Summary
这项研究涉及到的方法来揭示继抗生素皮肤和肠道微生物群落组成的改变模型鱼主机上的影响。
Introduction
它已经确定，抗生素可以破坏人类微生物导致生态失调，这意味着微生物群落的不平衡。抗生素治疗后的微生物群的组成的改变已经显示降低社会的多样性，减少主要成员，并改变社区代谢，特别是在肠道1,2。肠道微生物的抗生素干扰可以减少定植抗力艰难梭菌 3,4和沙门氏菌 5。
此外，该微生物群的破坏已与许多综合征和人类疾病的发展（ 例如，抗生素相关性小肠结肠炎，炎性肠病，代谢紊乱， 等等 ）。抗生素也被广泛的农业实现为在生长促进畜禽生产6。这些功能强大的工具的使用也不是没有附带影响，这是抗生素耐药性的迅速崛起，以及一个破坏微生物的作用明显有它的有人居住的主机。许多研究表明，广谱抗生素的使用具有长期持久的后果的微生物群的结构和功能，然而，从抗生素被破坏的微生物影响宿主生理副作用仅具有尚待支持推测。
主机，微生物和抗生素之间的相互作用是远远以简洁的方式理解。因此，一个简单而更容易处理模式有利于高度复杂的哺乳动物系统上脱落光。在人体黏膜表面，包括肠道，怀有最高的密度和微生物的多样性，也是最亲密的微生物 - 宿主相互作用。鱼提供S上的粘膜皮肤微生物everal优势作为模型系统。的真骨鱼类 （硬骨鱼）是最早谱系的脊椎动物的含义，硬骨鱼既有先天和后天已经共同发展与共生的细菌群落7的关系的免疫系统内的分歧之一。鱼皮股哺乳动物1型粘膜表面，如生理功能，免疫组件和黏液产生细胞8的排列许多特性。鱼皮粘膜表面的外部位置提供了一个微生物易于操纵实验和样品。
西方蚊， 食蚊（G. 慈），是已经在过去已经用于研究交配和毒理学9，10，11的模型的鱼。由于体积小，种群数量在野外为入侵物种，男 inimal保健费用，和顽强的本性，我们已经开发G.慈竹作为粘膜微生物模式。此外， 食蚊鱼分享生下活年轻，胎生哺乳动物，这是鱼的种类罕见的生理。我们完成了鱼皮正常菌群的时间用16S最广泛的研究， 食蚊鱼 12剖析。进一步的工作表明以下使用广谱抗生素13的皮肤和肠道菌群破坏宿主三个负面影响。
在鱼以下抗生素暴露检查五个不同的效果。该微生物的最完善的主机的好处是病原体竞争排斥。鱼类病原爱德华氏菌是已知会导致肠道败血症的爆发商业鲶鱼养殖场14。 E.氏菌也被证明致死感染斑马鱼类=“外部参照”> 15，16和17 食蚊鱼 。从水柱这种病菌的一个挑战可以作为排斥的措施。作为比较，以易感性的个体的病原体，暴露于混合生物的高密度时存活率也进行了。粪便和富含有机物的土壤被用作微生物群落的普遍遇到的来源。
细菌肠社区执行另一建立角色是养分处理和能量收获，从而影响该主机的整体营养摄取。作为营养的严重测量，鱼体重的被喂食标准饮食前一个月和后进行比较。抗生素治疗鱼的平均体重下降，而平均控制鱼的体重增加超过一个月。这种缺乏体重增加的机制尚不清楚。一个可能的因素是在肠的食物的运送时间。地理标志莫蒂lity方法从斑马鱼（Adam Rich在，纽约州立大学布鲁克波特，个人通信）适用于确定运输时间。它没有如抗生素治疗鱼类具有改变的过境时间尚未确定。
所有的生物体，特别是鱼类，在自然的环境中遇到的一个共同挑战是渗透胁迫。 食蚊鱼已被证明，当在高浓度的盐分18敏锐地强调快速适应。出人意料的是，鱼表现出抗生素的微生物改变生存下降到一个高盐胁迫。对于这种新颖的表型的机制正在调查中。对水生动物，尤其是在水族箱另一种常见的应力，是氮的毒性形式（氨，硝酸盐，亚硝酸盐和）。针对硝酸盐生存不是抗生素治疗和控制鱼之间显著不同。在这个手稿提出的方法可与食蚊或类似鱼模式生物，如斑马使用鱼和青鳉，测量下列实验操作中的鱼的表型。
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Protocol
所有动物实验根据的IACUC协议批准进行的，编号为14-05-05-1018-3-01，13-04-29-1018-3-01和14-04-17-1018-3-01。
1.动物采集，处理和伦理关怀
- 使用一个小抄网并放入19升桶野外现场（在http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm识别指南）收集食蚊鱼 。用目测来确定物种。
- 在池塘水的桶2天 - 休息鱼1。此后，转成鱼76或189在25℃，充满了一半池塘水/半自来水水量L水族箱，通入起泡多孔石。处理鱼时，以最低限度地打扰他们的皮肤菌群使用小抄网。
注：鱼密度应不超过20尾/ 38升水族箱的水高。鱼驯化水族馆进行实验前至少5天。 - 饲料在日常养生与5毫克每鱼糜食用鱼。何LD鱼12h光照/ 12小时黑暗循环。
2.初始抗生素暴露在所有实验
- 从同一水族馆每个实验绘制所有鱼类，放置到两个单独的组（处理：暴露于抗生素和控制：未曝光）在19升桶。以前的数据采集显示，鱼在水族箱一样均匀有皮肤微生物组是在群落组成变化不大。 12
- 在实验过程中，保持鱼在2L人工池塘水（APW 0.33克/升的CaCl 2，0.33克/升MgSO 4上，0.19克/升碳酸氢钠 ）是，通过高压灭菌，使用前灭菌。
- 加入50毫克/毫升到二甲基亚砜（DMSO）准备利福平抗生素原液。利福平是代表性的广谱抗生素，是无毒的鱼。在人类和小鼠中，其在组织中分布良好。
- 从利福平股票管理的最终在用于处理的鱼组的抗生素暴露3天2升APW 25微克/毫升的浓度。请注意，3 d后，皮肤可培养细菌数返回类似于预处理鱼皮。
- 平行地，保持一组中APW未处理的鱼和给予的DMSO等当量（每APW L的0.5毫升）到水柱作为对照组。
- 作为实验的目的是测量鱼的表型的抗生素改变的微生物的作用，以避免直接从抗生素本身的影响，用2L以下三天抗生素曝光（或控制）期间，转印鱼成桶新鲜的APW。
- 所以抗生素是由鱼的身体除去使用10小时的休息期。基地在那里的鱼暴露于25微克/毫升抗生素三天这种淘汰时间的实验。通过剪断脊髓后跟脑脊髓刺毁安乐死鱼，然后用组织研磨机匀化整个身体。
- 由后0.2微米的过滤放置50微升此悬浮液到琼脂培养皿的中心确定抗生素的存在。按上下颠倒的无菌200μL枪头，到琼脂中，从而消除一个小插件让这个悬挂了一个洞。
- 使用琼脂平板用20mL测定营养琼脂的体积，并用棉签与指示生物， 枯草芽孢杆菌 ，这是利福平敏感扩散均匀。获得25°CO / N培养营养琼脂枯草芽孢杆菌 ，并使用棉签取得殖民地。在25℃过夜温育后观察抑制区表示在鱼组织抗生素的存在。
3.微生物组提取
- 通过将鱼放入装有2毫升无菌PBST（137毫米钠无菌的15毫升锥形管提取外表皮粘膜皮肤微生物样本氯，10mM磷酸盐，0.1％吐温-20，pH 7.4）中的溶液并涡旋以10℃1分钟以10秒的暂停增量设置。洗涤剂和盐在缓冲促进即使在溶液的细菌分散液。比较的结果发现用0.85％的生理盐水但下调细菌计数用纯净水。
- 从锥形管转移鱼回收桶。皮肤提取的杀伤力通常低于10％。或者，分析在管中的细菌悬浮液在萃取立即或以15,000 xg离心和存储由一个2分钟的自旋在离心机中在室温下沉淀细菌在-80℃以供将来分析。
注：所有的文化和生化分析是立竿见影的; DNA或蛋白质提取可以从冷冻的样品。 - 为了获得肠道微生物样品，首先将鱼在无菌培养皿。通过直接切断脊髓型颈椎病的脑袋手术剪背后安乐死鱼，其次是穿髓，然后外部消毒体用70％乙醇擦拭。
- 解剖后，由食道后肛门前，切割移除整个肠道。
- 切肠小段1 - 长度为2毫米，将所有的部分分成两个毫升PBST解决方案在锥形管。涡旋1分钟后，除去上清液到另一干净的试管（采取谨慎不制作肠道部分）。
注：上清液包含可通过对皮肤样品提及以前的方法用于直接分析或沉淀萃取肠道细菌。
4.感染模型的制备和巴斯特定病原
- 获得爱德华氏菌 （E.氏菌 ）的感染株，并保持在-80℃的文化。应变93 - 146本研究使用，从被感染的鲶鱼孤立的，从马克·劳伦斯，兽医学院，密西西比州立大学获得的。
- STREAK E.氏菌股票上称为E.氏菌介质（EIM）的选择性和差异介质琼脂19的细菌培养，并在27℃孵育2天。
- 从文化传递一个纯粹的孤立菌落接种含有40毫升的营养肉汤的150毫升瓶（NB; 5g / L的蛋白胨，4g / l的牛肉膏）。在在27℃下设置在150rpm，保持2天振荡器地方烧瓶中。
- 孵育后，在650nm处稀释在PBST中的培养物的样品，以0.2的OD分光计读数来校准大肠杆菌氏菌培养为期望的感染剂量卷。
- 接下来两个转移处理（后抗生素暴露3 d）和未经处理的鱼类群体纳入为130毫升新鲜的人工池塘的水，或APW为鱼类组织药物清除约10小时个人塑料杯。
- 然后，从两组，再每条鱼转移到为130毫升的清洁APW的8盎司塑料杯。 给每个鱼片含2.8×10 6 / ml的大肠氏菌文化进入APW（浴感染模型）致死剂量，并保持在27℃培养箱中24小时。
- 大肠氏菌洗完澡后，单独传送鱼放入新杯130毫升的APW。
- 以下水置换，记录鱼的死亡率在一个星期的时间。鱼不是美联储在此期间。在对比鲶鱼， 食蚊显示感染的任何外部的迹象，因此使用杀伤力作为实验端点它是必不可少的。
5.多种微生物挑战粪便和土壤
- 粪污处理
- 从谁没有在此前两周使用无菌手套和无菌50 mL锥形管接到抗生素，健康志愿者主题获得新鲜人类粪便。
- 一旦收集，收集排泄物在无菌塑料袋中，然后转移到无菌15毫升Çonical管。 800毫克/毫升 - 在PBST暂停粪便给500原液创建一个股票浓度。此厚混合物是最好使用1毫升或更大的塑料移液管尖端，已被切割的底部用无菌剪刀使得开口较大转移。
- 处理和控制未处理鱼基的初始抗生素曝光后，分离成含有粪便悬浮液在任一15毫克/毫升或10毫克/毫升到APW的终浓度以130毫升的总体积个别塑料杯。在25℃的恒温箱中保持杯子。
- 在2天的粪便通过接触密切观察期间的记录鱼类死亡。
- 土壤处理
- 收集1 - 2千克富含有机质的表土（应包含微生物的密度最高和多样性）约7 - 深度下跌15厘米，放入干净的塑料容器中。需要注意的是土应在以下收集两天内使用。
- 巨熊初步接触期后ctly，抗生素分开处理和未处理的鱼两组到含有18.2克土130毫升APW的个别塑料杯。加入鱼之前，混合用手水井的土壤。大部分的颗粒不挂起，并停留在杯底。
- 暴露鱼在25℃下3天的持续时间，并记录任何死亡率。
6.渗透胁迫挑战
- 处理，接着进行一个10小时的休息时间，如上所述后，个性化鱼放入含NaCl单独杯在150毫升APW 17.5毫克/毫升（300毫摩尔）。这是海水的典型盐度，这是不充分致死（<50％），以控制鱼的一半，但强烈的压力，因此需要有效的渗透调节。
- 请遵守鱼类死亡超过36小时的持续时间。
7.硝酸盐毒性挑战
- 休息鱼抗生素博览会后10小时内URE，然后分离鱼入含有的硝酸钠浓度个别杯为10毫克/毫升（118毫摩尔）或17.5毫克/毫升（206毫摩尔）在130毫升APW的。
- 记录死亡率超过4天的低剂量组和1个D高剂量。
8.个性化或分组鱼的生长分析
- 完整的3天抗生素曝光或控制期间在水桶组。
- 对于个人 ，填补8盎司泡沫塑料杯每150毫升APW，传送单个鱼放入杯中，并记录总体重初步评估。
- 重复这两个处理和未处理组中的所有鱼。使用白色泡沫塑料杯，而不是透明的塑料杯，因为鱼不会在清澈的杯子时吃。
- 每天每鱼2球团矿的标准饮食喂养的鱼。颗粒使用，而不是因为片状颗粒有个别质量低方差（3.53±0.42毫克每一个，或8％的变化），resultin克鱼接受食物量相似。通过监控录像直观吃剩的颗粒消耗。消耗率通常为80％以上。
- 在每星期的超过4周结束时，确定鱼体重。准备一个新的杯具新鲜APW，放在一个平衡，然后记录重量。然后，从原来的杯子倒入鱼放进一个抄网，并转移到新的杯子，然后再次称重。鱼不处理，避免精神紧张。
- 团体 ，放置2升APW到一个19升桶和去皮规模。转移到新的APW桶时，然后记录总重量组两组养鱼在一起。每星期超过通过转移到一个新的水桶一个月的时间跨度记录鱼的重量组。
9.肠道传输时间
- 使用荧光素标记的70 kDa的阴离子葡聚糖。葡聚糖不显著消化，过大跨肠道层被吸收，从而通道将测量通过肠运送时间。标记的葡聚糖被并入鱼食。
- 到无菌1.7毫升管中，60℃的加热块上添加的无菌去离子水360微升和52毫克明胶（13％溶液），并放置该管，直到明胶熔化，并完全溶解。
- 碾金鱼食品薄片成细粉使用研钵和杵，和40mg该粉末添加到管中，用鱼油的20μL的沿。混合后，添加1.6毫克的FITC葡聚糖。
- 分装热的液体混合物倒入20微升滴在封口膜的实验台上，让他们迅速冷却和固化。滴，可存储长达4天，他们变得太硬鱼吃了。通过将封口膜到陪替氏培养皿中，然后浮在无菌水密封的塑料容器，保持加湿的液滴内部的一半在冰箱商店下降。
- 只是馈送之前，季落入使用刀片部分。适应鱼的泰锘个别2天泡沫杯不吃草（注：只使用了未曝光控制鱼）。放置食物的四个季度与鱼杯中，观察鱼30分钟，他们每吃的食物有多少件。
- 要开始监测期，用80毫升APW的用抄网单独传送鱼入杯子。每2小时，用手轻轻摇动APW，然后在4℃取1毫升样品，并存储在一个标有1.7毫升管。取样品36小时。
- 记录荧光，与测定完成之后的荧光分光光度计，在同一时间的所有样品。将整个1毫升样品放入试管，并记录使用在495nm处激发和发射在520nm处测得的荧光。
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Representative Results
用于研究从抗生素曝光13宿主鱼效果实验系统的整体示意图如图1A所示，并且包括该技术，用于提取从鱼的皮肤（ 图1B）和肠（ 图1C）微生物组。因为先前的数据显示，而总的皮肤可培养数在治疗早期下降，它返回之后3天到治疗前水平三天被选为曝光的抗生素的时期。同时，群落组成，由16S分析确定，已经强烈地改变。因此，在3天的时间应该是最佳的，从一个改变社区大致相同密度的分析的影响。需要注意的是文化分析，采用琼脂平板上菌落数，可能留下了一些品种。皮肤微生物分散方法的效率（ 图1B 5 CFU / g的鱼体重），以从进行同样的悬浮液过程几个鱼菌落数的第二时间（量化任何剩余-荣>）被在平板上从悬浮缓冲液（典型地在10 4范围比较菌落数分析菌）。从本次停牌数均低于100 CFU /克，暗示悬挂方法是有效的（未发表）。
鱼用抗生素改变的微生物似乎是对大肠杆菌氏菌感染比对照鱼（ 图2）更敏感。在平均时间为处理的鱼56.1±15小时和98.5为控制鱼±48小时死亡的差异无统计学显著（双尾学生t检验，p = 0.12）。这可能是由于小组的大小（后的n = 6，控制N = 5）。因此，建议至少有十几组大小。这种感染模型的一个优点是将bATH协议，它不需要用于感染或食物摄入的跟踪针。 E.氏菌自然水柱侵入鲶鱼。安全性较高，因为大肠杆菌氏菌是温度敏感，因而感染人类很差。其它研究已经表明，在G慈的死亡时间与细菌的初始剂量相关。的27℃的培养温度被选定为最优的细菌和鱼。
治疗或控制鱼没有生存的复合污染的微生物的高支水显著差异。没有观察到死亡超过4天的对照组（n = 8）或组（n = 9）当土壤用作微生物来源的鱼。虽然一些死亡率做了与人类粪便如微生物（ 表1）的源发生，抗生素治疗并没有区别。当粪便中APW的浓度为20毫克/毫升，40 - 50％的鱼死了。然而，溶解的氧浓度为10％（相对于在桶或缸中> 80％），因此，低氧条件混淆解释。当16或10毫克较低水平/被用来毫升，存活率相匹配（双面Fisher精确检验，p = 0.95或更高的群体之间的差异）。在这两个试验中的溶解氧水平在65％以上。 食蚊鱼是一个非常顽强的入侵物种，可以生活在低质量的水。这将是有趣的，利用自然微生物暴露的这些分析来衡量其他物种生存对抗污染的水是一个挑战。待确定的特定环境位点，特别是那些经受富营养化，可以在一个类似的测定中使用的水样，虽然水质（溶解的 O 2，硝酸盐，盐度等 ）需要，作为一种潜在的混杂因素。
鄂鱼xposed利福平分别比对照鱼（ 图3）渗透胁迫更敏感。当盐度升高挑战数秩检验观察成活率显著差异（p = 0.049）（对照组和治疗组88％，死亡43％死亡，N = 9两组）。从该测定结果与18.1毫克/毫升的确定同意作为LC 50为氯化钠与G慈在淡水20 24小时。盐胁迫的迹象表明，鱼展品包括周围发红鳃，降低游泳运动。用这个方法，盐分浓度高于18毫克/毫升导致快速死亡的鱼。
当暴露在水柱毒素硝酸盐，预曝光到抗生素没有影响存活率（ 表2）。对于每一个试验中，死亡被记录了在既有短期和长期的时间点，较急，多为慢性的影响。浓度为10毫克/基于它是在淡水为G. affinis的所述LD 50在48小时21被选择毫升。从该测定结果与这个LD 50值一致，90小时后50％的致死率在两个治疗组和对照组。硝酸盐的更高的挑战（17.5毫克/毫升）还检查，导致更多的快速死亡。再有是不是在治疗组差异。亚硝酸盐，远远高于硝酸G.慈毒性更大，与48小时22的0.0015毫克/毫升LD 50。使用分析信息索引系统（未发表）社区的生化分析显示，鱼皮菌群具有降低硝酸盐的潜力。然而，这两个试验期间在APW亚硝酸盐水平保持在检测限以下（0.001毫克/毫升）。这个挑战方法可与任何小的化学物质可溶解使用。
当杯子和美联储牛逼个性化他相同数量的每个鱼了一个月，观察到的抗生素治疗的鱼不会发胖以及控制鱼，没有统计上显著差异的趋势（数据未显示）。为了避免个性化的压力，鱼被安置在一起，在水桶一个月一组用于处理和未处理的鱼，并给予相匹配的食物的。这种设置的限制是，鱼可能不被接受的个体的基础上同样的食物。然而，在模型组，平均体重（ 表3）治疗的平均体重减轻和控制鱼的鱼。似乎食物鱼被消耗的量并没有事先抗生素曝光的影响，因此抑制食欲是缺乏体重增加一个不太可能的候选解释。许多其他的因素可能有助于包括在肠道炎症的变化，粘液产生的水平，肠的渗透性，和/或肠运动。此法的主要优点来衡量nutritiOnal地区的影响是简单。它价格低廉，并且只需要一个实验室天平仪器仪表。它适用于筛选的效果，导致其他参与实验来确定的机制。
检查涉及到的鱼增重的一个例子因素是食品运输时间，这是胃肠动力有关。 FITC-标记的葡聚糖可以并入糊化食品是不致命的鱼。在周围的水随着时间的推移测定荧光给出FITC-葡聚糖是如何快速穿过肠的测量。荧光高于背景可具有16小时后转进给（ 图4）之后达到最大值尽快至2小时检测。这个结果与从水族馆控制鱼。从抗生素治疗鱼类可靠的结果尚未获得。此过程的一种限制是，对于鱼类吃的食物的2-D饥饿期间是必需的。副词该协议的antage灵敏度高（低背景荧光），鱼只吃一种食物部分可以给的结果，尽管时都吃过两部分数据较为一致。这个协议比小鼠23类似的和致命的方法不太复杂。
图1：普通的实验方案的示意图概述。 A是流程图，示出，从左到右，鱼从水族箱转移，分离成抗生素治疗（由红水表示）或对照（蓝色）基团，然后放入单独的杯来跟踪表型。 B和C描绘提取鱼的皮肤和肠道微生物组的过程。混匀后，细菌悬浮成微生物群落的分析解决方案。55170 / 55170fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2：病原菌药敏。暴露于大肠杆菌氏菌对鱼期间存活曲线与利福平（红线）或未经处理的对照组（黑线）的鱼进行预处理。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：敏感性渗透胁迫。暴露于高盐度鱼在这两个抗生素治疗和未治疗组中存活曲线。 PLEASE点击此处查看该图的放大版本。
图4：粮食运输时间。荧光随着时间的推移，从二鱼水喂FITC葡聚糖。鱼类吃了明胶的食品节和鱼乙吃了一口。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1：敏感性高的微生物环境。暴露于人体排泄物在3种不同浓度进行了评估。 x的死亡比例为：y表示鱼死的在指定的时间点相比，鱼的实验组y中的总数x的总数。
表2：硝酸盐毒性挑战。记录鱼死亡的时间在治疗组和对照组在整个暴露于毒性硝酸盐浓度。 x的死亡比例为：y表示鱼死的在指定的时间点相比，鱼的实验组y中的总数x的总数。
表3：生长分析。在总体重以下抗生素或对照处理变化后一个月。在初始平均体重的百分比差异（对于试验组的鱼）相比最终平均体重是列Δweight。 N是鱼的该组中的号。在试验结束时每鱼的平均重量为体重/鱼。
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Discussion
一些挑战需要抗生素治疗的药物在鱼组织被耗尽后，清洁APW休息时间。如果暂停时间段被跳过然后抗生素存在可混淆的结果，特别是当测定涉及暴露于细菌。为了研究而无需在主机上，初步实验监控微生物组成（16S分析或全基因组测序）和人口密度（通过定量PCR 16S定量）对微生物的总数大的变化抗生素暴露期间从改变肠道微生物组成的影响将是需要。而3天在本系统中是最优的，改变宿主和/或抗生素，需要重新校准。
典型的生物医学研究，小鼠模型通常用于微生物研究。最常见的鱼模型是斑马鱼。为了更好地理解为MicroB粘膜的结构和功能的普遍特性iomes与宿主相互作用，新的和非典型模型是必要的。我们的WT鱼模型用作通过包括其他车型已经失去自然宿主遗传变异研究宿主相互作用的微生物正宗源由于实验室提出动物的近亲繁殖24几代。 食蚊鱼的主要实验的优势是他们的耐寒的性质，容忍一个广泛的条件。高存活率在于，在温度变化的水被观察到（4 - 38℃），盐度（0 - 17毫克/毫升），溶解氧（110 - 25％），和pH（4 - 8）。这不仅允许检查许多环境条件，同时也为这往往是其他鱼类太紧张多步骤的实验程序。
这里介绍的程序适用于快速筛选来发现从特定治疗宿主的影响。后续的研究需要确定直接的因果关系和机制。例如扩展Studi住宅为鱼微生物宿主效应ES包括：测量肠道炎症，通过量化脂肪储存鱼的健康检查，并在皮肤上，并在肠道粘液电平的测量。一悉生系统正在开发中的特定微生物特定的主机表型的细节链接来研究。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rifampicin | Calbiochem | 557303-1GM | |
| Sodium Nitrate | Sigma Aldrich | S5506 | |
| Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran | ThermoFisher Scientific | D1823 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets | Calbiochem | 6500-OP | tablets dissolve in water to make PBS |
References
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