La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per generare in modo efficiente cellule trofoblastiche umane da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando la proteina morfogenica ossea 4 e inibitori delle vie Activina/Nodale. Questo metodo è adatto per la differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane e può generare grandi quantità di cellule per la manipolazione genetica.

Abstract

La placenta è il primo organo di sviluppare durante l'embriogenesi ed è necessario per la sopravvivenza dell'embrione in via di sviluppo. La placenta comprende numerose cellule trofoblastiche che differenziano dalle cellule trophectoderm extra-embrionali di blastocisti preimpianto. Come tale, la nostra comprensione dei primi eventi di differenziazione della placenta umana è limitata a causa delle restrizioni etiche e legali su l'isolamento e la manipolazione di Embriologia Umana. Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono un sistema robusto modello per lo studio dello sviluppo umano e possono anche essere differenziate in vitro in cellule trofoblastiche che esprimono i marcatori dei vari tipi di cellule trofoblasto. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per differenziare hPSCs in cellule trofoblastiche utilizzando morphogenic proteina ossea 4 e gli inibitori delle vie di segnalazione / nodali activin. Questo protocollo genera vari tipi di cellule trofoblastiche che possono essere transfettate con siRNAper indagare la perdita di funzione fenotipi o possono essere infettati da agenti patogeni. Inoltre, hPSCs possono essere modificati geneticamente e poi differenziate in progenitori trofoblasto per guadagno-di-funzione analizza. Questo vitro metodo di differenziazione per la generazione di trofoblasto umano a partire dalle hPSCs supera le limitazioni etiche e legali di lavorare con i primi embrioni umani, e questo sistema può essere utilizzato per una varietà di applicazioni, tra cui la scoperta di farmaci e ricerca sulle cellule staminali.

Introduzione

La placenta è necessario per la crescita e la sopravvivenza del feto durante la gravidanza e facilita lo scambio di gas, sostanze nutritive, prodotti di scarto, e gli ormoni tra la circolazione materna e fetale. Il primo organo formato durante l'embriogenesi dei mammiferi è la placenta, che inizia lo sviluppo 6-7 giorni dopo il concepimento nell'uomo e 3,5-4,5 giorni nel topo ^{1, 2, 3, 4.} cellule trofoblastiche sono le cellule più importanti della placenta, e queste cellule rappresentano uno dei primi eventi di differenziazione ligna....

Protocollo

NOTA: Per la differenziazione delle hESC sia o hiPSCs in progenitori trofoblasto, hPSCs coltivati ​​su fibroblasti embrionali di topo (MEF) sono la transizione a alimentatore-Free condizioni per due passaggi prima di iniziare la differenziazione con BMP4 / A / P. Questo processo elimina la contaminazione MEF di cellule differenziate. Qui, vi presentiamo un protocollo per la differenziazione hESC, e lo stesso protocollo può essere applicato a hiPSCs.

1. Cultura e recupero di hESC su irradiati fibroblasti embrionali di topo (MEF) (preparati)

1. Gamma-irradiazione di MEF
   1. Rendere 500 ml di terreno per la coltura i MEF: DMEM con 1....

Risultati

Panoramica di differenziazione in vitro di hPSCs

Questo protocollo di differenziazione in vitro inizia con hESC indifferenziato coltivati in MEF che la transizione al alimentatore-Free condizioni per un passaggio (Figura 1A). Mentre abbiamo descritto la differenziazione di hESC in questo protocollo, abbiamo usato questo protocollo di differenziarsi con successo hiPSCs in cellule trofoblastiche. .......

Discussione

Abbiamo presentato i passaggi fondamentali per differenziare hESC in progenitori trofoblasto. Questo protocollo è stato recentemente ottimizzato per differenziare rapidamente hESCs con l'aggiunta di inibitori Activin / segnalazione nodale, aumentando la differenziazione di cellule trofoblastiche ed evitando la generazione di progenitori mesoderma, tipicamente osservati con il solo trattamento BMP4. Il sistema modello BMP4 consente per l'esame delle prime fasi della specifica trofoblasto stirpe umana e di espansi.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
Sostituzione del siero knock out	Invitrogen	10828-028	In questo protocollo si parla di "sostituzione del siero".
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutammina	Invitrogen	10828-028
Penicillina/Streptomicina	Invitrogen	15140-155
2-Mercaptoetanolo	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispasi	Invitrogen	17105-041
Collagenasi di tipo IV	Invitrogen	17104-019
Inibitore della roccia Y27632	Calbiochem	688000
MEF CF1 irradiato I MEF	GlobalStem	6001G	possono essere generati dal giorno embrionale 13,5 e irradiati.
0,22 µ m filtro per siringhe	Millipore	SLGS033SS
Heracell 150i incubatore a basso contenuto di ossigeno	Heracell/VWR	89187-192	È sufficiente un incubatore per colture tissutali in grado di regolare le concentrazioni di ossigeno.
BMP4	R& D Systems	314-BP-01M
A 83-01	R& D Systems	2939/10
PD173074	R& D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizol viene utilizzato per isolare l'RNA totale.
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning	356231	Questo è indicato come "matrice extracellulare" in questo protocollo.