Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Milieu Screening van Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. en Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish systemen

Published: December 8, 2017 doi: 10.3791/55306
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biological Research Facility, The Francis Crick Institute

Summary

Dit protocol beschrijft het gebruik van sump swabs en slib analyse van zebravis systemen, die tot verhoogde detectie in vergelijking met het exclusieve gebruik van sentinels leidt te detecteren ziekteverwekkers zoals Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. en Pseudocapillaria tomentosa. Een systeem om te controleren van P. tomentosa eieren in quarantaine wordt ook voorgesteld.

Abstract

Gezondheid monitoring systemen worden ontwikkeld en gebruikt in zebrafish onderzoeksfaciliteiten, omdat ziekteverwekkers van Danio rerio zoals Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. en Pseudocapillaria tomentosa het potentieel om te hebben afbreuk doen aan het welzijn van dieren en onderzoek. De vissen zijn meestal geanalyseerde post-mortem te detecteren van microben. Het gebruik van verklikkerdieren is een voorgestelde manier om de gevoeligheid van het toezicht op en te verminderen van het aantal dieren om te proeven. De instelling van een tank pre filtratie sentinel uit een recirculatie systeem wordt beschreven. De techniek is ontwikkeld ter voorkoming van waterverontreiniging en de vis bevolking vertegenwoordigen door een zorgvuldige selectie van leeftijd, geslacht en stammen. Om te gebruiken het minimumaantal dieren, zijn de technieken om het scherm van het milieu ook gedetailleerd. Polymerase Chain Reaction (PCR) op oppervlakte sump swabs wordt gebruikt voor een aanzienlijke verbetering van de opsporing van een aantal bekende en pathogene mycobacteriële soorten zoals Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilumen Mycobacterium chelonae. Een ander milieu methode bestaat uit het verwerken van het slib op de bodem van een holdingstank of Opvangbakken op zoek naar P. tomentosa eieren. Dit is een goedkope en snelle techniek die kan worden toegepast in quarantaine waar een fok-apparaat is ondergedompeld in de holdingstank van geïmporteerde dieren. Ten slotte, PCR wordt toegepast op het slib monster en A. hydrophila wordt aangetroffen op de bodem en de oppervlakte van het Carter. In het algemeen, deze milieu screening technieken toegepast op deze specifieke ziekteverwekkers hebben geleid tot een verhoogde gevoeligheid ten opzichte van het testen van pre filtratie sentinels.

Introduction

Ter bescherming van onderzoek en het welzijn van dieren1,2, is de aanwezigheid van ziekteverwekkers dierlijke voorzieningen bewaakt. In het geval van zebravis, gezondheidsmonitoring3,4,5,6,7,8,9,10,11 is vaak gebaseerd op dieren geanalyseerd postmortaal histopathologisch onderzoek, Bacteriologie cultuur of moleculaire methoden. Testen alleen kolonie dieren is niet de aanbevolen methode vanwege het aantal vissen en verwante lasten die nodig zou zijn om het opsporen van ziekteverwekkers van lage prevalentie. Daarom is de voorkeursmethode bloot van een kleine groep van dieren met een hogere belasting van verontreinigingen. Deze vissen heten pre filtratie sentinels. Deze blootstelling duurt maanden en het gaat om een toename van de werklast van de dierlijke verzorger en/of sommige speciaal gebouwde oplossing voor procestechniek. Een andere uitdaging is de screening van geïmporteerde lijnen in quarantaine waar de vruchtbare dieren zijn leven wordt gehouden, en dit is niet compatibel met routinematige testen op karkassen.

Hier beschrijven we enkele methoden voor het detecteren van bepaalde ziekteverwekkers van de zebravis (A. hydrophila, Mycobacterium spp., en P. tomentosa) door screening van het aquatische systeem omgeving. Het doel is om het aantal vissen gebruikt voor gezondheidsmonitoring en voor het optimaliseren van de omzet, de kosten en de gevoeligheid van de detectie. Dergelijke methoden zijn een alternatief voor het gebruik van dieren en sommige technieken kunnen worden toegepast op de screening invoer in quarantaine. Bijvoorbeeld, Mocho9 was in staat om meer pathogene mycobacteriële soorten identificeren door het uitvoeren van PCR op sump swabs in plaats van op zebrafish (inclusief sentinels), en dit werd verkregen met minder monsters. In die zin dat dezelfde studie, P. tomentosa eieren werden ontdekt met meer gevoeligheid door screening van het slib van de tank met behulp van reserve-drijfvermogen en microscopie in plaats van testen van vis door PCR en histopathologisch onderzoek.

Tabel 1 geeft een overzicht van de verschillende kenmerken van sentinel programma's3,4,5,6,7,8,9,10 door een aantal zebrafish faciliteiten gebruikt. Na filtratie sentinels ontvangen water op dezelfde manier als een kolonie vis, terwijl pre filtratie sentinels water ontvangen zodra het heeft verspreid via kolonie vissentanks eerst. Bijvoorbeeld, kunnen pre filtratie sentinels worden instellen op de recirculatie systeem door continu ontvangen sump water. Dit is niet een optie wanneer er veel onafhankelijke systemen op één kamer zijn. In dit geval kan een tank van pre filtratie sentinels worden gebruikt op het scherm de hele kamer. De sentinels zijn in een statische tank, uit de recirculatie systeem, en hun water regelmatig wordt gewijzigd met behulp van alleen pre filtratie water dat wil zeggen, sump water uit alle systemen op de kamer. Deze techniek wordt beschreven hieronder als een basis voor vergelijking met de werkzaamheid van de milieu-screening. De voorgestelde structuur is ontworpen om de water kwaliteit controlekwesties zoals een daling van de pH of de vervuiling van een stikstof.

Het concept van de bacteriële milieu screening is gebaseerd op de hypothese dat bacteriën opspoorbaar in de biofilm zoals die gevonden op de muur van de Carter van het wateroppervlak of in het slib op de bodem van een tank zijn. Het Carter lijkt een ideale monsterpunt in een recirculatie aquacultuur systeem omdat zij afval (water, ontlasting, diervoeders en andere organisch materiaal verzamelt) van alle tanks pre filtratie. Het oppervlak van het Carter is vaak gemakkelijk bereikbaar, het zwabberen is snel, en het aseptisch Voorkom kruisbesmetting van het monster (van handschoenen bijvoorbeeld) kan worden uitgevoerd. Het concept wordt gebruikt voor het identificeren van overwegend pathogene Mycobacterium spp. in zebrafish systemen9,12. De techniek wordt hieronder beschreven en we zijn ook rapportage detectie van A. hydrophila in zebrafish sump oppervlakte swabs en slib.

De milieu screening voor eieren van de parasiet is gebaseerd op de detectie van Murray et al. 13 en de flotatie-techniek wordt regelmatig gebruikt voor Parasitologie en microscopische screening van eitjes van de parasiet in ontlasting14. Mocho9 voorgesteld alternatief aan het proces van de bemonstering en bleek dat de techniek kan worden gebruikt voor het detecteren van andere soorten van de biotoop van de vis. Geïnfecteerde D. rerio pass P. tomentosa eieren met hun ontlasting en de eitjes van de parasiet blijven op de bodem van de tank, in het slib. Kunnen zij verzamelde er als gevolg van hun dichtheid dat breder is dan water. De dichtheid van de eieren is gebruikt voor het verwerken van het milieu monster ook. Water en licht puin zijn gescheiden van zwaardere kwestie een eerste flotatie met centrifugeren. Een tweede centrifugeren berust op verzadigde suikeroplossing (met een dichtheid groter is dan de dichtheid van P. tomentosa eieren) zodat de eitjes van de parasiet te ontstaan aan het oppervlak van de buis.

De screening voor bacteriën in de biofilm en P. tomentosa vanaf de onderkant van de tank kan worden gecombineerd door het uitvoeren van PCR voor alle deze ziekteverwekkers op het slib monster sediment verkregen na de eerste centrifugeren. Dit optimaliseert het bemonsteringstijdstip. De methode wordt hieronder beschreven. Ook stellen wij voor om het gebruik van deze technieken in de context van een quarantaine. Naar screen geïmporteerde volwassen zebrafish moeten leven wordt gehouden, wordt een fok-apparaat ingevoegd in de quarantaine-tank. Na een week, worden ontlasting en andere afvalstoffen in de fokkerij-apparaat verzameld en gescreend door microscopie of PCR. De techniek wordt hieronder beschreven en sommige P. tomentosa eieren werden ontdekt door microscopie in dit verband.

Protocol

1. blootstelling van pre filtratie wachters uit een recirculatie systeem

  1. Een schone 8 L tank uit een recirculatie systeem instellen Vul het aan met water afkomstig van de opslagrekken. Toevoegen van 2 keramische kralen of spons kubussen van bio-media van de systemen voor het scherm (Figuur 1). Voeg 1-2- D.rerio/l (dat wil zeggen, 12 vis). Wild type vis van de dominante genetische achtergrond gebruiken in de faciliteit, bijvoorbeeld AB.
    1. Selecteer ten minste 6 vis als volgt: ten minste één vrouwtje en een mannetje onder de 6 maanden van leeftijd, één vrouwtje en een mannetje tussen 6 en 18 maanden, en één vrouwtje en een mannetje boven de leeftijd van 18 maanden.
  2. Feed één keer per dag. Variëren de diëten (b.v., droge voeding, artemia) om ervoor te zorgen dat de sentinels zijn blootgesteld aan alle diëten die gebruikt in de zebravis faciliteit. Water op maandag, woensdag en vrijdag, dat wil zeggen, drie keer per week voor 4 maanden veranderen.
    1. Te verrichten het water veranderen, overdracht sentinels en bio-media naar een tijdelijke tank. Volledig de sentinel tank leeg en schoon te maken. Het bijvullen van de sentinel-tank met sump water alleen. Zet de sentinels en bio-media terug.
  3. De sentinels bloot voor 4 maanden naar sump water. Euthanaseren de vis door een erkende methode zoals onderdompeling in een overdosis oplossing van 2-fenoxyethanol (3 mL/L).
  4. Om te bevestigen dood, wacht 10 minuten na beëindiging van de opercula beweging.
    1. Pak het stoffelijk overschot met een tang en het geheel tot-80 ° C in een geïdentificeerde container bevriezen. Dit zal worden gebruikt voor PCR12,15.
    2. Als alternatief, knippen de tailat de caudal peduncle, nick van de buikwand en ingesteld in 4% formaline.
      Let op: Gebruik handschoenen en rook kabinet voor histopathologisch onderzoek. Label de monsterrecipiënt.

2. sump Swabs

  1. Gebruik een steriele droge swab met een kunststof schacht. Draag handschoenen. Zoek de oppervlakte doekje (sump muur aan de oppervlakte van het water) en verwijderen van een item gemakkelijk toegang tot de oppervlakte voorkomen. Kies een sump oppervlak met lage stroom.
  2. Het staafje unsheathe door het verwijderen van de buitenverpakking en bloot de steriele katoen-tip naar de lucht. Vermijd kruisbesmetting van het staafje door verzorgen niet te raken ongeteste oppervlakken.
    1. Swab het Carter muur op te vangen van het water en de biofilm niveau de sump water oppervlakte meer dan 5-10 cm.
    2. Het staafje terug sheath of breken van de tip in een steriele centrifugebuis. Label van het monster en ter PCR testen verzenden of bevriezen bij-80 ° C.

3. opsporing van P. tomentosa eieren aan de onderkant van een Tank

  1. Slib analyse door microscopie
    1. Gebruik een 60 mL spuit9 om het slib op de bodem van een sump of een tank bedrijf van vis, met inbegrip van de sentinels gecombineerd. Verdeel het monster in 15 mL tubes. Sluit de buizen met hun schroef tops en label van de buizen.
    2. Voorbereiden van de suikeroplossing verzadigd (soortelijk gewicht = 1.27) door het mengen van 227 g kristalsuiker in 177 mL warm water met een magneetroerder14.
    3. Centrifugeer de 15 mL tubes bij 175-250 x g gedurende 10 minuten in een centrifuge met schommel emmers. Decanteren in de buizen en houden van het sediment in hun buis.
    4. Vul de buizen halverwege met de suikeroplossing verzadigd. Sluit de buizen met hun schroef-top en meng grondig het sediment met de oplossing.
    5. Plaatsen van de buizen in de centrifuge schommel emmers en vul ze met verzadigde suikeroplossing naar de top. Stel een cover glas zachtjes op de top van elke buis en bij aanraking met de suikeroplossing verzadigd.
    6. Centrifugeer bij 175-250 x g gedurende 10 min. nota van dat de aantal cover glas kan vallen en tijdens centrifugeren vandaar er breken zijn 4 buizen voor elk monster van 60 mL. Til het deksel glas en zet deze dan op een glasplaatje. Label de dia met een potlood of marker pen.
      1. In het geval dat teveel cover glas breuken optreden, vullen opwaarts naar de meeste van de buis met de verzadigd suikeroplossing, centrifuge op 175-250 x g gedurende 10 minuten, vullen opwaarts naar de top met de suikeroplossing verzadigd, zachtjes en stel vervolgens de dekking glas. 30 min wachten.
    7. Kijk voor de P. tomentosa eieren met de Microscoop13 (Figuur 2 en Video 1). Het identificeren van de bipolaire stekkers op vergroting 400 X6.
      Opmerking: De grootte van de eieren is 57-78 µm lang en 27-39 µm diameter16,17. Merk op dat één positieve dia is genoeg voor het monster van 60 mL positief worden verklaard.
  2. Screening ingevoerde dieren in quarantaine voor P. tomentosa eieren
    1. Mannelijke en vrouwelijke D. rerio instellen in een tank. Toevoegen naar de tank vloeit een apparaat normaal gebruikt om te oogsten en bewaren van actieve eieren maar hier gebruiken voor het verzamelen van ontlasting (Figuur 3).
      Opmerking: bijvoorbeeld, een volle 1 L fokken tank (buitenste tank en binnentank met geraspte bodem) wordt volledig ondergedompeld in een 13 L tank, gratis toegang voor de vis te verplaatsen in en uit de fokkerij-apparaat.
    2. Verwijder het fokken apparaat na één week en oogst van de verzamelde slib in het fokken apparaat zoals beschreven in stap 3.1 "slib analysis door microscopie."

4. de PCR op slib Sediment

  1. Het slib op de bodem van een tank of Opvangbakken met een 60 mL spuit9 gecombineerd en het monster overbrengen in een tube 60 mL. Sluit de tube met haar schroef-top en label van de buis. Gooi de injectiespuit.
  2. Schud de tube 60 mL en 15 mL overbrengen in een tube van 15 mL. Sluit de tube met haar schroef-top en label van de buis.
  3. Centrifugeer de tube van 15 mL bij 175-250 x g gedurende 10 minuten in een centrifuge met schommel emmers. Decanteren in de buizen en houden van het sediment in de buis.
  4. Een doekje unsheathe door het verwijderen van de buitenverpakking en bloot de steriele katoen-tip naar de lucht. Vermijd kruisbesmetting van het staafje door verzorgen niet te raken ongeteste oppervlakken.
    1. Swab het sediment in de buis voor 15 s.
    2. Het staafje terug sheath of breken van de tip in een steriele centrifugebuis. Label van het monster, bevriezen bij-80 ° C en stuur voor PCR testen.
      Opmerking: 45 mL blijven in de tube 60 mL. Dit kan worden gehouden voor de detectie van P. tomentosa eieren door slib analyse door microscopie zoals beschreven in stap 3.1, om bijvoorbeeld te bevestigen van het PCR-resultaat. De PCR in het slib kan worden berecht voor het screenen van geïmporteerde dieren na stap 3.2.

Representative Results

De voordelen van de Carter-swabs te identificeren van overwegend Mycobacterium spp. in vergelijking met vis monsters worden ondersteund door de resultaten in Figuur 4. 115 vis getest, werden M. chelonae en M. haemophilum ontdekt in 5% en 3% van de monsters, respectievelijk. Geen andere pathogene mycobacteriële soorten werd geïdentificeerd. Van dezelfde systemen bleek 49 sump swabs de aanwezigheid van 5 mycobacteriële soorten. Verhouding van de odds worden berekend met de hypothese dat M. chelonae en M. fortuitum worden gedetecteerd vaker door PCR in de oppervlakte sump swabs dan in de vis monster. Dit is statistisch significant met respectieve odds ratio van 11 (95% CI: 4 tot en met 29; p < 0.0001) en 306 (95% CI: 18 tot 5208; p = 0.0001). De resultaten tonen aan dat de oppervlakte sump SWABTECHNIEK een waardevol alternatief voor het enige gebruik van sentinels naar scherm de zebravis faciliteit voor Mycobacterium spp. is De milieu monsters werden ook gebruikt aan het scherm voor A. hydrophila. Deze bacteriën werden ontdekt in vis, slib en oppervlakte monsters (Figuur 4). Dit ondersteunt ook het vermogen van de voorgestelde technieken om het scherm van de biotoop van de vis.

Met betrekking tot de analyse van het slib te detecteren P. tomentosa eieren, ontdekt Mocho9 de parasiet in 27% van de monsters van de vis door PCR en histopathologie overwegende dat de eieren werden ontdekt in 93% van de geanalyseerde slib van hetzelfde systeem. Hier, werd de techniek uitgedaagd om te reproduceren quarantaine screening. In dit verband kunnen niet geïmporteerde dieren worden bemonsterd, en beoordeling van hun gezondheidsstatus op een tijdige manier helpt met het beheer van de bioveiligheid. Vis met onbekende gezondheidsstatus van een positieve faciliteit van P. tomentosa werden vastgesteld in 8 tanks met het fokken van apparaten: maximaal 16 vis/13 L tank, 7 transgene en 1 wild type lijn, gemengd geslacht, leeftijd 4-24 maanden. Het slib werd geoogst van de apparaten na één week en geanalyseerd door microscopie. P. tomentosa eieren werden waargenomen in 7 (88%) monsters. Tenslotte, was de PCR detectie van de parasiet trialed op sump swabs en slib sedimenten. 4 van de 6 slib monsters waren positief PCR en alle resultaten waren negatief voor de oppervlakte swabs. Dit is niet verrassend aangezien de slib screening is afhankelijk van het vermogen van de eieren te dalen naar de bodem van de tank. Dit toont aan dat het slib analysetechnieken kunnen worden gebruikt om het scherm D. rerio aquaria voor P. tomentosa besmetting en dat de methoden aangepast voor de screening van geïmporteerde dieren worden kunnen.

Figure 1
Figuur 1: pre filtratie sentinel tank uit de recirculatie systeem. Een 8 L tank is gevuld met water en bio-media van de opslagrekken van de systemen naar scherm. De twee witte keramische bio-media kralen zitten aan de onderkant van de tank (in het midden van de foto). 12 vissen zijn geselecteerd op basis van hun leeftijd, soort en geslacht, en ze worden toegevoegd aan de sentinel-tank. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: P. tomentosa ei gedetecteerd tijdens slib analyse door microscopie. Vergroting gebruikt was 400 X. Pijlen geven aan dat de bipolaire stekkers. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: fokken apparaat ondergedompeld in een holdingstank vis voor het verzamelen van slib p.a.. Deze tank is ingesteld op een bankje met het oog op de afbeelding; Het ligt anders in de recirculatie systeem. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Percentage van identificatie van Mycobacterium spp., A. hydrophila, en P. tomentosa door PCR op vis, oppervlakte sump swabs en Opvangbakken slib. Percentage wordt verkregen door het aantal positieve resultaten voor elke soort ziekteverwekker te delen door het aantal geteste monsters. Het percentage positieve resultaten is gegeven door monster type als vis, oppervlak of slib, en aangegeven achter de naam van de van de bacteriën. 115 vis en 49 oppervlakte sump swabs werden getest door PCR voor de identificatie van Mycobacterium spp. De gegevens worden gecompileerd met de Mocho9 resultaten aangezien het is een uitbreiding van deze studie. De vissen zijn voornamelijk pre filtratie sentinels volgens protocol sectie 1. Zelden, als wachters niet beschikbaar waren, ontsnapte en oude kolonie vis (> 18 maanden) werden bemonsterd. Alle geteste systemen voor Mycobacterium spp. werden getest op vis en Opvangbakken swabs. Verhouding van de odds worden berekend met de hypothese dat M. chelonae en M. fortuitum worden gedetecteerd vaker door PCR in de oppervlakte sump swabs dan in de vis monster. Dit is statistisch significant met respectieve odds ratio van 11 (95% CI: 4 tot en met 29; p < 0.0001) en 306 (95% CI: 18 tot 5208; p = 0.0001). Mycobacterium marinum PCR werd negatief voor alle monsters en het is derhalve geacht afwezig van deze faciliteiten en niet opgenomen in de analyse. 12 vis, 14 oppervlakte sump swabs en 6 sump slib zijn getest door PCR voor de aanwezigheid van A. hydrophila. 6 opslagrekken werden getest op de aanwezigheid van P. tomentosa op het oppervlak en in het slib. PCR Polymerase-kettingreactie =. CI = betrouwbaarheidsinterval. * en ** geven statistische significantie; andere vergelijkingen waren niet statistisch significant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Video 1
Video 1: scannen voor een ei van P. tomentosa met de Microscoop. De dia wordt verkregen uit slib analyse, zoals beschreven in stap 3.1. Het veld wordt gescand op te sporen een ei van P. tomentosa. Zodra een structuur wordt herkend, is het bevestigen van de identificatie met een hogere resolutie ingezoomd. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Auteurs Leeftijd bij het begin van de blootstelling Lengte van de blootstelling Bemonstering leeftijd Pre- of Post
filtratie		 Geslacht Strain(s)
Barton et al. 3 4 maanden 6 maanden 10 maanden Pre filtratie N/B N/B
Borges et al. 4 6 maanden 6 maanden 12 maanden Pre filtratie N/B AB wild type
Collymore et al. 5 Zo jong mogelijk 3 maanden < 6 maanden Pre filtratie N/B N/B
Geisler et al. 6 4 maanden 4 maanden 8 maanden Pre en post
filtratie		 N/B AB wild type
Liu et al. 7 3 maanden 1-6 maanden 4-9 maanden Pre en post
filtratie		 N/B Wild type
Martins et al. 8 3 maanden 3 maanden 6 maanden Pre filtratie N/B Wild type
Mocho9 < 6 maanden,
6 - 12 maanden,
> 18 maanden		 4 maanden 7 - 24 maanden Pre filtratie 1 vrouw en
1 mannetje van
elke leeftijdsgroep		 AB wild type
Murray et al. 10 3-4 maanden 3 maanden, 6 maanden, 1 jaar 7, 10 en 16
maanden		 Pre en post
filtratie		 N/B AB wild type

Tabel 1: vergelijking van sentinel instellingen in zebrafish faciliteiten. De sentinel vis kan worden geselecteerd volgens hun leeftijd, geslacht of stam. Zij worden blootgesteld gedurende een bepaalde periode en ze ontvangen vóór of na filtratie systeem water. De gegevens zijn samengesteld uit het themanummer van 2016 op de gezondheid van de zebravis dagboek3,4,5,6,7,8,9, 10.

Discussion

Beperkingen van de technieken, kritische stappen, en probleemoplossing:

De leeftijd, het geslacht, de stam en de duur van blootstelling van de sentinels zijn niet gestandaardiseerd. Dit is weergegeven in tabel 1. Er is zeer weinig screening van vis onder de 6 maanden van leeftijd of leeftijd vis. Er kunnen sommige ziekteverwekkers die invloed hebben op de jonge vis aangezien er sommige ziekteverwekkers die vaker in de oudere bevolking10,18,19,20. Ook het geslacht wordt niet beschouwd als in de selectie van sommige groepen van de sentinel ondanks sommige verslag dat er een gender bias voor sommige ziekteverwekkers21is. De voorgestelde techniek probeert deze kwesties, hoewel de keuze van de stam kon worden gemaakt volgens een bepaalde ziekteverwekker te controleren. Bijvoorbeeld, TU zou kunnen helpen met de detectie van Mycobacterium spp.12,22, maar er is een risico dat de sentinels vervolgens als een reservoir of beeldscherm klinische symptomen fungeren zou. Met betrekking tot de duur van de blootstelling verhoogt de aanpak van de zebravis International Resource Center10 de kans op te sporen van ziekteverwekkers die met een ontoereikende besmetting periode kon worden gemist. De behoefte aan langdurige blootstelling impliceert dat sentinels niet dadelijk beschikbaar zijn. De toevoeging van de milieu monsters kan enige flexibiliteit en de vermenigvuldiging van de screening evenementen. Bijvoorbeeld, kan bemonstering plaatsvinden om de andere maand met een 4 maand interval tussen elke screeningmethode. Hierdoor kan het verstrijken van de tijd voordat een nieuw geïntroduceerde pathogeen wordt ontdekt.

De screening van de milieu-technieken, is afhankelijk van de opsporing van ziekteverwekkers in het milieu. De ziekteverwekkers zijn vergoten door de vissen en daarom in het systeem water verdund. De mogelijkheid van het vastleggen van de ziekteverwekkers door water filtratie23 werd niet onderzocht. De methoden die we beschrijven zijn alleen effectief als pathogenen genoeg tijd krijgen zijn om zich te vermenigvuldigen in vis en biofilm te bereiken van een drempel van verontreiniging waardoor detectie. Deze beperking van de technieken is geminimaliseerd door een kritische selectie van de bemonstering sites: het slib in de tank in plaats van het Carter slib wordt bemonsterd, en het water en de biofilm worden bemonsterd op het oppervlak van het Carter in plaats van in een tank of na filtratie. Alle monsters van hetzelfde systeem is echter onwaarschijnlijk dat hetzelfde resultaat opleveren. Positieve resultaten voor P. tomentosa kunnen worden bevestigd met behulp van een andere bepaling (Histopathologie, PCR of slib analyse). Mycobacteriële PCR positieve resultaten kunnen per cultuur of door een ander diagnostisch laboratorium worden bevestigd. Echter, bij de vaststelling van een gezondheidsstatus, verdere monsters worden aanbevolen negatieve resultaten van eventuele milieu screening techniek te bevestigen.

Betekenis van de techniek met de betrekking tot bestaande/alternatieve methoden:

Mycobacterium spp. zijn gebruikelijk in het milieu en hun aanwezigheid in het Carter doet niet voorspellen hun pathogeniteit12. Mocho9 bleek dat monitoring sterftecijfers is de sleutel tot het onderzoek van de ontwikkelingen van gezondheidskwesties. Het gebruik van dierlijke monsters blijft van essentieel belang om een veterinair onderzoek. Detectie van alle voorkomende ziekteverwekkers in een faciliteit gezondheidsmonitoring impliceert en dat lukt niet met het exclusieve gebruik van milieu screening technieken. Niettemin, is een gebrek aan gevoeligheid van de diagnostische hulpprogramma's kan vertragen of te verhinderen een nauwkeurige beschrijving van de gezondheidstoestand. Terwijl het gebruik van verklikkerdieren het aantal vissen nodig vermindert voor de detectie van een overwegend microbe in de bevolking, voegt het gebrek aan gevoeligheid gewicht aan het gebruik van een combinatie van methoden, met inbegrip van milieu screening5,23. Inderdaad wordt de specifieke pathogene vrije status meestal gedefinieerd als de afwezigheid van een soort in de faciliteit zodanig dat milieu en dier monsters negatief24,25 testen moeten.

De sump wattenstokje resultaten te identificeren Mycobacterium spp. tonen aan dat vertrouwen op vis monsters tot een vals negatieve gezondheidsstatus hebben leiden kunnen. De 6 geteste mycobacteriële soorten worden beschreven als pathogene of potentieel pathogene in zebrafish15 en sommige zou niet worden opgeheven door ei oppervlakte desinfectie met chloor26 als routinematig uitgevoerd in quarantaine. Daarom kan de valse negatieve gevolgen hebben sommige voor medewerkers die regels importeren. Bijvoorbeeld, M. fortuitum werd gemist door de PCR op vis monster, maar meer dan de helft van het Carter staafje PCR speurder op. Gezien het feit dat deze mycobacteriën meer resistent zijn tegen chloor dan anderen en hun vermogen om te groeien in de watersystemen27, is het een risico voor de niet-verontreinigde importerende faciliteit. Als u wilt dat de invoer van lijnen, moeten managers vertrouwen en de verslagen van de gezondheid van de exporterende faciliteit met hunne vergelijken. De ICLAS Performance evaluatie programma28 is de sleutel tot dit proces in knaagdieren. Het netwerk van RESAMA meldt de detectie van M. gordonae en M. mucogenicum in Franse D. rerio11. Deze mycobacteriën niet worden voorgesteld in de panelen van de commerciële laboratoria die we gebruiken. Het zou zinvol zijn om uit te breiden het programma ICLAS en harmonisatie van de diagnostische tests, alsmede de lijst van pathogene soorten29.

A. hydrophila is ook een ziekteverwekker die het potentieel heeft om te worden ingevoerd bij de invoer van dieren, hoewel de gevoeligheid voor chloor30 de afschaffing waarschijnlijker tijdens routinematige ei oppervlakte ontsmetting maakt. De Carter, zwabber en slib resultaten tonen dat milieu screening kan worden gebruikt voor het detecteren van deze pathogenen. Andere bacteriën zoals Mycobacterium spp. zijn opgetreden in het slib door PCR23. Dit soort monster is bijzonder relevant, aangezien hierdoor de opsporing van ziekteverwekkers van de schuur. Een andere nieuwe toepassing is bijvoorbeeld de analyse van slib te screenen van geïmporteerde vis in quarantaine voor P. tomentosa. De parasiet is een bedreiging voor dierlijke gezondheid13 en neoplasie modellen16. Bovendien zijn gebruikte in routine zebrafish ei oppervlakte ontsmetting van chloor-concentraties niet efficiënt31. De mogelijkheid om het scherm van de ingevoerde dieren met een omzet van één week en zonder enige vis euthanasie lijkt daarom zeer aantrekkelijk. Deze techniek kan de quarantaine en bioveiligheid regels beïnvloeden doordat een triage van invoer. Een besluitvormingsproces is ontworpen volgens de bekende pathogenen in de exporterende faciliteit, de gedetecteerde pathogenen in de monsters van de geïmporteerde vis, en het risico van de gezondheidstoestand van de importerende faciliteit10in gevaar te brengen.

Toekomstige toepassingen of richtingen na het beheersen van deze technieken:

Zelfs als routine quarantaine behandeling de gekozen optie is, kan de werkzaamheid van zulke medicijnen32,33,34,35,,36 worden beoordeeld met de fok apparaat slib analyse. Meer in het algemeen, de milieu-screening kan worden gebruikt voor het testen van verbindingen tegen bacteriën en parasiet uitroeiing, met inbegrip van in de vis-biotoop. Een andere niche toepassing van de milieu-screening is het monitoren van de pathogeen-bevolking in de live feed37,,38. Hoewel de belangrijkste toepassing van deze technieken als een waardevolle toevoeging aan de diagnose werkset voor de gezondheidsmonitoring in zebrafish faciliteiten is. Dankzij een nauwkeuriger, kosten en tijd efficiënt definitie van de gezondheidstoestand, sump swabs en slib analyse zijn complementair aan de bewaking van de sentinel en de praktijk routine quarantaine. Inderdaad, de toekomst van deze technieken is als een routine onderdeel van alle aquatische laboratoriumrapport voor de gezondheid.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedank het BRF zwemmen team van het Francis Crick Instituut voor hun technische hulp en kritische input. Dit werk werd gesteund door het Francis Crick Instituut die ontvangt de basisfinanciering van het Cancer Research UK (FC001999), de Britse Medical Research Council (FC001999) en de Wellcome Trust (FC001999).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aqua-Sed 250 mL Vetark 2-phenoxyethanol
Tubed Sterile Dryswab Tip mwe MW100 Sump surface
BD Plastipak Disposable Syringe 50mL Eccentric Becton
Dickinson		 300866 They are actually
graduated to 60 ml
Centrifuge tube 15 mL Corning Corning 430766
Centaur 2 benchtop centrifuge with 4 x 200 mL Swing–Out Rotor (unsealed) Sanyo MSB020.CX1.5
Cover Glass 22 mm x22 mm Menzel-Glaser MNJ-350-020H
Plain Swab Sterile Plastic Applicator Rayon Tipped White Cap Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific F155CA Swab sediment from sludge
50 mL Self-Standing Centrifuge Tube CentriStar Cap Corning 430921
In-Tank Spawning Tray Set MBK Installations Ltd

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schroeder, P., Mocho, J. P. A veterinary perspective on laboratory zebrafish welfare. Fish Veterinary Journal. 14, 37-46 (2014).
  2. Mason, T., et al. Strategies to Mitigate a Mycobacterium marinum Outbreak in a Zebrafish Research Facility. Zebrafish. 13, Suppl 1. 77-87 (2016).
  3. Barton, C. L., Johnson, E. W., Tanguay, R. L. Facility Design and Health Management Program at the Sinnhuber Aquatic Research Laboratory. Zebrafish. 13, Suppl 1. 39-43 (2016).
  4. Borges, A. C., et al. Implementation of a Zebrafish Health Program in a Research Facility: A 4-Year Retrospective Study. Zebrafish. 13, Suppl 1. 115-126 (2016).
  5. Collymore, C., Crim, M. J., Lieggi, C. Recommendations for Health Monitoring and Reporting for Zebrafish Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 138-148 (2016).
  6. Geisler, R., Borel, N., Ferg, M., Maier, J. V., Strähle, U. Maintenance of Zebrafish Lines at the European Zebrafish Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 19-23 (2016).
  7. Liu, L., Pan, L., Li, K., Zhang, Y., Zhu, Z., Sun, Y. Zebrafish Health Conditions in the China Zebrafish Resource Center and 20 Major Chinese Zebrafish Laboratories. Zebrafish. 13, Suppl 1. 8-18 (2016).
  8. Martins, S., Monteiro, J. F., Vito, M., Weintraub, D., Almeida, J., Certal, A. C. Toward an Integrated Zebrafish Health Management Program Supporting Cancer and Neuroscience Research. Zebrafish. 13, Suppl 1. 47-55 (2016).
  9. Mocho, J. -P. Three-Dimensional Screen: A Comprehensive Approach to the Health Monitoring of Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 132-137 (2016).
  10. Murray, K. N., Varga, Z. M., Kent, M. L. Biosecurity and Health Monitoring at the Zebrafish International Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 30-38 (2016).
  11. Legendre, L., et al. RESAMA: A Network for Monitoring Health and Husbandry Practices in Aquatic Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 56-65 (2016).
  12. Whipps, C. M., Matthews, J. L., Kent, M. L. Distribution and genetic characterization of Mycobacterium chelonae in laboratory zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 82 (1), 45-54 (2008).
  13. Murray, K. N., Peterson, T. S. Pathology in practice. P. tomentosa infection in zebrafish. J Am Vet Med Assoc. 246 (2), 201-203 (2015).
  14. Foreyt, W. J. Veterinary Parasitology Reference Manual. , 5th Edition, Wiley-Blackwell. Ames, IA. (2001).
  15. Whipps, C. M., Lieggi, C., Wagner, R. Mycobacteriosis in zebrafish colonies. ILAR J. 53 (2), 95-105 (2012).
  16. Kent, M. L., Bishop-Stewart, J. K., Matthews, J. L., Spitsbergen, J. M. Pseudocapillaria tomentosa, a nematode pathogen, and associated neoplasms of zebrafish (Danio rerio) kept in research colonies. Comp Med. 52 (4), 354-358 (2002).
  17. Moravec, F. Observations on the bionomy of the nematode Pseudocapillaria brevispicula (Linstow, 1873). Folia Parasitol. 30, 229-241 (1983).
  18. Ramsay, J. M., Watral, V., Schreck, C. B., Kent, M. L. Pseudoloma neurophilia infections in zebrafish Danio rerio: effects of stress on survival, growth, and reproduction. Dis Aquat Organ. 88 (1), 69-84 (2009).
  19. Watral, V., Kent, M. L. Pathogenesis of Mycobacterium spp. in zebrafish (Danio rerio) from research facilities. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 145, 55-60 (2007).
  20. Whipps, C. M., Dougan, S. T., Kent, M. L. Mycobacterium haemophilum infections of zebrafish (Danio rerio) in research facilities. FEMS Microbiol Lett. 270, 21-26 (2007).
  21. Chow, F. W., Xue, L., Kent, M. L. Retrospective study of the prevalence of Pseudoloma neurophilia shows male sex bias in zebrafish Danio rerio (Hamilton-Buchanan). J Fish Dis. 39 (3), 367-370 (2016).
  22. Murray, K. N., Bauer, J., Tallen, A., Matthews, J. L., Westerfield, M., Varga, Z. M. Characterization and management of asymptomatic Mycobacterium infections at the Zebrafish International Resource Center. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 675-679 (2011).
  23. Crim, M. J., Lawrence, C., Livingston, R. S., Rakitin, A., Hurley, S. J., Riley, L. K. Comparison of Antemortem and Environmental Samples for Zebrafish Health Monitoring and Quarantine. J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2017).
  24. Jensen, E. S., Allen, K. P., Henderson, K. S., Szabo, A., Thulin, J. D. PCR testing of a ventilated caging system to detect murine fur mites. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (1), 28-33 (2013).
  25. Commission Regulation (EC) No 1168/2006 of 31 July 2006 implementing Regulation (EC) No 2160/2003 as regards a Community target for the reduction of the prevalence of certain salmonella serotypes in laying hens of Gallus gallus and amending Regulation (EC) No 1003/2005 (Text with EEA relevance). OJ. L. 211, 4-8 (2006).
  26. Chang, C. T., Colicino, E. G., DiPaola, E. J., Al-Hasnawi, H. J., Whipps, C. M. Evaluating the effectiveness of common disinfectants at preventing the propagation of Mycobacterium spp. isolated from zebrafish. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 45-50 (2015).
  27. Le Dantec, C., Duguet, J. P., Montiel, A., Dumoutier, N., Dubrou, S., Vincent, V. Chlorine disinfection of atypical mycobacteria isolated from a water distribution system. Appl Environ Microbiol. 68 (3), 1025-1032 (2002).
  28. Goto, K., Hayashimoto, N., Ishida, T., Takakura, A., Kagiyama, N. First trial in the developmental phase of the "performance evaluation program" based on the ICLAS animal quality network program: self-assessment of microbiological monitoring methods using test samples supplied by ICLAS. Exp Anim. 58 (1), 47-52 (2009).
  29. Nogueira, C. L., et al. Mycobacterium saopaulense sp. nov., a rapidly growing mycobacterium closely related to members of the Mycobacterium chelonae--Mycobacterium abscessus group. Int J Syst Evol Microbiol. 65 (12), 4403-4409 (2015).
  30. Massa, S., Armuzzi, R., Tosques, M., Canganella, F., Trovatelli, L. D. Note: susceptibility to chlorine of Aeromonas hydrophila strains. J Appl Microbiol. 86 (1), 168-173 (1999).
  31. Martins, M. L., Watral, V., Rodrigues-Soares, J. P., Kent, M. L. A method for collecting eggs of Pseudocapillaria tomentosa (Nematoda: Capillariidae) from zebrafish Danio rerio and efficacy of heat and chlorine for killing the nematode's eggs. J Fish Dis. 40 (2), 169-182 (2017).
  32. Maley, D., Laird, A. S., Rinkwitz, S., Becker, T. S. A simple and efficient protocol for the treatment of zebrafish colonies infected with parasitic nematodes. Zebrafish. 10 (3), 447-450 (2013).
  33. Samaee, S. M. Experimental Assessment of the Efficacy of Five Veterinary Broad-Spectrum Anthelmintics to Control the Intestinal Capillariasis in Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 12 (3), 255-267 (2015).
  34. Collymore, C., et al. Tolerance and Efficacy of Emamectin Benzoate and Ivermectin for the Treatment of Pseudocapillaria tomentosa in Laboratory Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 11 (5), 490-497 (2014).
  35. Chang, C. T., Whipps, C. M. Activity of Antibiotics against Mycobacterium Species Commonly Found in Laboratory Zebrafish. Journal of Aquatic Animal Health. 27 (2), 88-95 (2015).
  36. Chang, C. T., Doerr, K. M., Whipps, C. M. Antibiotic treatment of zebrafish mycobacteriosis: tolerance and efficacy of treatments with tigecycline and clarithromycin. J Fish Dis. , (2017).
  37. Peterson, T. S., Ferguson, J. A., Watral, V. G., Mutoji, K. N., Ennis, D. G., Kent, M. L. Paramecium caudatum enhances transmission and infectivity of Mycobacterium marinum and M. chelonae in zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 106 (3), 229-239 (2013).
  38. Watts, S. A., Lawrence, C., Powell, M., D'Abramo, L. R. The Vital Relationship Between Nutrition and Health in Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 72-76 (2016).

Tags

Microbiologie kwestie 130 milieu screening Aeromonas hydrophila Mycobacterium spp. Pseudocapillaria tomentosa zebravis Danio rerio gezondheidsmonitoring biofilm slib quarantaine vis water Microbiologie
Milieu Screening van <em>Aeromonas hydrophila</em>, <em>Mycobacterium</em> spp. en <em>Pseudocapillaria tomentosa</em> in Zebrafish systemen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mocho, J. P., Martin, D. J.,… More

Mocho, J. P., Martin, D. J., Millington, M. E., Saavedra Torres, Y. Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems. J. Vis. Exp. (130), e55306, doi:10.3791/55306 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter