Summary
Неравномерное потери среды от микротитровальных пластин влияет на воспроизводимость однородного многоклеточного образования опухоли сфероида. Улучшение условий культивирования, чтобы уменьшить значительную потерю среды улучшит воспроизводимости сфероида формирования и результаты анализов на основе сфероида с использованием жидкости наложения техники.
Abstract
Модели опухолей , которые близко имитируют в естественных условиях становятся все более популярными в новых лекарств и развития для скрининга потенциальных противоопухолевых препаратов. Многоклеточные опухолевые сфероиды (MCTSes) эффективно имитировать физиологические условия солидных опухолей, что делает их отличным в моделях пробирке для свинца оптимизации и целевой проверки. Из различных методов, доступных для MCTS культуры, жидкость-оверлей методом на агарозном является одним из самых недорогих способов генерации MCTS. Тем не менее, надежная передача МСТ культур с использованием жидкого-наложению для высокопроизводительного скрининга может быть поставлена под угрозу ряд ограничений, в том числе покрытия микротитровальных пластин (ОББ) агарозой и невоспроизводимости равномерного формирования MCTS поперек скважин. Депутаты значительно склонны к краевыми эффектами, которые являются результатом чрезмерного испарения среды из наружной поверхности пластины, предотвращая использование всей пластины для лекарственного средстватесты. Эта рукопись содержит подробные технические усовершенствования жидкости наложения техники для повышения масштабируемости и воспроизводимости равномерного формирования MCTS. Кроме того, подробные сведения о простом, полуавтоматической и универсально применимой программный инструмент для оценки MCTS особенности после того, как лекарственная терапия представлена.
Introduction
Раковые клетки в опухоли физиологически расположены в комплексе, 3-мерные (3D) структуры, окруженной внеклеточного матрикса и взаимодействующих клеток. Поскольку почти все клетки в тканях располагаются в 3D - среде, потребность в более физиологически актуальной в пробирке моделях опухолей , которые имитируют опухолевые черты привело к разработке нескольких 3D методов культивирования 1, 2, 3. Эти модели в настоящее время становятся фундаментальные инструменты исследования для изучения роли микроокружения опухоли на метастазирование и клеточной реакции на терапии в 3D 2. Кроме того, по сравнению с 2-мерных (2D) клеточных культур 4, 3D - модели позволяют лучше понять опухоли стромы взаимодействий, которые влияют на клеточные сигнальные пути.
Многоклеточных опухолевых сфероидов (MCTSes) линий раковых клеток часто используются в 3D Cell CМодели ulture из - за их относительной близости к опухолям в естественных условиях. Из нескольких методов в использовании, жидкость-оверлей техника (LOT) генерации MCTS на агарозном пластинок , покрытых приобрел значительный интерес для оптимизации свинца и целевой проверки 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Это видно из последних исследований , которые были успешно в состоянии запустить пилотные экраны библиотек соединений в MCTS культур с использованием LOT 6, 7. Тем не менее, хорошо к скважине изменчивости в MCTS морфологии и роста за счет испарения, вызванной неравномерным потери среды являются обычными препятствиями, которые сопровождают LOT с использованием микротитрационных планшетов (ОББ). Следовательно, формирование неравномерной MCTSes ставит под угрозу значимость и актуальностьданных , полученных из фармакологической анализов 8, 12, 13. В дополнение к проблемам воспроизводимости, другая практическая проблема, которая затрагивает LOT, основанные на высокой пропускной способности анализов является покрытие из депутатов с агарозы при использовании автоматической жидкости раздаточного устройства. Несмотря на то, дозирующий узел может быть нагретый , чтобы предотвратить гелеобразование агарозы, засорение раздаточного кассеты и трубки является потенциальной проблемой для роботизированных систем 6.
Для преодоления некоторых из этих проблем, в последнее время мы разработали несколько модификаций в LOT для MCTS культуры 8. Эти изменения в основном базируются на возможных путях предотвращения неравномерного потери среды от депутатов с помощью инструментов, которые обычно встречаются в высокой пропускной способности скрининговых лабораторий. Детальная процедура модифицированного LOT для генерации одинакового размера и воспроизводимых MCTSes через 384-луночные планшеты (WPS) здесь представлена. Рукопись также представляет собой полуавтоматическую процедуру для оценки размера MCTS, особенно в частично разрушенными, обработанными наркотиками MCTSes, которые не имеют четко определенную границу для измерения площади поперечного сечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка пластин, покрытых агарозой
- Взвешивают 0,75 г легкоплавкой агарозе и добавить его к 100 мл среды 5А Маккоя (с или без фенола красного) без сыворотки. Раствор нагревают в микроволновой печи и вихрем через каждые 1-2 мин до полного растворения агарозы. Автоклава решение стерилизовать его.
- Охлаждают автоклавированы агарозы до приблизительно 70 ° С и фильтруют ее через 500 мл, 0,22 мкм сверху с помощью вакуумной фильтрации в коробке с ламинарным потоком воздуха. Алиготе 0,75% отфильтрованного раствора агарозы (ФАС) в меньших объемах, если не использовать весь раствор сразу. Храните готовый к использованию агарозном асептически раствор в холодном помещении или на 4 ° C холодильнике до 4 недель.
- Приложить маленькую трубку с пластически или металлическим наконечником раздаточного кассеты в дозатор реагента Combi и прайм кассеты с 70% -ным этанолом (EtOH), а затем стерильным фосфатно-солевом буфере (PBS), в коробке потока.
- Перед использованием нагреть хранящуюся аликвоты ФАС я п микроволновое и расплавить. Премьер-раздаточный кассету с раствором агарозы и пальто 384-хорошо, тканевой культуры (ТС) -обработанной "специальный" микропланшет с 15 мкл ФАС. Дайте агарозы в пластине, чтобы охладиться в течение 15-20 мин перед посевом клеток. Храните пластины агарозном покрытием асептически, завернутым в полиэтиленовый пакет в холодном помещении или при температуре 4 ° С, вдали от прямых солнечных лучей.
Примечание: Избегать повторного нагрева 0,75% FAS, чтобы предотвратить изменение концентрации агарозы в маточном растворе. Агарозы покрытием пластины можно хранить в течение до 2-х недель при хранении при указанных выше условиях. ФАС не требует нагревания во время нанесения покрытия пластин. - Очистите дозирующий кассету наполнением это 70-80 ° C стерильной водой для удаления остатков агарозы в кассете наконечников и трубок.
2. Культура клеток и MCTS Формирование
- Культура клеток НСТ116 колоректальной карциномы человека, как это было описано ранеедеваха = "Xref"> 8.
- Удалить необходимое количество агарозы покрытием, 384-луночный, ТЦ обработанных микропланшетов из холодного хранения и уравновешивают их до комнатной температуры (КТ) в течение 15 мин.
- Подготовить дозатор реагента Combi для посева клеток с помощью грунтовки стандартной трубки раздаточного кассету с 70% этанола и стерильного PBS. Отрегулируйте громкость высева до требуемого мкл и скорость размена среды с помощью ручных кнопок настройки на раздаточном устройстве.
Примечание: Весь процесс посева клеток проводят в стерильных условиях и в коробке с ламинарным потоком воздуха. - Диссоциируют прилипшие клетки из колбы для культивирования тканей с использованием рекомбинантной клетки-диссоциации фермента. Делают суспензии клеток запас в стерильном стакане с семенных клеток при плотности 2,5 × 10 4 клеток / мл на лунку в объеме 50 мкл полной среды для роста. При посеве более одного 384-WP, размешать клетки с помощью магнитной мешалки, чтобы предотвратить их оседание на дно стакана.
- РазрешитьПланшеты на отдых в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем центрифугировать в течение 15 мин при 4 х г.
- В то же время, возьмите экологическую крышку неиспаряемого восстанавливающих и залейте его 8 мл стерильного H 2 O или 5% диметилсульфоксид (ДМСО) в коротких сторон (слева и справа) с помощью 5 мл пипетки (Рис . 1А) Во-первых, обойтись 4 мл наполняющей жидкости в левой части желоба при развертке кончиком пипетки медленно вверх и вниз. Повторите этот шаг с правой стороны желоба.
Примечание: Убедитесь в том, что жидкость добавили к боковым впадинами не сливается в центре крышки, и оставить зазор для газообмена (рисунок 1А). Добавление избыточного количества H 2 O результаты в просачивание H 2 O на внешней стороне крышки , а затем во внешние лунки 384-луночного ТС пластин. - Заполните резервуар для жидкости в 384-луночного TC пластины с стерильной H 2 O и заменить обычные крышки пластины с жидким диэлектриком окружающей среды крышками (рис 2А).
- Место пластин в ротационном инкубаторе 37 ° С и относительной влажности 95%, 5% CO 2 и 20% O 2, и позволяют клеткам слипаются в MCTSes в течение 4 -х дней. Избегайте открывания двери инкубатора слишком долго в последующие дни, чтобы предотвратить уровень влажности от падения резко.
3. Средний Обмен с помощью системы Robotic
- На 4-й день с последующим образованием MCTS, добавьте 30 мкл подогретого среды на лунку с помощью автоматизированной микропланшетов дозатора. Дайте MCTSes расти еще в течение 3 дней. Замените среду регулярно каждые 3 дня, пока они не достигают желаемого размера для экспериментов.
- Аспирация определенного объема среды из каждой лунки, эмпирически регулировать г -высота стирально многообразия. Отберите 30 мкл среды на лунку и заменить его 30 мкл свежей, подогретого среды.
Примечание: Установите скорость дозирования и скорость, с которой шайба коллектора проходит внизв лунки на самой низкой скорости, чтобы минимизировать турбулентность в скважинах.
4. высокого содержания Визуализация MCTS и полуавтоматический анализ изображений
- Изображение MCTS в автоматизированной системе формирования изображения высокого содержания с использованием объектива 4X воздуха (NA 16).
- Установите время экспозиции 11 мс и биннинга до 4 х 4. Регулировка количества и интервалов между г -stacks и пикселем биннинга в качестве желаемого для эксперимента , чтобы захватить весь MCTS на лунку.
- Процесс ступенчато изображения, как описано в "ридми", используя подпрограмму в доме, написанный на языке программирования.
Примечание: Код .m и .txt README файлы доступны в качестве дополнительных файлов кода (Рисунок 1В). Рутинные измеряет площадь MCTS, большой и малой осей, периметр, и основательность от 2D-изображений.
Рисунок 1:Подготовка экологических крышек и блок-схема алгоритма полуавтоматического рутины. (A) Изображение испарительную снижения экологической крышки , заполненной правильной (слева) и избыток (справа) количеством наполняющей жидкости ( в данном случае , 5% ДМСО). Стрелка указывает на короткой стороны желоба для добавления жидкости. Звездочка показывает разрыв в середине крышки после добавления правильного объема ДМСО. (B) Последовательность действий , показывающая этапы в полуавтоматическом рутинного анализа изображений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Неравномерное потеря среды, особенно из периферийных скважин, является часто встречающийся вопрос в депутаты с небольшими объемами культуры. Значительно улучшенные условия культивирования, такие как инкубаторы с хорошо контролируемой температуры / систем увлажнения и испарения снижающих депутатов и крышек пластин, снизить значительные потери среды через 8 скважин. Для измерения относительного испарения, равные объемы Оранжевой G (OG) добавляли в каждую лунку, и изменение оптической плотности ОГ в течение 3-х дней был записан в виде пластин с регулярными и экологическими крышками в стандартных и поворотных инкубаторах. Пластинчатые скважины были разделены на 6 групп в зависимости от их расстояния от края пластины (фиг.2А). В группах 1-4, наблюдалось значительное изменение оптической плотности ОГ с течением времени в виде пластин с регулярными крышками в стандартном инкубаторе (Фигура 2В). Несмотря на то, существует также изменение оптической плотности от О.Г.1 -я группа скважин в пластинах под крышкой / роторного инкубаторе комбинации окружающей среды (фиг.2С), коэффициенты вариации (ППО) были значительно ниже по сравнению с теми из пластин с регулярными крышками в стандартном инкубаторе (рис 2D).
Испарение индуцированный неравномерным потери среды является одной из потенциальных причин хорошо к скважине изменчивости размера MCTS и анализа считывания в 8 депутатов. Тем не менее, 384-TC пластины с крышкой / роторного комбинации окружающей инкубатор привело к образованию однородных MCTSes через 6 групп скважин (рис 2E). В противоположность этому , MCTSes в пластинах с обычной крышкой / стандартной комбинации инкубатора значительно различаются по размеру и прочности (рис 3F). Монолитность является мерой МСТ сферичности и дает степень распада MCTS. Монолитности 2D области доля пикселей в сотрудничествеnvex корпус области интереса (ROI) и определяется путем деления площади ROI в области выпуклой оболочки ROI. Обе круговые и эллиптические области имеют монолитность 1, а также разлагает MCTS, монолитность уменьшается. Разница в области уже сообщалось в Дас и соавт. (2016 г.) 8. Объем был рассчитан из основных и второстепенных осей MCTSes.
Рисунок 2: Пластины с минимальным результатом испарения в повышенной MCTS воспроизводимости. (А) Тарелка карта представлена показать разделение скважин на 6 групп. (В и С) Существует значительное зависит от времени вариации в относительной оптической плотности ОГ из скважин , в группах 1-4 в пластинах , культивированных в стандартном инкубаторе с регулярными крышками (В) и из группы 1 мыLLS в пластинах с экологическими крышками в ротационном инкубаторе (C). День 3-5 OG Поглощения нормированы на день 0. (D) Усредненные резюме Ога оптической плотности 1 -й группе скважин из дней 3-5 показаны для комбинаций крышки / инкубатора две пластины. CVs представляют собой средние значения из 3 независимых экспериментов. (Е) MCTSes , образованные в пластинах с комбинацией окружающей крышкой / роторный инкубатора существенно не отличались по 6 группам скважин. (В) Тем не менее, пластины с регулярными крышками в стандартном инкубаторе формируется MCTSes переменного размера. Данные приведены для п> 60 MCTSes в каждой группе. Коробки и горизонтальные полосы внутри коробки в присущи рефлективный , вербальный представляют 25 - й и 75 - й процентили и медианы, соответственно. Усы представляют 5 - й и 95 - й процентили, а выпадающие обозначены выровненных черными точками в присущи рефлективный , вербальный. P-значения анализа Крускала-Уоллиса представлены ниже EACч boxplot. Эти данные, по меньшей мере, 3-х независимых экспериментов на пластину комбинации крышки / инкубаторе. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Для того, чтобы определить потенциальную применимость обычной, 7 дневных MCTSes обрабатывали паклитакселом (PTX), винкристина (VCR), оксалиплатина (OXA), доксорубицин (DOX), и 5-flurouracil (5-ФУ) в 3-х различных концентрациях в течение 4-х дней. Препараты были получены из университетской больницы Оломоуц, Университет Палацкого. Изображения MCTS затем анализировали, а площадь, большая и малая оси, периметр, и монолитность обработанных MCTSes сравнивали с контрольной группой (CTL). Главные и малые оси были использованы для расчета геометрического объема. Был зависимости от концентрации уменьшение MCTS площади и объема после медикаментозного лечения (рисунок 3). Хотя 0,001 мкг / мл VCR и 0,4 мкг / мл DOX и 5-ФУ привело к увеличению площади MCTS, объем был значительно увеличен только после 0,001 мкг / мл видеомагнитофоне. MCTS периметр существенно отличалась только при самых высоких концентрациях PTX, DOX и 5-ФУ, который полностью повлияло на размер MCTS. PTX и видеомагнитофонов на уровне 0,25 мкг / мл и 0,06 мкг / мл и DOX и 5-FU при 100 мкг / мл приводило к значительному снижению прочности, что указывает на полное к частичной дезинтеграцию MCTSes (рисунок 3).
Рисунок 3: Измерение эффектов наркотиков в MCTSes по полуавтоматическим рутина. Представлены (A) Изображения CTL и MCTSes наркотиков лечение. Шкала бар = 10 мкм. Концентрации в мкг / мл приведены для каждого изображения. (В) Гистограммы показывают зависимое от дозы эффект PTX, видеомагнитофоном, окса-, DOX, и 5-ФУ наплощадь и объем 7 суточных MCTSes следующие 4 дня лечения. MCTS периметры были значительно снижены следующие 0,25 мкг / мл PTX и 100 мкг / мл DOX и 5-ФУ. Концентрации лекарства, которые привели к полной к частичной дезинтеграции MCTSes значительно снижается MCTS прочность по сравнению с CTL. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение по меньшей мере из 5 MCTSes из 3-х независимых пластин. * р <0,001, # р <0,01, φ р <0,05 лекарственное лечение по сравнению с CTL, в одну сторону ANOVA с несколькими тест сравнения Даннетта. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Покрытие 384-TC Пластины с фильтрованной агарозном
Стандартной практикой в LOT является использование 1-1.5% низкой температурой плавления агарозы для покрытия пластин, что требует агарозы и / или дозирующее устройство Удержаться нагревают , чтобы предотвратить гелеобразование агарозы 6. Желирующий агарозы является потенциальной озабоченности при подготовке нескольких пластин с использованием жидких дозирующих кассеты с небольшими отверстиями насосно-компрессорных труб в диапазоне от 0,2 до 0,4 мм в диаметре. Для того, чтобы преодолеть потенциальную проблему засорения раздаточного кассеты, использовали 0,75% ФАС, так как она не требует дополнительного нагрева во время отпуска. Между прочим, было также отмечено, что 0,75% ФАС не гель, как быстро, как нефильтрованного 1-1.5% или даже 0,75%, раствор агарозы. Используя 0,75% ФАС, она занимает менее 35 с, чтобы покрыть всю 384-TC пластины без забивания раздаточного кассету. Кассета может быть очищен в конце наполнением это с нагретой водой, чтобы удалить остатки Agarose, которые могут засорить кончики, когда кассета не используется.
Экологическая Крышка и Ротари Инкубатор над регулярными закрывающей пластины и инкубаторе
Испарение индуцированный неравномерным потеря среды существенно влияет на воспроизводимость равномерного формирования MCTS и , следовательно , ставит под угрозу исход анализов 14. Удивительно, но группа 1 скважины 384-TC пластин под крышкой комбинации окружающей среды / роторный инкубаторе показали статистически значимое изменение О.Г. оптической плотности (рис 2C). Тем не менее, низкий CV Ога оптической плотности в группе 1 скважин указывает на то, что испарение во внешних лунки 384-луночного TC пластин в ротационном инкубаторе с экологическими крышками не настолько чрезмерным , так как влияет на рост MCTS (рис 2D). Это видно из одинакового размера MCTSes, образованных в 1 группе скважин в виде пластин с крышкой / роторного комбинации окружающей инкубатор. Кроме того, снижение потерьсреды предотвращает изменчивость хорошо к скважине в анализах лекарственного средства из 384-TC пластин , культивированных в ротационном инкубаторе с экологическими крышками 8.
Представленная методика также приводит к образованию однородных MCTSes из нескольких других раковых и нераковых клеточных линий 8. Однако, поскольку все клетки не могут по своей сути слипаются в MCTSes на неприлипающими поверхности, этот метод не может являться подходящим для других клеточных линий, которые не были протестированы для воспроизводимости равномерного формирования MCTS. Кроме того, акцент был сделан в основном на использовании продвинутой технологии-инкубатора в сочетании с испарением снижающих парламентариями и крышек пластин для повышения воспроизводимости образования MCTS. Другим дешевым и простым решением для повышения воспроизводимости образования MCTS может быть использование эмбриона класса минерального масла и воздухопроницаемой уплотнительные ленты или мембраны, которые предотвращают испарение , но позволяют обеспечить обмен нормальный газ 15. Хотя агарозном добавляет дополнительную толщину пластины днища, которые могут быть препятствием для высокого содержания изображения, глубина поля, создаваемого агарозном дна в проходящем свете изображения не препятствует выяснении размера и формы MCTS после медикаментозного лечения. Таким образом, данный способ будет представлять потенциальный интерес для исследователей проблем, стоящих перед воспроизводимости в Удел MCTS культуры.
Полуавтоматическая анализ изображений Рутинное
Хотя существует много полуавтоматическое / автоматизированное программное обеспечение , доступное для анализа изображений MCTS, измерение размеров полного к частично разрушенными MCTSes после медикаментозного лечения склонна к ошибкам 16, 17. На первом этапе , представленном рутина, самым сфокусированное изображение автоматически выбирается из множества г -stack изображений путем вычисления нормы градиента изображения и выбирая один с наибольшим 0.999 кваNTILE. Это надежный и шум нечувствительные мера максимума.
Далее, более темные границы обрезаются и обработанные изображения сохраняются в оригинальном разрешении в формате Portable Network Graphics. Этот процесс уменьшает общий размер от 2,5 ГБ, от формирования изображения всего 384-луночного, TC-обработанной пластины, приблизительно 100 МБ. Впоследствии центр MCTS найден через свертку с круговым фильтром заданного пользователем радиуса (мы используем 20 пикселей; Рисунок 4A). Четкое локальный минимум отфильтрованного изображения обеспечивает положение центра (фиг.4А). Переход от этого центра в виде концентрических колец, медиана полутоновое значение, М, в каждой оболочке вычисляется как функция от радиуса оболочки, Р. После этого, первый (существенный) максимум численного производной функции М (К) найдено (4В). Точка М OPT этого максимума берется в качестве оптимального порогового значения, и изображение сegmented по пороговым на этом уровне.
MCTS идентифицируется как самый большой центральный сегмент изображения. Эта процедура , как правило , работает лучше , чем стандартная методика выбора порога , поскольку он способен отделить ядро MCTS от распадающихся частей , которые часто возникают в результате лекарственной терапии (рис 4C и 4D). Кроме того, подход , принятый здесь делает неявное использование сферичности MCTS. Простые процедуры, определение порога или алгоритмы , основанные на активных контуров, не эксплуатируют априорного знания о том , что сферический объект должен быть найден. Когда MCTS явно обнаруживается и разграничены, максимальная M OPT ясна и одиночный. Затем процедура измеряет характеристики MCTS, такие как области, большой и малой осей, периметр, и монолитности подогнанной эллипса, и сохраняет предварительный просмотр сегментированного изображения. Если максимум не ясно, и / или если несколько локальных максимумов присутствуют, предварительновид предлагаемой сегментации сохраняется в папку коррекции.
На предпоследнем этапе, процедура поможет пользователю папку коррекции вручную настроить предложенную сегментацию путем перемещения порога вверх или вниз и выбора многоугольной области, представляющей интерес, чтобы отрезать возможные лишние части маски. После этого ручной коррекции, процедура измеряет и сохраняет характеристики MCTS, как описано выше.
Рисунок 4: Иллюстрация процедуры сегментации изображения. (A) Центр MCTS отмечен зеленой звездочкой. Примером кольцевое пространство втягивается в красном цвете. (В) Среднее значение серой шкалы в каждой оболочки на графике как функцию от радиуса оболочки (синяя линия). Численный производная этой кривой вычисляется (красная линия). Первый существенный маximum числовой производной найден (черная звездочка). (C) Полученная правильная сегментация изображения в ядро MCTS и фон с распадающихся частей MCTS. (D) Некорректное сегментации , полученный по методу Оцу в. Цель 4X; Шкала бар = 500 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от чешского Министерства образования, молодежи и спорта (LO1304) и Технологического Агентства Чешской Республики (TE01020028). Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Lakshman Варанаси для съемки неподвижных изображений с окружающей средой крышками.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
- Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
- Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).
- Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
- Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
- Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
- Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).
- Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
- Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
- Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
- Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103 (2016).
- Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
- Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).
