cd79b Abschriften und in einem Histogramm dargestellt.
Genexpression in B-Zellen stimuliert mit LPS und IL-4 in Anwesenheit von 500 µM VPA und relevant für die Genexpression in B Zellen mit der gleichen Reize im Beisein von Null als 1 dargestellt wurden. Die Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten. p -Werte, gepaarten t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. B-Zellen wurden angeregt mit LPS und IL-4 und behandelt mit HDI (VPA, 500 µM) oder Null für 60 h. mRNA Expression wurde analysiert, von mRNA-seq.
(A) mRNA Ausdruck Durchschnittskonzentrationen in drei unabhängigen Experimenten (gelesen pro Kilobase pro million zugeordneten liest, RPKMs) wurden in Punktdiagrammen dargestellt. Jede Parzelle entspricht einem einzelnen mRNA Ausdruck Ebene. Die beiden gestrichelten Linien sind zwei Faltlinien. Grundstücke befindet sich oberhalb der oberen gestrichelten Linie streuen oder unter dem unteren gestrichelte Linie angeben mRNAs, die mehr als doppelt so ausdrücken oder weniger als die Hälfte bzw. VPA und Nil, verursacht. (B) die Balkendiagramme zeigen die durchschnittliche Veränderung der mRNA Expression Ebenen (durchschnittliche RPKMs von drei unabhängigen Experimenten) in LPS und IL-4-stimulierten B-Zellen im Vergleich zu denen in B-Zellen mit HDI, behandelt behandelt mit Null. Nur die mRNAs bei einer durchschnittlichen RPKM > 20 LPS und IL-4-stimulierten B Zellen mit Null behandelt sind im Preis inbegriffen. Die mRNA Ausdruck in jedem einzelnen Experiment, dargestellt durch ein Streudiagramm (C) oder Balkendiagramm (D), sind in der gleichen Weise wie in (A) und (B) dargestellt. p -Werte, gepaarten t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. B-Zellen wurden angeregt mit LPS und IL-4 und behandelt mit HDI (VPA, 500 µM) oder Null für 60 h. MiRNA Ausdruck wurde analysiert, von MiRNA-seq.
(A) die Veränderung der durchschnittlichen MiRNA Ausdruck Konzentration in B-Zellen mit HDI im Vergleich zu behandelt, die in B-Zellen mit Null behandelt wurden durch Balkendiagramme dargestellt. (B) die Änderung der MiRNA Ausdruck Niveaus in B-Zellen mit HDI im Vergleich zu behandelt, die in B-Zellen mit Null in drei unabhängigen Experimenten behandelt wurden durch Balkendiagramme dargestellt. Nur die MiRNAs bei durchschnittlichen u/min > 0,5 LPS und IL-4-stimulierten B Zellen mit Null behandelt sind im Preis inbegriffen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. HDI steigert die Expression von Aicda -targeting MiRNAs, dargestellt durch MiRNA-seq.
(A) Sequenzalignment die MiRNAs und ihre Ziel-Sites in der 3' UTR von Aicda mRNAs. (B) B-Zellen wurden mit LPS und IL-4 das Vorhandensein oder Fehlen von HDI (VPA, 500 M) für 60 h kultiviert. Die Expression von MiRNAs, die zum Ziel Aicda 3' UTR vorhergesagt wurden waren von MiRNA-Seq analysiert und als u/min dargestellt. p -Werte, gepaarten t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6. HDI steigert die Expression von Prdm1 -targeting MiRNAs, dargestellt durch MiRNA-seq.
(A) Sequenzalignment die MiRNAs und ihre Ziel-Sites in der 3' UTR von Prdm1 mRNAs. (B) B-Zellen wurden mit LPS und IL-4 in das Vorhandensein oder Fehlen von HDI (VPA, 500 M) für 60 h Ausdruck von MiRNAs, die vorausgesagt wurden, um Prdm1 3' UTR Ziel von MiRNA-Seq analysiert und dargestellt als u/min wurden kultiviert. p -Werte, gepaarten t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll bietet umfassende Ansätze zur B-Zelle Klasse wechseln und Plasma-Zell-Differenzierung zu induzieren; Ihre Auswirkungen durch epigenetische Modulatoren, nämlich HDI zu analysieren; und die Wirkung von HDI auf mRNA und MiRNA Ausdruck in diesen Zellen zu erkennen. Die meisten dieser Ansätze können auch verwendet werden, um die Auswirkungen der epigenetischen Faktor auf menschlichen B-Zell-Funktion und mRNA/MiRNA Ausdruck zu analysieren. Die qRT-PCR und mRNA-Seq/MiRNA-Seq Ansätze können auch verwendet werden, B-Zellen von Mäusen mit epigenetischen Modulatoren, wie HDIs behandelt isoliert zu analysieren.
Die epigenetische modulieren kann Auswirkungen haben, viele verschiedene Zellfunktionen, wie Zellproliferation und Lebensfähigkeit, die CSR und Plasmazelle Differenzierung beeinflussen könnten. Daher sollten Zellproliferation, Lebensfähigkeit und die Zelle Zyklen der B-Zellen, mit oder ohne HDI Behandlung analysiert werden. Eine der Herausforderungen für die Modulation der mRNA und MiRNA Ausdruck von HDI oder andere epigenetischen Regulatoren von qRT-PCR Analyse ist die Wahl eines geeigneten Zimmermädchen Gens oder kleine RNA. Viele gemeinsame Housekeeping-Gene können in unterschiedlichem Maße durch epigenetische Modulatoren verändert werden. Der Ausdruck Niveaus vieler verschiedenen Housekeeping-Gene sollte gemessen und die spezifische Genexpression zu normalisieren von qRT-PCR verwendet. Dieses Problem kann auch durch mRNA-Seq und MiRNA-FF, wo der Ausdruck der einzelnen mRNAs oder MiRNAs durch eine genomweite mRNA oder MiRNA normalisiert werden kann behoben werden.
mRNA-Seq kann nicht nur die mRNA Ausdruck Profil mit einer entsprechenden Bioinformatik-Pipeline definieren, aber dieser Ansatz kann auch das lange nichtcodierender RNA (LncRNA)-Profil definieren. mRNA-Seq umfasst in der Regel die Anreicherung von Poly + RNAs durch oligo(dT) Auswahl. Wie eine Reihe von LncRNA sind bekanntermaßen poly(A) Schwänzen fehlt, kann nicht die mRNA-Seq-Ansatz unter Einbeziehung Oligo (dT) Auswahl die vollständige Information des LncRNA Ausdrucks bestimmen. Um vollständige Abdeckung der mRNA und LncRNA Expressionsprofile zu erreichen, sollte ein RNA-Seq-Ansatz unter Einbeziehung rRNA Erschöpfung verwendet werden. In den meisten unserer Experimente verwenden wir eine kommerzielle Kit um die Gesamt-RNS, einschließlich MiRNA, MiRNA-Seq, mRNA-Seq und qRT-PCR zu extrahieren. Vor dem Bau einer Bibliothek Hochdurchsatz-Sequenzierung, wird die Gesamtqualität der RNA durch Ausführen einer Aliquoten auf ein automatisiertes RNA, DNA und Protein Probe QC System validiert. Es wird empfohlen, dass RNA-Proben eine RIN Nummer von 7.0 oder höher haben, wenn sie für kleine RNA-Bibliothek-Vorbereitung verwendet werden sollen. Proben mit niedriger RIN zahlen haben eine höhere Prozent geschädigter RNA-Produkte im Größenbereich von kleinen RNA-Spezies (15-30 Nukleotide). Wenn die RIN-Nummer unter 7,0 liegt, wird die Abdeckung nicht so gut sein. Eine weitere Option für weniger-als-idealen RNA-Proben rRNA Erschöpfung Ansatz anstatt eines mRNA-Isolierung-Ansatzes führen soll, aber dies erfordert, dass die Proben mindestens 10 ng/mL.
Die Protokolle für die mRNA-Seq verwendet hier sind optimiert für 100-1.000 ng von Gesamt-RNS. Für MiRNA-Seq mit weniger als 100 ng von Gesamt-RNS, kleinen RNA-Seq Bibliothek Vorbereitung sollte ein empfindlicheres kleine RNA-Seq Vorbereitung Protokoll, das die natürliche Struktur, die häufig zu den meisten bekannten MicroRNA-Moleküle nutzt folgen. Reifste MiRNAs haben eine 5'-Phosphat und eine 3'-Hydroxyl-Gruppe aufgrund ihrer Biogenese Weg. Aus diesem Grund sind die 3' und 5' Adapter in diesem Kit direkt zu MiRNAs ligiert.
Um die Auswirkungen von HDI auf B-Zelle mRNA und MiRNA Ausdruck in Vivozu analysieren, können Mäuse mit VPA oder anderen HDIs behandelt werden indem diese HDI an das Trinkwasser und die intraperitoneale Injektion dieser Mäuse mit T-abhängigen Antigen NP-CGG oder T-unabhängige Antigen NP-LPS kann durchgeführt werden. Die B-Zellen können aus der Milz 10 Tage nach der Immunisierung gereinigt werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit von NIH-Stipendien AI 105813 und AI 079705 (auf PC) unterstützt wurde, gewähren die Allianz für Lupus Forschung Zielkennzeichnung in Lupus Grant ALR 295955 (auf PC) und der National Research Foundation Arthritis-Forschung (HZ). TS wurde unterstützt von Kinderheilkunde Medical Center, zweite Xiangya Krankenhaus, Central South University Changsha, China, im Rahmen des Programms Xiangya-UT Schule von Medizin San Antonio Medizinstudent besuchen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
- Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
- White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
- Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
- Martin, J. A., Wang, Z.
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
- Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
- Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).
