Valutazione della vitalità neuronale utilizzando la fluoresceina diacetato-propidium ioduro a doppia colorazione nel granulo cerebrale Neuron Culture

Lin Jiajia; Mak Shinghung; Zheng Jiacheng; Wang Jialing; Xu Dilin; Hu Shengquan; Zhang Zaijun; Wang Qinwen; Han Yifan; Cui Wei

doi:10.3791/55442

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Articolo metodologico

Valutazione della vitalità neuronale utilizzando la fluoresceina diacetato-propidium ioduro a doppia colorazione nel granulo cerebrale Neuron Culture

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DOI:

10.3791/55442

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10 maggio 2017

Lin Jiajia^*¹ , Mak Shinghung^*² , Zheng Jiacheng¹ , Wang Jialing¹ , Xu Dilin¹ , Hu Shengquan² , Zhang Zaijun³ , Wang Qinwen¹ , Han Yifan²^,⁴ , Cui Wei¹^,²

¹Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, ²Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, ³Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, ⁴International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive come misurare con precisione la vitalità neuronale utilizzando la doppia colorazione di Fluorescein diacetato (FDA) e Propidium Iodide (PI) nei neuroni granulari cerebellari coltivati, una coltura neuronale primaria utilizzata come modello in vitro nella ricerca neuroscienza e neurofarmacologia.

Abstract

I neuroni granulari cerebrali coltivati primari (CGNs) sono stati ampiamente usati come un modello in vitro nella ricerca neuroscienze e neurofarmacologica. Tuttavia, la coesistenza di cellule gliali e neuroni nella cultura CGN potrebbe portare a pregiudizi nella valutazione accurata della vitalità neuronale. La misurazione della resistenza cellulare è stata utilizzata con la doppia acetato di fluoresceina (FDA) e Propidium Iodide (PI), valutando simultaneamente le cellule vitali e morte. Abbiamo utilizzato FDA-PI duplice macchia per migliorare le sensibilità dei test colorimetrici e per valutare la vitalità neuronale nei CGNs. Inoltre, abbiamo aggiunto macchie di DNA fluorescenti blu ( ad esempio, Hoechst) per migliorare l'accuratezza. Questo protocollo descrive come migliorare l'accuratezza della valutazione della vitalità neuronale utilizzando questi metodi nella cultura CGN. Utilizzando questo protocollo, il numero di cellule gliali può essere escluso utilizzando la microscopia a fluorescenza. Una strategia analoga può essere applicata per distinguere gli indesideratiAl cellule da neuroni in varie colture cellulari miste, come la coltura corticale primaria e la coltura ippocampale.

Introduzione

I test di citotossicità colorimetrica, come il saggio di bromuro di 3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2-H-tetrazolium bromuro (MTT), sono comunemente usati per misurare la vitalità cellulare in vitro . I neuroni granulari cerebrali coltivati primari (CGNs) dai ratti sono sensibili a varie neurotossine, tra cui l'ione 1-metil-4-fenilpiridina, il perossido di idrogeno e il glutammato ^1,2 . Pertanto, le culture CGN possono essere utilizzate come un modello in vitro nel campo della neuroscienza. Le colture CGN possono contenere una varietà di cellule, compresi i neuroni e le cellule gliali, che possono rappresentare....