Abstract
Le placenta est le premier organe à développer au cours de l'embryogenèse et est nécessaire pour la survie de l'embryon en développement. Le placenta est composé de différentes cellules trophoblastiques qui se différencient à partir des cellules du trophectoderme extra-embryonnaire du blastocyste préimplantatoire. En tant que tel, notre compréhension des événements de différenciation précoce du placenta humain est limitée en raison des restrictions éthiques et juridiques sur l'isolement et la manipulation de l'embryogenèse humaine. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) sont un système modèle robuste pour enquêter sur le développement humain et peuvent également être différenciées in vitro en cellules trophoblastiques qui expriment des marqueurs des différents types de cellules trophoblastiques. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour différencier hPSCs dans les cellules trophoblastiques en utilisant la protéine morphogénétique osseuse 4 et inhibiteurs des activine / voies de signalisation Nodal. Ce protocole génère divers types de cellules trophoblastiques qui peuvent être transfectées avec des ARNsipour enquêter sur les phénotypes de perte de fonction ou peuvent être infectés par des agents pathogènes. En outre, hPSCs peuvent être génétiquement modifiés puis différenciées en progéniteurs trophoblaste pour les analyses de gain de fonction. Cette méthode in vitro de différenciation pour générer trophoblastes humains à partir de hPSCs surmonte les restrictions éthiques et juridiques de travailler avec des embryons humains précoces, et ce système peut être utilisé pour une variété d'applications, y compris la découverte de médicaments et les cellules souches.
Introduction
Le placenta est nécessaire pour la croissance et la survie du fœtus pendant la grossesse et facilite l'échange de gaz, des nutriments, des déchets et des hormones entre la circulation maternelle et fœtale. Le premier organe formé au cours de l' embryogenèse chez les mammifères est le placenta, qui commence à développer 6-7 jours après la conception chez l' homme et chez la souris 3,5-4,5 jours 1, 2, 3, 4. les cellules sont des cellules trophoblastiques les plus importantes du placenta, et ces cellules représentent l'un des événements les plus précoces de la différenciation de la lignée de l'embryon de mammifère. Elles proviennent des cellules du trophectoderme extra-embryonnaires externes du blastocyste préimplantatoire. Notre connaissance des premiers stades du développement placentaire est limitée par les restrictions éthiques et logistiques sur la modélisation du développement humain précoce.
Au cours de l'implantation embryonnaire, trophoblastesenvahir l'épithélium maternelle et se différencier en cellules progénitrices spécialisés 5. Cytotrophoblastes (CTBS) sont mononucléées, progéniteurs indifférenciés qui fusionnent et se différencient en syncytiotrophoblastes (SYN) et trophoblastes invasives extravilleux (de EVTS), qui ancre le placenta à l'utérus. SYNs sont multinucléées, les cellules différenciées qui synthétisent les hormones nécessaires au maintien de la grossesse. Les événements de différenciation précoce qui génèrent EVTS et SYNs sont essentiels pour la formation du placenta, comme les déficiences dans les cellules trophoblastiques aboutissent à une fausse couche, la pré-éclampsie, et la restriction de croissance intra - utérine 1. Les types de lignées cellulaires trophoblastiques humaines qui ont été développées comprennent immortalisés CTBS et choriocarcinome, qui produisent des hormones placentaires et présentent des propriétés invasives 6. cellules trophoblastiques primaires de placentas premier trimestre humains peuvent être isolés, mais les cellules rapidement differentiate et arrêter la prolifération in vitro. Surtout, transformé et des lignées de cellules primaires ont des profils d'expression de gènes différents, ce qui indique que les lignées cellulaires tumorigènes et immortalisés trophoblaste peuvent ne pas représenter exactement les trophoblastes principaux 7. En outre, ces lignes ne sont pas susceptibles de ressembler à trophoblaste placentaire progéniteurs des cellules souches parce qu'ils sont dérivés de stade plus avancé d'abord par le troisième trimestre.
Il y a un besoin pour un robuste système de culture in vitro de stade précoce trophoblastes humains afin d'étudier les événements précoces de la formation et de la fonction placentaire. cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), qui partagent les propriétés avec la masse cellulaire interne de l'embryon préimplantatoire, sont fréquemment utilisés pour modéliser le développement humain précoce, y compris la formation du début du placenta. Les deux cellules d'origine humaine souches pluripotentes (de hiPSCs) et CSEh peuvent être différenciées en trophoblaste in vitro utilisant des os MorLa protéine phogenic 4 (BMP4) , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Cette conversion des cellules pluripotentes à des cellules trophoblastiques utilisant BMP4 est spécifique pour les cellules humaines et est largement utilisé pour étudier le développement du placenta humain tôt , car il ne nécessite pas l' accès à des embryons humains précoces 9, 16. Récemment, on a découvert que l'addition des inhibiteurs A83-01 (A) et PD173074 (P), qui bloquent les voies SMAD2 / 3 et MEK1 / 2 signalisation, augmente l'efficacité de la différenciation des progéniteurs dans HPSC trophectoderme analogue, principalement SYNs et EVTS, sans la génération étendue de mésoderme, endoderme, ectoderme ou des cellules 9, 17 in vitro du modèle 9, 11. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la différenciation des hPSCs in vitro dans les progéniteurs trophoblastiques humaines en utilisant BMP4 / A / P milieu de culture. Ces conditions produisent des nombres de cellules abondantes pour une grande variété d'applications, y compris le séquençage de l'ARN, de disruption de gène en utilisant des ARNsi, des infections pathogènes, et la modification génétique en utilisant la transfection à médiation par lipofection.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTE: Pour la différenciation des CSEh soit ou hiPSCs en progéniteurs trophoblaste, hPSCs cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) sont transition vers feeder libres conditions pour deux passages avant d'initier la différenciation avec BMP4 / A / P. Ce processus élimine la contamination MEF de cellules différenciées. Ici, nous présentons un protocole pour la différenciation des CSEh, et le même protocole peut être appliqué à hiPSCs.
1. Culture et récupération des CSEh sur irradiées fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) (Préparation)
- Gamma-irradiation de MEFs
- Faire 500 ml de milieu pour la culture des FAE: DMEM avec 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine, 1 x pénicilline / streptomycine (Pen / Strep) et 0,1 mM d'acides aminés non essentiels (NEAA).
- Décongelez un flacon de MEFs primaires et utiliser milieu MEF pour la culture des cellules. Développez les MEFs primaires à 30 plaques à l'aide de milieu de culture MEF.
NOTE: Les concentrations d'oxygène ne sont pas critiques pour cette étape, de sortesoit des conditions physiologiques (4%) ou ambiant (20%) au sein de l'incubateur peuvent être utilisés. - Récolter les MEFS. En utilisant 0,25% de trypsine pour éliminer les MEFs des plaques et transférer les cellules dans un tube conique. Placez les MEF en un instrument d'irradiation et d'exposer les cellules à 3500 grays.
NOTE: La quantité de temps dépendra de l'activité de la source à l'intérieur de l'unité de irradiateur. - Resuspendre les MEFs irradiés avec un milieu de culture MEF et compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre.
- Pellet les MEF utilisant une centrifugeuse et ajouter 50% du milieu de culture MEF et 50% cellule milieu de congélation (80% de FBS et 20% de milieu de culture MEF). Aliquote de 1 x 10 6 cellules par flacon.
- Placer les flacons MEF irradiées dans un -80 ° C congélateur pendant une nuit, puis de les transférer à l'azote liquide pour le stockage à long terme.
- Dégel MEFs congelés et CSEh pour la culture
- Faire 500 ml de milieu hESC: DMEM / F-12 avec 20% de sérum Replacement mM, 0,1 NEAA, 2 mM de L-glutamine, de 10 ng / ml de bFGF, 0,1 mM de ß-mercaptoéthanol et 1 x Pen / Strep.
- Décongelez un flacon de MEFs un jour avant décongélation des CSEh. Enduire une plaque à 6 puits avec 0,1% de gélatine, en utilisant 1 ml pour chaque puits. Incuber pendant au moins 20 min à température ambiante, puis retirez la gélatine.
- Retirer un flacon de MEFs de stockage dans l'azote liquide et immerger le flacon dans un bain d'eau C 37 °. Regardez le flacon par intermittence jusqu'à ce que de petits cristaux de glace restent. transférer rapidement le contenu du flacon à 9 ml de milieu FAE dans un tube conique de 15 ml.
- Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans un milieu MEF. Aliquoter la FAE uniformément sur une plaque de 6 puits. Mettre la plaque dans un 37 ° C faible teneur en oxygène (4%) incubateur pendant une nuit.
- La culture de routine de CSEh sur MEFs
- Retirer un flacon de CSEh à partir de l'azote liquide et décongeler rapidement le flacon en utilisant un 37 ° C bain d'eau. pipette doucement les CSEh dans un tube conique de 15 ml contenant 9 ml de milieu CSEh et centrifuger à 200 xg pendant 5 min. Retirez le moyen et remettre les cellules avec 1 ml de milieu CSEh.
- Aspirer le milieu MEF de la plaque préparée à l'étape 1.2.4 et ajouter 1 ml de milieu CSEh. Ajouter inhibiteur Rock Y-27632 (10 uM) au milieu CSEh. Transférer les CSEh sur MEF.
- Placer les cellules dans un 37 ° C faible teneur en oxygène (4%) incubateur pendant une nuit. Remplacez le support CSEh quotidien. Grattez cellules différenciées avec une pipette Pasteur, visualisés sous un microscope droit à 4X.
- Passage des hESC tous les 4-6 jours, en fonction de la confluence cellulaire et la taille des colonies hESC. Préparer une plaque de MEFs la veille repiquage. Lorsque les cellules sont prêtes au passage, éliminer le milieu CSEh et laver le puits avec 1 ml de PBS.
- Ajouter 1 mg / ml de collagénase (préchauffé à 37 ° C), incuber à 37 ° C pendant 5 min, puis retirez le collagénase. Wcendres les cellules avec du PBS, ajouter 1 ml de milieu CSEh par puits, et gratter manuellement les cellules en petits bouquets en utilisant la pointe d'un pipette de 5 ml. Transférer les amas de cellules en suspension dans un puits (s) nouvelle MEF-enduit.
2. Transition de CSEh à partir de MEFs Feeder-Free sur plaques Matrice Extracellulaire enduites
- Préparer MEF milieu conditionné (CM)
- Plate les MEFs irradiées dans un flacon T75 à 90-100% de confluence; il est important que les MEF sont densément plaquées. Observer les cellules en utilisant un microscope pour déterminer si elles ont fixé au fond du flacon (FAE fixent environ 6 heures après le placage ou le jour suivant).
REMARQUE: les cellules seules flottent dans le milieu lorsqu'il est observé à l'aide d'un microscope. Le lendemain, retirez moyen MEF et ajouter 25 ml de milieu CSEh manquant B-FGF. - Recueillir le milieu conditionné après 24 heures d'incubation. Remplacez-le par du milieu frais par jour pendant un maximum de 12 jours. Filtrer le CM collecté en utilisant un filtre de 0,22 pm. Avant d'utiliser, ajouter frais B-FGF au CM.
NOTE: CM peut être congelé à -80 ° C et stocké pendant 1 an. Vous pouvez également stocker le CM à 4 ° C pendant 2 semaines.
- Plate les MEFs irradiées dans un flacon T75 à 90-100% de confluence; il est important que les MEF sont densément plaquées. Observer les cellules en utilisant un microscope pour déterminer si elles ont fixé au fond du flacon (FAE fixent environ 6 heures après le placage ou le jour suivant).
- Transition des CSEh à partir de la culture sur les MEF pour des liaisons de connexion des plaques de matrice extracellulaire revêtu.
- Préparation de la matrice extracellulaire pour des plaques de culture tissulaire de revêtement
- Décongeler une aliquote de la matrice extracellulaire sur la glace (environ 3-4 h). En utilisant des pointes glacées, un 50 ml tube conique à froid, et du milieu DMEM / F12, transfert 2 mg de la matrice extracellulaire dans 24 ml de glace-froid DMEM / F-12 (la dilution dépend de la concentration de la matrice extracellulaire du fournisseur ).
- Transférer immédiatement les 50 ml tube conique à la glace et le stocker à 4 ° C. Pour les plaques de culture de tissu de revêtement, ajouter la quantité appropriée de la matrice extracellulaire diluée au bien (par exemple, 1 ml par puits dans une plaque de 6 puits). Agiter pour recouvrir la plaque et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h.
- CSEh Passage des MEF (comme dans l'étape 1.3) en utilisant CM contenant B-FGF (10 ng / ml).
- Aspirer pour éliminer la matrice extracellulaire de la nouvelle plaque et ajouter CM contenant B-FGF. Transférer les amas cellulaires grattées de la plaque MEF utilisant une pipette et aliquoter dans la plaque de matrice extracellulaire revêtue. Incuber dans le 37 ° C incubateur faible teneur en oxygène pendant la nuit.
- Remplacer le CM avec un milieu de B-FGF quotidienne; la quantité de milieu dépend de la taille du flacon de culture. Utilisez 2 ml de milieu pour une 6 puits bien. Grattez cellules différenciées avec une pipette Pasteur.
- CSEh Passage tous les 6-7 jours, lorsque les colonies sont lumineuses lorsqu'il est vu sous le microscope.
NOTE: colonies CSEh cultivées sur des plaques de matrice extracellulaire revêtues sont plus grandes que les cellules MEF-cultivées. - Lorsque les cellules nourricières libre-sont prêts à passage, éliminer le milieu, laver par l'annonceurding 1 ml de PBS à l'aide d'une pipette, aspirer pour éliminer le PBS, ajouter 0,5 mg / ml de dispase (préchauffée à 37 ° C) avec une pipette et on incube à 37 ° C pendant 5 min.
- Laver les cellules avec du PBS par addition de 2 ml de PBS par puits et en aspirant ensuite. Ajouter 1 ml de CM par puits et gratter manuellement les cellules en petits bouquets en utilisant la pointe d'un pipette de 5 ml.
- Plate les amas de cellules en suspension dans de nouvelles plaques de matrice extracellulaire revêtu; les cellules devraient adhérer après 24 h.
- Préparation de la matrice extracellulaire pour des plaques de culture tissulaire de revêtement
3. Différenciation des CSEh Utilisation BMP4 / A / P
- Préparer le milieu de différenciation. CM utilisation (absence de FGF-B) et ajouter (fraîche) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 uM) et PD173074 (0,1 M). Ajouter ces inhibiteurs au CM avant utilisation.
- Utilisez CSEh sans alimentation en croissance sur des plaques de matrice extracellulaire revêtu pour 1 passage, cultivées à l'intérieur d'un incubateur fixé à 4% d'oxygène. Après le premier passage sur des plaques de matrice extracellulaire revêtu,laisser les cellules se fixent pendant 24 heures. Le lendemain, initier la différenciation. Retirez le CM (contenant B-FGF) et le remplacer par CM contenant BMP4 / A / P (2 ml par puits dans une plaque de 6 puits). Continuer la mise en culture des cellules en utilisant des niveaux d'oxygène 4%.
- Remplacer le CM contenant BMP4 / A / P (2 ml / puits pour une plaque de 6 puits) tous les 2 jours. Aspirer pour enlever l'ancien milieu et ajouter un nouveau CM à l'aide d'une pipette. Le deuxième jour après l'ajout et la suppression BMP4 B-FGF (considéré comme le jour de différenciation 2), la morphologie cellulaire change, apparaissant plus grande lorsqu'elle est observée en utilisant un microscope.
NOTE: les cellules non différencié, qui présentent des bords ronds lumineux, ne seront pas présents. - Recueillir les cellules à points de temps souhaités. Les cellules différenciées vont arrêter de se diviser après environ 2 semaines. cellules transfecter au cours de cette période de temps (voir la section suivante).
4. Transfection de cellules trophoblastiques avec siRNA ou l'ADN plasmidique
- Préparer les cellules trophoblastiques pour la transfection
- CSEh de culture pour deux passages sur la matrice extracellulaire après leur transfert des MEF (voir l'étape 2.2). Utiliser le milieu CSEh contenant B-FGF.
- Divisez les CSEh sur une nouvelle plaque de matrice extracellulaire un jour avant la différenciation. Haute confluence cellulaire est important, donc diviser les cellules 1: 1 sur une nouvelle plaque / puits, qui assurera au moins 50% de confluence le lendemain. Incuber les cellules pendant la nuit dans l'incubateur faible teneur en oxygène.
NOTE: Les CSEh ne doivent pas être pris en compte lors de cette étape. - Le lendemain, remplacer le milieu par le milieu de différenciation (CM contenant BMP4 / A / P et manquant B-FGF, en utilisant 2 ml / puits pour une plaque de 6 puits). Retirer l'ancien milieu par aspiration et transférer le nouveau support (2 ml) à l'aide d'une pipette. Placer les cellules dans un incubateur à faible teneur en oxygène (4% d'oxygène) pendant une nuit.
- Différencier les cellules jusqu'à ce que le Time- désirépoint (entre les jours 1 et 14). Le jour avant la transfection, Trypsiniser les cellules en utilisant 0,05% de trypsine pendant 5 min. Plate-les à la confluence souhaitée (selon le protocole de réactif de transfection) sur une plaque de gélatine, enrobées (ajout de 0,1% de gélatine à une plaque de culture tissulaire pendant 20 min, et aspirer à enlever). Ajouter CM contenant BMP4 / A / P (manquant B-FGF) et incuber pendant la nuit.
- Le jour suivant, ajouter un milieu de différenciation dans les cellules fraîches. Transfecter ARNsi en utilisant un réactif de transfection ARNsi. Pour l'ADN de plasmide, en utilisant un réactif lipofectamine approprié.
- Suivre le protocole du produit comme décrit pour chaque réactif de transfection. Transférez les complexes de siRNA-lipofectamine à chaque puits / plaque de cellules, mélanger doucement, et la culture des cellules pendant la nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène.
NOTE: Certains réactifs de transfection sont inhibées par des antibiotiques, qui exigent CM manque Pen / Strep. - Le lendemain, le remplacer par les médias de différenciation frais.
- Récolter les cellules au désird points de temps (par exemple, 24 h, 48 h et 72 h) pour vérifier l'efficacité de la perturbation des gènes en utilisant RT-PCR quantitative. Pour la récolte de cellules, utilisez 0,05% de trypsine, en ajoutant 1 ml par puits et incubation pendant 5 min à 37 ° C. Ajouter 5 ml de milieu MEF par puits pour neutraliser la trypsine. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min et en utilisant le culot cellulaire pour l'isolement de l'ARN.
5. Pathogen Infection des cellules trophoblastiques: Infection virale Sendai
- Préparer CSEh de différenciation
- CSEh de culture pour deux passages sur la matrice extracellulaire après le transfert des MEF (voir l'étape 2.2). Utiliser le milieu CSEh contenant B-FGF.
- Divisez les CSEh sur une nouvelle plaque de matrice extracellulaire un jour avant la différenciation. Haute confluence cellulaire est des cellules importantes, alors fendues 1: 1 sur une nouvelle plaque / puits, qui assurera au moins 50% de confluence le lendemain. Incuber les cellules pendant une nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène (4% d'oxygène). <br /> NOTE: CSEh ne doivent pas être pris en compte lors de cette étape.
- Le jour suivant, remplacer le milieu par le milieu de différenciation (CM contenant BMP4 / A / P et B dépourvu FGF) et de la culture pendant une nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène (4% d'oxygène).
- Sendai infection virale des cellules trophoblastiques
- Un jour avant le jour de différenciation souhaitée, trypsiniser les cellules différenciées (à cellules individuelles) en utilisant 0,05% de trypsine pendant 5 min et les transférer sur une plaque revêtu de gélatine. Ajouter milieu de différenciation et incuber pendant la nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène.
- Le jour suivant, ajouter du milieu d'infection (cela peut varier en fonction du virus). Utiliser CM manque Pen / Strep contenant BMP4 / A / P, en utilisant 0,5 ml pour un puits d'une plaque à 6 puits. Ajouter le virus Sendai pour MOI = 1. Incuber pendant 8 heures dans un incubateur à faible teneur en oxygène.
- Si le temps des points supplémentaires sont nécessaires, éliminer le milieu contenant le virus après 4 h et le remplacer par BMP4 / A / P CM. Recueillir les cellulespour l'isolement d'ARN en utilisant un grattoir à cellules.
- Déterminer l'efficacité de l' infection virale en effectuant qRT-PCR pour les gènes impliqués dans la réponse virale 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vue d'ensemble de différenciation in vitro de hPSCs
Ce protocole de différenciation in vitro de cellules hES non différenciées commence cultivées sur MEFs qui sont passés à feeder libres conditions pour un passage (figure 1A). Alors que nous avons décrit la différenciation des CSEh dans ce protocole, nous avons utilisé ce protocole pour différencier avec succès hiPSCs dans les cellules trophoblastiques. La transition vers la matrice extracellulaire supprime la majorité des MEFs irradiés, qui sont indésirables pour des analyses qui nécessitent des populations pures de cellules trophoblastiques humaines. hPSCs indifférenciées sont cultivées sur la matrice extracellulaire et mis en culture avec CM contenant du B-FGF jusqu'à ce que les colonies soient prêts pour repiquage (environ une semaine). Cela permet de maintenir l'état pluripotent avant l'induction BMP4 / A / différenciation P-médiée. Les colonies sont perturbées en amas de ~ 50-100 cellulesen utilisant la dispase et passé une deuxième fois sur une plaque de matrice extracellulaire revêtue. Le jour après repiquage, les cellules adhérentes sont prêtes à induire la différenciation, et le milieu est mis à contenir BMP4 / A / P manquant B-FGF. Les cellules différenciées prolifèrent pendant environ 2 semaines, au cours de laquelle les cellules peuvent être recueillies pour l'isolement d'ARN ou utilisés pour des expériences de transfection. Les modifications morphologiques apparaissent 1-2 jours après la différenciation a été lancé, et les résultats d'une expérience représentative sont présentés dans la figure 1B. Notez que les cellules les jours de différenciation 1-2 sont plus grandes que les cellules du jour 0 (figure 1B). La colonie de cellules différenciées croît rapidement, et ce changement est perceptible par jour. Comme produit de différenciation, les cellules se divisent et se développent à partir du centre de la colonie, de plus en plus vers l' extérieur (3-5 jours, figure 1B). La partie externe de la colonie contient des cellules plus grandes par rapport à til cellules au centre de la colonie. Les cellules différenciées deviennent plus foncés et plus plat que les cellules souches pluripotentes en culture sur une matrice extracellulaire; les variations de luminosité de la cellule sont plus apparents lors de la visualisation des cellules avec un microscope vertical utilisé pour la culture cellulaire de routine. Les colonies individuelles se confondent par jour de différenciation 5 (figure 1B), avec des cellules en croissance au - dessus de l'autre. Après le jour de différenciation 4-5, les cellules contenant des noyaux multiples sont présents (non représenté) (figure 1B).
BMP4 / A / P induit la différenciation et de l'expression des marqueurs Trophoblast
Nous avons examiné les changements dans l'expression de gènes au cours des trois premiers jours de différenciation BMP4 / A / P en utilisant RT-PCR quantitative (qRT-PCR). L'ARN a été isolé à jour de différenciation 1, 2 et 3 et converti en ADNc. La disparition des cellules souches pluripotentes peut être évaluée à la fois by morphologie, visuellement à l'aide d'un microscope, et par qRT-PCR, en utilisant des amorces pour les gènes de pluripotence. Les niveaux d'expression relatifs des NANOG, un marqueur des cellules souches pluripotentes, est réduit d'environ 75% après un jour de différenciation , lorsque les cellules sont cultivées avec la BMP4, et les niveaux sont réduits de ~ 90% en présence de BMP4 / A / P ( la figure 2). Par différenciation jour 2, les niveaux de NANOG sont très faibles pour les cellules cultivées dans BMP4 seul ou en BMP4 / A / P par rapport à ceux hESC en milieu CM (contenant du B-FGF). Ceci est un résultat attendu, parce que nous n'observons des cellules indifférenciées après deux jours de différenciation (figure 1B), qui sont plus lumineux et plus petit en taille par rapport à des cellules différenciées. L'efficacité de la différenciation BMP4 à médiation par les cellules trophoblastiques peut être évalué directement par qRT-PCR en utilisant des amorces spécifiques pour les deux marqueurs trophoblastiques: KRT7 et CDX2. Ces deux gènes ne sont pas exprimés en souches pluripotentes humainescellules, et l' augmentation de leur expression après 2-3 jours de traitement BMP4 (figure 2). En utilisant les conditions décrites ici, les niveaux de transcription KRT7 augmentent le jour de différenciation 1 BMP4 / A / moyenne P et restent constantes pendant les 3 premiers jours de différenciation (figure 2). Expression KRT7 lors de l' utilisation BMP4 seul a une augmentation retardée par jour 2, en accord avec les observations précédentes que les inhibiteurs de Nodal activine / augmenter le taux de CSEh 9 de différenciation. Une autre façon d'évaluer l'efficacité de l' utilisation de ces inhibiteurs est de déterminer l'abondance à l' état stable de Cdx2 et KRT7 transcrits dans les cellules traitées avec BMP4 seul. Niveaux de Cdx2 sont similaires pour les jours de différenciation 1-3 lors de l' utilisation soit BMP4 seul ou BMP4 conjointement avec les inhibiteurs de Nodal activine /. Cependant, les transcriptions KRT7 sont plus abondants après un jour de différenciation en présence de ces inhibiteurs, ce qui suggère une plusla différenciation rapide (figure 2). Expression CDX2 pics généralement à la différenciation jour 2 pour les deux conditions et diminue après jour 3 (Figure 2). CSEh indifférenciées n'expriment soit KRT7 ou CDX2 (Figure 2), comme prévu. En conclusion, les conditions BMP4 / A / P différencier rapidement CSEh, et l'expression des marqueurs placentaire peuvent être détectés dès le jour de différenciation 3.
Transfections de siRNA et l' ADN plasmidique et les infections virales à l' aide In Vitro -derived cellules trophoblastiques
In vitro , les cellules trophoblastiques humaines dérivées peuvent être transfectées avec des ARNsi pour perturber l'expression du gène de l' un codage ou des ARN non codants. Nous avons initié la différenciation des cellules hES à l'aide BMP4 / A / P, effectué deux cycles de transfection de siRNA (en utilisant 75 pmol de ARNsi) les jours de différenciation 1 et 2,et recueilli les cellules pour l'isolement de l'ARN. RT-PCR quantitative est une méthode efficace pour déterminer l'efficacité de knock-down pour les deux gènes codant ou non codantes. L' utilisation de deux ARNsi complémentaires à des régions différentes de la longue, non codantes ARN lncRHOXF1 19, nous avons obtenu 80% knockdown de transcriptions lncRHOXF1 (figure 3A). Ensuite, on a transfecté une ARNsi (25 pmoles) pour le gène codant pour la protéine hnRNP U, également à jour de différenciation 1 et 2. On a observé une réduction de 80% des transcripts hnRNP U suivant deux transfections consécutifs. Dans les cellules du trophoblaste progénitrices différenciées in vitro peuvent également être utilisées pour étudier les réponses immunitaires innées. Nous avons effectué des infections du jour de différenciation des cellules 2 en utilisant le virus Sendai à une MOI de 1 et recueilli les cellules après 8 heures d'incubation virale. Utilisation de qRT-PCR, nous avons détecté abondantes transcriptions de protéine virale (Sev-NP) dans les cellules infectées (figure 3B), indiquant pro virale activepagation dans les cellules trophoblastiques. Fait important, les cellules infectées (en utilisant MOI = 1) ne changent pas d'aspect et sont viables (données non présentées). Dans les cellules trophoblastiques in vitro dérivées peuvent également être transfectées avec l' ADN plasmidique. Nous avons effectué des transfections en utilisant un plasmide GFP et introduit cette construction dans / / P cellules traitées A BMP4 le jour de différenciation 1 et le jour 3 et imagé pour GFP le jour suivant (Figure 4). Nous généralement obtenu 30-50% d'efficacité de transfection à 24 h post-transfection. En conclusion, dans les cellules trophoblastiques in vitro dérivés peuvent être utilisés pour les expériences et la perte intensité forte de fonction.
Figure 1: In vitro la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines aux cellules trophoblastiques précoces en utilisant la BMP4 / A / P. (A) Représentation schématique de la différenciation BMP4 de hPSCs aux cellules trophoblastiques utilisant BMP4 / A / P. (B) représentatifs des images lumineuses champ de cellules HUES9 pendant d0, d2 et d6 de différenciation BMP4 / A / P. Barre d'échelle = 50 uM. Les flèches indiquent CSEh unicellulaires qui ne sont pas différenciés. Les flèches mettent en évidence les caractéristiques morphologiques lors de la différenciation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: la différenciation BMP4 / A / P régule négativement rapidement le NANOG de marqueur pluripotent et upregulates gènes trophoblastiques CDX2 et KRT7. analyse qRT-PCR pour NANOG (marqueur de pluripotence), CDX2 et KRT7 (Marqueurs trophoblaste). Les valeurs sont des moyennes de mesures en triple. //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: la perturbation des gènes et l' infection virale en utilisant des cellules trophoblastiques humaines in vitro différenciées. (A) Analyse qRT-PCR de cellules hES (HUES9) différenciés et ensuite transfectées avec des ARNsi spécifiques à la longue, l' ARN non codantes lncRHOXF1 ( à gauche) ou le gène codant pour la protéine hnRNP U ( à droite) pendant deux jours consécutifs. L'efficacité knockdown (KD) est typiquement 70-80%, et les résultats d'une expérience de transfection sont présentés. (B) Analyse qRT-PCR du virus Sendai transcription de la protéine de différenciation des cellules 2 jours trophoblastiques infectées par le virus de Sendai (MOI = 1) pendant 8 heures. Les barres d'erreur représentent la SEM.cible "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg" = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Introduction de l' ADN plasmidique dans des cellules trophoblastiques humaines différenciées in vitro. La transfection de l'ADN de plasmide GFP dans des cellules jour de différenciation 1 et 3 jours trophectoderme progénitrices, visualisé le jour suivant. Barre d'échelle = 50 uM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nous avons présenté les étapes de base pour différencier les CSEh en progéniteurs trophoblaste. Ce protocole a récemment été optimisé pour différencier rapidement hESC avec l'addition d'inhibiteurs de l'activine / signalisation Nodal, en augmentant la différenciation des cellules trophoblastiques et en évitant la production de progéniteurs de mésoderme, qui sont généralement observés avec le traitement de la BMP4 seul. Le système de modèle de BMP4 permet l'examen des premiers stades de la spécification trophoblaste lignée humaine et de l'expansion. En outre, ce système de modèle de la BMP4 est également utile pour étudier la différenciation des cellules du trophoblaste à des sous-lignées spécifiques, ce qui est impossible avec des lignées cellulaires de choriocarcinome et des lignées de cellules du trophoblaste extravilleux. Dans les cellules trophoblastiques in vitro dérivées peuvent également être utilisés pour des expériences de perte de fonction en utilisant des ARNsi 19. En outre, CSEh ou hiPSCs peuvent être génétiquement modifiés pour l'expression inductible de transgen es 19 ou pour l'insertion de gènes rapporteurs à des locus endogènes 20, et ces cellules peuvent être différenciées en cellules trophoblastiques en utilisant les conditions décrites ici.
Étapes critiques dans le Protocole
Il est impératif d'omettre B-FGF (FGF2) à partir du milieu de différenciation de CM pour obtenir des cellules souches trophoblastiques de CSEh. La présence de B-FGF avec BMP4 dans le milieu de culture augmente l'expression du mésoderme et de l' endoderme 16 progéniteurs. L'inclusion de B-FGF en milieu de différenciation du trophoblaste est censé expliquer pourquoi une étude récente a montré que la différenciation des BMP4 médiée génère mésoderme et l' endoderme cellules au lieu de trophoblastes 21. Il est bien établi que le b-FGF conjointement avec l' activine A et favorise la BMP4 endoderme et la différenciation du mésoderme d'une manière dépendante de la dose 22,s = "xref"> 23. Chez la souris, le développement de l'épiblaste, trophectoderme et lignées endoderme primitif dépendent des voies de signalisation de type FGF 24. En différenciant hESC, la signalisation B-FGF induit est nécessaire pour la formation du mésoderme lorsque la BMP4 est utilisée pour induire la différenciation 21, 25. En revanche, l'inhibition à la fois les FGF et / activine voies de signalisation Nodal, conjointement avec la BMP4, favorise la formation SYN dans les progéniteurs trophoblastiques hESC dérivés et empêche la formation de mésoderme et de l' endoderme primitif 26 progéniteurs.
Limites de la technique
Le problème le plus typique avec ce protocole de différenciation HPSC progéniteurs trophoblastiques est associé à partir d'une population majoritairement indifférenciée de CSEh ou hiPSCs sur MEF. Parce que hPSCs accumulent des cellules différenciées à la fois les bords intérieurs et extérieursdes colonies, il est important de contrôler la quantité journalière de différenciation et d'éliminer les colonies différenciées (ou portions de colonies). La présence de cellules différenciées peut compliquer le processus de différenciation, en particulier lorsque les cellules sont transférées à la matrice extracellulaire. Les cellules différenciées vont rapidement proliférer sur la matrice extracellulaire en présence de CM, et ces cellules vont rapidement prendre en charge la culture et hors-compétition les hPSCs. Par conséquent, il est idéal pour commencer en bonne santé, indifférenciés de colonies cultivées sur hPSCs FAE avant de transférer les cellules à la matrice extracellulaire.
Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives
Lors de l'utilisation de ce protocole de différenciation, les cellules mères de trophoblaste résultants sont un mélange hétérogène de types de cellules. Les trophoblastes sont composés de cytotrophoblastes villeux, syncytiotrophoblastes (SYN) et cytotrophoblastes extravilleux(EVTS) 27. cytotrophoblastes villosités sont les progéniteurs qui génèrent EVTS et SYNs. HPSCs de BMP4 différenciés vont générer un mélange de cytotrophoblastes villeux, SYNs et EVTS 9, 15, qui ont été définis par l'expression de gènes ou de protéines de marqueurs spécifiques placentaires. Les voies de différenciation distinctes peuvent être distinguées par la sécrétion de l' antigène HLA-G (caractéristique de EVTS) ou la gonadotrophine chorionique humaine ( à partir SYNs) 28, 29. Récemment, il a été démontré que l'inhibition de l' activine / signalisation Nodal favorise la différenciation de cellules hES EVT et la suppression de cette inhibition favorise la différenciation SYN 17. En effet, une publication antérieure a révélé que l' utilisation de BMP4 seul pour différencier les CSEh génère la plupart des cellules SYN 26. Les données en utilisant BMP4 / A / P et milieu conditionné (dépourvu B-FGF) indiquent qu'il ysont tous deux EVT et les cellules présentes SYN par jour de différenciation 5. Si les populations pures ou EVT SYN sont désirés, une purification supplémentaire en utilisant des marqueurs de surface cellulaire, tels que HLA-G conjugués à des billes pour l'isolement de EVTS, il est possible 29. En conclusion, le procédé de culture décrit ici est un moyen efficace pour générer des quantités importantes de cellules du trophoblaste à partir hPSCs qui peuvent être utilisés pour une variété d'applications. Parce que ce protocole génère à la fois SYNs et EVTS, il est un système modèle approprié pour l'examen du placenta humain précoce. Ces cellules peuvent être utilisées pour une variété d'applications, y compris la découverte de médicaments et du génie génétique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
References
- Rugg-Gunn, P. J.
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
- Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
- Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
- Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
- Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
- Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
- Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
- Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
- Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
- Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be? Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
- Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
- Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
- Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
- Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
- Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
- Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
- Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
- Cole, L. A.
- Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
