Summary
Hier introduceren we een nieuwe techniek die is ontworpen om elektroencefalografie (EEG) op te nemen bij vrij bewegende neonatale epileptische pups en omschrijft haar procedures, eigenschappen en toepassingen. Met deze methode kan men gedurende meer dan 1 week EEG opnemen.
Abstract
EEG is een nuttige methode om elektrische activiteit in de hersenen te detecteren. Bovendien is het een veelgebruikte diagnostische tool voor diverse neurologische aandoeningen, zoals epilepsie en neurodegeneratieve stoornissen. Het is echter technisch moeilijk om EEG-opnames bij neonaten te verkrijgen, omdat het speciale behandeling en zorg nodig heeft. Hier presenteren we een nieuwe methode om EEG in neonatale ratpups (P8-P15) op te nemen. We hebben een eenvoudige en betrouwbare elektrode ontworpen met behulp van computer pin loci; Het kan gemakkelijk geïmplanteerd worden in de schedel van een ratpop om EEG-signalen van hoge kwaliteit in de normale en epileptische hersenen op te nemen. Pups kregen een intraperitoneale (ip) injectie van het neurotoxine kaininezuur (KA) om epileptische aanvallen te veroorzaken. De chirurgische implantatie die in deze procedure wordt uitgevoerd, is minder duur dan andere EEG-procedures voor neonaten. Met deze methode kunt u meer dan 1 week hoge kwaliteit en stabiele EEG signalen opnemen. Bovendien kan deze procedure ook op volwassen ra worden toegepastTs en muizen om epilepsie of andere neurologische stoornissen te bestuderen.
Introduction
Het is goed vastgesteld dat doorlopende communicatie tussen neuronen nodig is om normale hersenfunctie te verkrijgen. De interneuronale communicatie vindt voornamelijk plaats op synaptes, waar informatie van een neuron wordt overgebracht naar een tweede neuron. Deze synaptische transmissie wordt gemedieerd door twee soorten toegewijde structurele regelingen: elektrische of chemische synapses 1 . Elektrofysiologie is het veld dat het elektrische potentieel oplevert tijdens interneuronale communicatie die de algemene lichaamsfuncties en gedrag beheerst 2 . EEG is de meest gebruikte methode onder veel elektrofysiologische technieken.
EEG is een techniek die wordt gebruikt voor het detecteren van veranderingen in elektrische signalen geproduceerd door interne of externe stimuli. Bovendien is het een essentiële test voor klinische diagnose en uitkomst voorspelling van verschillende neurologische aandoeningen zoals epilepsie, ziekte van Parkinson en AlzheimerE, evenals effecten van farmacologische en toxicologische middelen 3 . Over het algemeen toont een epileptische patiënt hyperexcitabiliteit en een verminderde functionele connectiviteit binnen de hersenen; Deze worden samengevat als interictale epileptiforme ontladingen (IED's) en kunnen door EEG in de vorm van scherpe, transiente spikes worden opgenomen; Scherpe golven; Spike-wave complexen; Of polyspikes 4 . Het belangrijkste kenmerk van de epileptische hersenen is het spontane voorkomen van epileptische aanvallen, die zowel uit de hoofdhuid of van het hersenparenchym kunnen worden opgenomen om de hersenzone die verantwoordelijk is voor de aanvallen 5 te lokaliseren. Bovendien heeft EEG ook zeer belangrijke implicaties in neurodegeneratieve stoornissen zoals de ziekte van Alzheimer (AD). Onderzoek suggereert dat gewijzigde EEG opnames en verslechterde oscillatoire netwerken bij AD patiënten gebruikelijk zijn. Echter, onze kennis over de pathofysiologie van netwerkoscillaties in neurodegeneratieve ziekten iIs verrassend onvolledig en moet verder worden onderzocht 6 .
In dit protocol hebben we een eenvoudige elektrode ontworpen waarmee men EEG kan registreren om de elektrische communicatie te begrijpen in zowel de normale als de pathologische hersenen. De chirurgische implantatie in deze methode is goedkoper dan andere beschikbare procedures 7 . Bovendien kan deze methode gebruikt worden om hoge kwaliteit en stabiele EEG signalen op te nemen voor langere tijdsrammen ( dwz 2-4 uur elke dag gedurende 1 week). Daarnaast hebben we lichterelektroden gebruikt (weeg ongeveer 26 mg) waardoor de dieren zich meer natuurlijk kunnen gedragen 8 . Deze methode is wijd van toepassing op de studie van EEG bij neonatale ratpups die de versterker en digitizer nodig hebben, die vaak in het elektrofysiologielaboratorium wordt gebruikt en geen extra apparaten nodig heeft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierzorg, chirurgische procedure en registratieprocedures waren in overeenstemming met de richtlijnen voor het dierenwelzijns- en gebruikscommissie van de Zuid-Chinese Normal University.
1. Elektrode Bereiding (Figuur 1A-C)
OPMERKING: Computer pin loci is simpelweg een prikkeld contact als onderdeel van de signaalinterface in communicatieapparaten. Het bestaat uit een mannelijke connector die in de vrouwelijke connector steekt.
- Zorg de mannelijke en vrouwelijke pennen voorzichtig uit de computerpinlocatie ( Figuur 1A ) met behulp van een pincer. Sluit de mannelijke en vrouwelijke spelden samen om een elektrode te vormen en cyanoacrylaat toe te passen om een sterke kleefband te creëren ( Figuur 1C ).
- Zet de elektroden in een beker gevuld met gedestilleerd water en plaats het voor ultrasone reiniger gedurende 10 minuten. Breng ze 30 minuten bij 45 ° C naar een droogoven. Steriliseer de elektroden met UV-licht gedurende 30 minuten.
2. Chirurgische procedure (Figuur 1D-F)
- Bereid de gesteriliseerde chirurgische instrumenten en stereotaxische apparaten voor. Verdoof de neonatale ratpop met isofluraananesthesie (2,5%) met lucht. Wanneer de pup diep verdoofd is, pas de dosis isofluraan aan op 1,0%. Voer een staart- of teenknijp voor de operatie om de juiste diepte van de verdoving te waarborgen.
- Bevestig het hoofd van de pup in het stereotaxische apparaat door de oorstaven in de oorkanalen te plaatsen en hen een beetje te verstevigen.
OPMERKING: Draai de oorstaven niet te sterk, omdat de neonatale schedel zeer zacht is. - Behoud het steriele chirurgische veld door alle apparatuur met 70% ethanol te spuiten. Maak een 15 mm incisie op het hoofd met een scalpel. Trek de hoofdhuid uit de middelste lijn bij de vier hoeken voorzichtig met behulp van tang. Zet wat zoutoplossend katoen onder de huid om de incisie wijd open te houden ( Figuur 1D ).
- Zoek de bregma en lambda punten op de schedelEn markeer ze met een potlood. Gebruik een spuitnaald (26 G) om twee burrgaten in de prefrontale cortex (PFC) en hippocampus te maken.
OPMERKING: De PFC bevindt zich op +1,8 mm achterkant bregma en -0,5 mm lateraal naar de middellijn, terwijl de hippocampus zich bevindt op -2,0 mm voorkant van bregma en ± 0,5 mm lateraal naar de middellijn ( Figuur 1D en E ). De diepte van de elektrode mag niet meer dan 2 mm onder het corticale oppervlak zijn om de hersenschade te minimaliseren. - Gebruik pincet om de elektroden vast te houden en de referentie- en opnamelektroden in respectievelijk de PFC en hippocampus in te voegen. Breng erythromycine zalf om de elektrode om eventuele infecties te vermijden. Bevestig de elektrode met behulp van cyanoacrylaat.
- Bereid tandheelkundige acrylcement op, zodat het lijmachtig en viskeuze consistentie heeft. Breng de tandheelkundige cement aan om de elektroden en de rest van de schedel te bedekken.
OPMERKING: Droog de schedel grondig voordat u het tandcement toepast. Breng 5% picriczuur op de elektroden aan om ze te beschermen.
OPMERKING: De gehele procedure moet in een biosafety-kap worden uitgevoerd om steriele omstandigheden te behouden. - Verwijder het dier uit het stereotaxische frame en injecteer 300 μL 10% glucose subcutaan. Plaats het op een verwarmde deken voor herstel. Zorg ervoor dat het dier warm is (37 ° C) en ambulant ( dwz volledig hersteld). Buprenorfine intraperitoneaal (0,05 mg / kg) voor post-chirurgische pijn toedienen.
OPMERKING: Laat een dier onbewaakt achter totdat het voldoende bewustzijn heeft teruggevonden (dwz normaal gedrag en beweging). - Zet de pup terug naar zijn huiskooi met hun dam nadat het het bewustzijn heeft hersteld. Wacht twee dagen totdat het dier volledig is hersteld.
3. EEG opname
- Na volledige herstel, verbind de elektroden die op de schedel van de pup geïmplanteerd zijn naar de versterker in zijn eigen kooi. Sluit de versterker aan op een analoge naar digitale cOmvormer en koppel de converter aan op een computer; De verbindingsleidingen moeten zorgvuldig behandeld worden zodat ze niet verstrikt raken.
- Selecteer minstens 10.000 Hz bemonsteringssnelheid op de data-acquisitie-eenheid voor opname (de bandbreedte van de zender is 1-100 Hz). Zorg ervoor dat de gegevens goed worden bemonsterd.
- Na de opname van de baseline, injecteer de pup intraperitoneaal met kaininezuur (KA) (2 mg / kg) om epileptische aanvallen te veroorzaken. 15 minuten na de KA injectie de epileptische ontladingen observeren en opnemen. Afzettingsproducten via KA zijn meestal fysiek.
OPMERKING: De ictal-tonic duur is ongeveer 15,2 ± 0,9 s, de aanval duur is ongeveer 62 ± 5 s. Sporen kunnen voorkomen worden in de neonatale rat door IP-injectie van chloralhydraat (400 mg / kg) te geven. - Sla de gedigitaliseerde gegevens op en analyseer deze met behulp van software voor signaalverwerkende software, zoals spike2. Open het vermogen van verschillende frequentie componenten in het neonatale EEG signaal door middel van perfHet analyseren van een power spectrum analyse. Bereken de kracht in een 1-min tijdframe door de wortel-gemiddelde-vierkante amplitude van 1 tot 100 Hz (EEG-band) 9 te vinden .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als de bovenstaande chirurgische procedures goed worden uitgevoerd, wordt een opname met een neonatale pup op een kanaal met succes uitgevoerd. 10 minuten na de KA-injectie ontstond er een regelmatig patroon van gedragstekenen in de vorm van onregelmatige bewegingen en krassen, tremors en verlies van balans. Figuur 2 toont de representatieve ruwe EEG sporen en interictale, ictal tonic en ictal-clonic geëxpandeerde sporen. Recidive interictale en ictal EEG ontlading patronen begonnen 15-60 minuten (30 ± 5,2 min, gemiddelde ± SEM) na KA injectie ( Figuur 2A en 2B ). Figuur 2D en 2E vertegenwoordigen de tonic-clonische aanvallen die het meest voorkomende type zijn. De ictal-tonic duur duurde 15,2 ± 0,9 s ( Figuur 2D ). De representatieve resultaten toonden aan dat tonische lozingen werden gevolgd door klonische uitbarstingen ( Figuur 2B, 2D en 2E ).
E_content "voor: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 1: Illustratie van protocol voor chirurgisch implantatie. ( A ) kleine computerpennen. ( B ) Vrouwelijke pen (links) en mannelijke pen (rechts). De schaalbalk wordt gebruikt om de lengte van de vrouwelijke pen te meten. ( C ) Connected vrouwelijke en mannelijke pin. ( D ) Exposed schedel. Nr. 1 presenteert de referentieplaats, nr. 2 presenteert Bregma, nr. 3 en 4 aanwezige opnameplaatsen, en nr. 5 presenteert Lambda. ( E ) elektrode implantatie. Nr. 1 geeft de referentieelektrode aan, Nr. 3 en 4 presenteren de opnamelektrode. ( F ) Herstelde rattenpop (P9). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
D / 55489 / 55489fig2.jpg "/>
Figuur 2: KA-geïnduceerde neonatale afzetting. ( A ) Een representatief EEG-trace van een P10-rat die werd geïnjecteerd met KA (2 mg / kg, ip) vertoonde terugkerende epileptische uitbarstingen. ( B ) Uitgebreide weergave van enkele clusterachtige epileptische ontlading uit de doos in A. ( C , D en E ). Typische interictale, ictal-tonic en ictal-clonic sporen werden uit de doos in B. uitgevouwen. De gemiddelde EEG vermogen (1 min tijd venster) voor en na de KA injectie (gemiddelde ± SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Opname van de EEG-opname. Representatieve sporenopname is shoWn in vrij bewegende neonatale rat pup. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier rapporteren we chirurgische en opname procedures om EEG in vrij bewegende neonatale ratpups te verkrijgen via een bedrade methode ( Figuur 3 ). Het is aangetoond dat de P7-P12 rat pup is in de ontwikkelingsleeftijd die overeenkomt met een full-term menselijk neonaat 10 , 11 . Het is technisch moeilijk om EEG-opnamegegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen bij het werken met ratpups in deze leeftijdsgroep. Daarnaast is het speciaal behandeld en zorgvuldig vereist 8 .
Vorige onderzoeken die in vivo EEG-opnames in neonatale ratten hebben onderzocht, zijn uitgevoerd met behulp van bedrade opname oplossingen bij P12 of oudere dieren 12 , maar deze benaderingen zijn zeer duur. Door op eenvoudige elektroden te vertrouwen, hebben we een elektrode kunnen maken ( Figuur 1 ) die de kosten van het experiment tot zo laag als $ 1 verlaagt, terwijl het nog steeds een hoge dichtheid EEG geeftopnames. Chirurgische implantatie in deze methode kan zo 10 minuten duren, afhankelijk van de complexiteit van de operatie.
De kritische stappen in dit protocol zijn de implantatie van elektroden. Het moet goed gedaan worden. Om het constante contact van de elektrode met de schedel te behouden, zijn de volgende stappen belangrijk te overwegen. Ten eerste, verwijder het weefselafval op de schedel met behulp van gesteriliseerde katoenen zwabber, omdat het de elektrode van de schedel kan scheiden. Ten tweede, gebruik cyanoacrylaat goed om de elektrode vast te leggen met de schedel. Ten derde, behoud de adequate viscositeit van tandcement. Het is beter om tandheelkundige cement in twee lagen aan te brengen; De eerste laag moet een beetje dicht zijn om de schedel te bedekken, terwijl de tweede laag een beetje lopend moet zijn om de hoeken van de eerste laag te bedekken. Tap het dentale cement voorzichtig met een pipetpunt om het te lossen om de sterke kleefband te maken. Als het te waterig is, kan het een isolerende laag onder de electr bouwenOde, en als het te dicht is, zal het tandcement gemakkelijk van de schedel afvallen vanwege het eigen gewicht. Het is ook belangrijk om de lichaamstemperatuur van de pup bij 37 ° C gedurende de operatie voor overleving te handhaven.
De toepassing van deze procedure is beperkt tot de opname van EEG bij neonatale ratpups tussen de leeftijd van P8 en P15 omdat de groeiende pups het dentale cement en de elektrode van hun schedel kunnen verwijderen. In termen van verdere toepassingen kan deze methode ook gebruikt worden om de elektrische activiteit van volwassen ratten en muizen na kleine wijziging op te nemen. Bovendien leent deze methode zich goed om in verschillende gedrags experimenten te gebruiken, zoals het verhoogde plus labyrint.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Natuurwetenschappelijke Stichting van China (31171355) en de Stichting Natuurwetenschappen van Guangdong (S2011010003403, 2014A030313440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
- Pereda, A. E. Electrical synapses and their functional interactions with chemical synapses. Nat Rev Neurosci. 15 (4), 250-263 (2014).
- Chorev, E., Epsztein, J., Houweling, A. R., Lee, A. K., Brecht, M. Electrophysiological recordings from behaving animals--going beyond spikes. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 513-519 (2009).
- Freeborn, D. L., McDaniel, K. L., Moser, V. C., Herr, D. W. Use of electroencephalography (EEG) to assess CNS changes produced by pesticides with different modes of action: effects of permethrin, deltamethrin, fipronil, imidacloprid, carbaryl, and triadimefon. Toxicol Appl Pharmacol. 282 (2), 184-194 (2015).
- Werhahn, K. J., Hartl, E., Hamann, K., Breimhorst, M., Noachtar, S. Latency of interictal epileptiform discharges in long-term EEG recordings in epilepsy patients. Seizure. 29, 20-25 (2015).
- Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A.
- Nimmrich, V., Draguhn, A., Axmacher, N. Neuronal Network Oscillations in Neurodegenerative Diseases. Neuromolecular Med. 17 (3), 270-284 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System. J Vis Exp. (101), e52554 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Fisher, J. H., Ekstrand, J. J., Dudek, F. E. Recording EEG in immature rats with a novel miniature telemetry system. J Neurophysiol. 109 (3), 900-911 (2013).
- Dzhala, V. I., et al. NKCC1 transporter facilitates seizures in the developing brain. Nat Med. 11 (11), 1205-1213 (2005).
- Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr Res. 65 (1), 62-66 (2009).
- Savard, A., et al. Involvement of neuronal IL-1beta in acquired brain lesions in a rat model of neonatal encephalopathy. J Neuroinflammation. 10, 110 (2013).
- Cuaycong, M., et al. A novel approach to the study of hypoxia-ischemia-induced clinical and subclinical seizures in the neonatal rat. Dev Neurosci. 33 (3-4), 241-250 (2011).
