Selezione ambientale di hydrophila dell'aeromonas, Mycobacterium spp. e Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish sistemi

L'obiettivo generale di questa tecnica di campionamento è ridurre il numero di pesci utilizzati per il monitoraggio sanitario e ottimizzare il turnover, i costi e la sensibilità del rilevamento degli agenti patogeni, anche durante lo screening delle importazioni in quarantena. Questa tecnica aiuta a definire gli statuti sanitari delle colonie rifugio. Questo metodo è uno strumento utile per leggere o valutare l'efficienza del trattamento.

Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è lo screening e il triage delle importazioni in quarantena. Rafforza il piano di biosicurezza dell'impianto acquatico. Per iniziare il protocollo, posiziona un serbatoio pulito da otto litri da un sistema di ricircolo.

Riempire il serbatoio con circa otto litri di acqua proveniente dai pozzetti. Aggiungere due perle di ceramica o cubi di spugna di biomedia dai sistemi per lo screening. Successivamente, aggiungi uno per fare Danio rerio per litro, utilizzando pesci di tipo selvatico del background genetico dominante nella struttura, ad esempio A B.Seleziona almeno sei pesci.

Dai da mangiare ai pesci una volta al giorno. Varia le diete per assicurarti che le sentinelle siano esposte a tutte le diete utilizzate nello stabilimento del pesce zebra. Per effettuare il cambio dell'acqua, trasferire le sentinelle in biomedia in una vasca temporanea.

Svuotare completamente il serbatoio sentinella e pulirlo. Riempire il serbatoio sentinella solo con acqua di pozzetto e riposizionare le sentinelle e il biomedia. Dopo aver esposto le sentinelle all'acqua di pozzetto per quattro mesi, sopprimere il pesce con un metodo approvato come l'immersione in una soluzione di sovradosaggio di 2-fenossietanolo.

Per confermare la morte, attendere dieci minuti dopo la cessazione del movimento dell'opercolo. Afferra il cadavere con una pinza e congelalo completamente a meno 80 gradi Celsius in un contenitore identificato. Preparare un tampone sterile asciutto con un'asta di plastica e indossare i guanti.

Individuare la superficie da tamponare. Scegliere una superficie del pozzetto a basso flusso, la parete del pozzetto sulla superficie dell'acqua e rimuovere qualsiasi oggetto che impedisca un facile accesso alla superficie. Quindi, sguainare il tampone rimuovendo l'imballaggio esterno ed esporre la punta di cotone sterile all'aria.

Tamponare la parete del pozzetto da cinque a 10 centimetri per assorbire l'acqua e il biofilm a livello della superficie dell'acqua del pozzetto. Quindi riavvolgere il tampone o rompere la punta in una provetta da centrifuga sterile. Etichettare il campione e inviarlo per il test PCR o congelarlo a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

Per eseguire l'analisi dei fanghi al microscopio, utilizzare una siringa da 60 millilitri per aspirare i fanghi sul fondo di un pozzetto. Dividere il campione in provette da 15 millilitri. Avvitare i tappi ed etichettare le provette.

Centrifugare le provette da 15 millilitri a una velocità compresa tra 175 e 250 volte superiore per dieci minuti in una centrifuga con secchi oscillanti. Decantare i tubi. Dopo la decantazione, conservare i sedimenti.

Successivamente, preparare la soluzione satura di zucchero mescolando 227 grammi di zucchero semolato e 177 millilitri di acqua calda con un agitatore magnetico. Riempire i tubi a metà con la soluzione satura di zucchero. Avvitare i tappi e mescolare accuratamente il sedimento con la soluzione.

Posizionare le provette nei secchi oscillanti della centrifuga e riempirle fino in cima con una soluzione satura di zucchero. Posizionare delicatamente un bicchiere di copertura sopra ogni tubo in modo che sia a contatto con la soluzione satura di zucchero. Si noti che le quattro provette per ogni campione da 60 millilitri sono nel caso in cui un vetro di copertura cada e si rompa durante la centrifugazione.

Una volta completata la centrifuga, sollevare il vetro di copertura e posizionarlo su un vetrino, quindi etichettare il vetrino con una matita o un pennarello. Nel caso in cui si verifichino troppe rotture del vetro di copertura, riempire la maggior parte della provetta con la soluzione satura di zucchero e centrifugare la provetta. Riempire fino in cima con la soluzione satura di zucchero, quindi posizionare delicatamente il vetro di copertura e attendere 30 minuti.

Cerca le uova di pseudocapillaria tomentosa con il microscopio. Identificare le spine bipolari con un ingrandimento di 400X. Per verificare la presenza di uova di P.tomentosa da parte degli animali importati in quarantena, mettete il maschio e la femmina di Danio rerio in una vasca e aggiungete la vaschetta di deposizione delle uova nella vasca, ma usatela qui per raccogliere le feci.

Dopo una settimana, rimuovere il dispositivo di riproduzione e raccogliere i fanghi raccolti nel dispositivo di riproduzione come descritto in precedenza. Aspirare il fango sul fondo di un serbatoio o di un pozzetto con una siringa da 60 millilitri e trasferire il campione in una provetta da 60 millilitri. Chiudere il tubo con il tappo a vite ed etichettare il tubo.

Smaltire la siringa. Agitare la provetta da 60 millilitri e trasferire 15 millilitri in una provetta da 15 millilitri. Chiudere il tubo con il tappo a vite ed etichettare il tubo.

Centrifugare la provetta da 15 millilitri a una velocità compresa tra 175 e 250 volte superiore per dieci minuti in una centrifuga con secchi oscillanti. Decantare i tubi e mantenere il sedimento nel tubo. Sfoderare il tampone rimuovendo l'imballaggio esterno ed esporre la punta di cotone sterile all'aria.

Tamponare il sedimento nella provetta per 15 secondi. Riavvolgere il tampone o rompere la punta in una provetta da centrifuga sterile. Etichettare il campione.

Congelare a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius e inviare per il test PCR. Utilizzando il metodo del tampone di 115 pesci testati, il Mycobaterium chelonae è stato rilevato nel 5% dei campioni e il Mycobaterium haemophilum è stato rilevato nel 3% dei campioni e sono state le uniche specie patogene identificate. Dagli stessi sistemi, 49 tamponi di pozzetto hanno rivelato la presenza di cinque specie micobateriali.

Gli odds ratio mostrano che la tecnica del tampone di superficie è una valida alternativa al solo uso di sentinelle per lo screening del Mycobacterium nell'impianto di zebrafish. I campioni ambientali sono stati utilizzati anche per lo screening di Aeromonas hydrophila, che sono stati rilevati in pesci, fanghi e campioni di superficie, supportando la capacità delle tecniche proposte di esaminare il biotopo ittico. Il Mycobacterium chelonae e il Mycobacterium fortuitum sono rilevati più frequentemente mediante PCR nei tamponi del pozzetto superficiale che nel campione di pesce.

Una volta padroneggiato, il campionamento richiede solo pochi minuti e il rilevamento delle uova di pseudocapillaria tomentosa può essere effettuato in un'ora. Questa tecnica rende lo screening ambientale una parte fondamentale del programma di monitoraggio sanitario di routine. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della patologia dei pesci, come la relazione tra biofilm batterico e infezione batterica.