Summary
Aqui, nós introduzimos uma técnica nova projetada registrar o electroencephalography (EEG) em filhotes epileptic neonatal movendo-se livremente e descrever seus procedimentos, caraterísticas, e aplicações. Este método permite gravar EEG por mais de uma semana.
Abstract
O EEG é um método útil para detectar a atividade elétrica no cérebro. Além disso, é uma ferramenta de diagnóstico amplamente utilizada para várias condições neurológicas, tais como epilepsia e distúrbios neurodegenerativos. No entanto, é tecnicamente difícil obter gravações EEG em recém-nascidos, uma vez que requer manuseio especializado e grande cuidado. Aqui, apresentamos um novo método para gravar EEG em filhotes de ratos neonatais (P8-P15). Nós projetamos um eletrodo simples e confiável usando loci de pinos de computador; Ele pode ser facilmente implantado no crânio de um filhote de rato para gravar sinais de EEG de alta qualidade no cérebro normal e epiléptico. Os filhotes receberam uma injecção intraperitoneal (ip) da neurotoxina ácido cainico (KA) para induzir convulsões epilépticas. A implantação cirúrgica realizada neste procedimento é menos dispendiosa do que outros procedimentos EEG para neonatos. Este método permite gravar sinais EEG de alta qualidade e estáveis por mais de uma semana. Além disso, este procedimento também pode ser aplicado a adultos raSt e ratinhos para estudar a epilepsia ou outros distúrbios neurológicos.
Introduction
Está bem estabelecido que a comunicação contínua entre os neurónios é necessária para obter a função normal do cérebro. A comunicação interneuronal ocorre principalmente nas sinapses, onde a informação de um neurônio é transportada para um segundo neurônio. Esta transmissão sináptica é mediada por dois tipos de arranjos estruturais dedicados: sinapses elétricas ou químicas 1 . A eletrofisiologia é o campo que capta o potencial elétrico produzido durante a comunicação interneuronal que controla as funções e comportamento do corpo 2 . O EEG é o método mais comumente usado entre muitas técnicas eletrofisiológicas.
O EEG é uma técnica utilizada para detectar alterações nos sinais elétricos produzidos por estímulos internos ou externos. Além disso, é um teste essencial para o diagnóstico clínico e previsão de resultados de várias condições neurológicas, tais como epilepsia, Parkinson e doença de AlzheimerE, bem como os efeitos de agentes farmacológicos e toxicológicos 3 . Geralmente, um paciente epiléptico apresenta hiperexcitabilidade e comprometimento da conectividade funcional dentro do cérebro; Estes são resumidos como descargas epilépticas interictais (IEDs) e podem ser registados pelo EEG sob a forma de picos agudos e transitórios; Ondas afiadas; Complexos pico-onda; Ou polyspikes 4 . A principal característica do cérebro epilético é a ocorrência espontânea de convulsões epilépticas, que podem ser registradas tanto no couro cabeludo como no parênquima cerebral, a fim de localizar a área cerebral responsável pelas convulsões 5 . Além disso, EEG também tem implicações muito importantes em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer (DA). Pesquisas sugerem que os registros alterados de EEG e redes oscilatórias comprometidas em pacientes com DA são comuns. No entanto, nosso conhecimento sobre a fisiopatologia das oscilações de rede em doenças neurodegenerativas iÉ surpreendentemente incompleta e precisa ser mais explorada 6 .
Neste protocolo, nós projetamos um eletrodo simples com o qual se pode gravar o EEG para entender a comunicação elétrica tanto no cérebro normal quanto no patológico. A implantação cirúrgica neste método é mais barata do que outros procedimentos disponíveis 7 . Além disso, este método pode ser usado para gravar sinais de EEG de alta qualidade e estáveis para prazos mais longos ( isto é, 2-4 h todos os dias durante 1 semana). Além disso, usamos eletrodos mais leves (pesando aproximadamente 26 mg) que permitem aos animais se comportar mais naturalmente 8 . Este método é amplamente aplicável ao estudo de EEG em filhotes de ratos neonatais que requer o amplificador e digitalizador, comumente usado em laboratório de eletrofisiologia e não requer nenhum dispositivo adicional.
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Protocol
Cuidados com animais, procedimento cirúrgico e procedimentos de registro estavam de acordo com as diretrizes para o Comitê de Uso e Cuidados com Animais da Universidade Normal da China do Sul.
1. Preparação do Eléctrodo (Figura 1A-C)
NOTA: O loci do pino do computador é simplesmente um contato em forma de pino como parte da interface de sinal em dispositivos de comunicação. Consiste em um conector macho que se conecta ao conector fêmea.
- Cuidadosamente separar os pinos macho e fêmea do computador loci pino ( Figura 1A ) com a ajuda de uma pinça. Conecte os pinos macho e fêmea juntos para formar um eletrodo e aplicar cianoacrilato para criar uma ligação adesiva forte ( Figura 1C ).
- Coloque os eletrodos em um copo cheio de água destilada para e coloque-o para o limpador ultra-sônico por 10 min. Mude-os para um forno de secagem a 45 ° C durante 30 min. Esterilizar os eletrodos usando luz UV por 30 min.
2. Procedimento cirúrgico (Figura 1D-F)
- Preparar os instrumentos cirúrgicos esterilizados e aparelhos estereotáxicos. Anestesiar o filhote de rato neonatal usando anestesia com isoflurano (2,5%) com ar. Quando o filhote é profundamente anestesiado, ajustar a dose de isoflurano para 1,0%. Executar uma pinça de cauda ou dedo do pé antes da cirurgia para garantir a profundidade adequada de anestesia.
- Fixar a cabeça do filhote no aparelho estereotáxico, colocando as orelhas nos canais auditivos e ligeiramente apertando-os.
NOTA: Não aperte excessivamente as orelhas, pois o crânio neonatal é muito macio. - Manter o campo cirúrgico estéril por pulverização de todos os equipamentos com etanol a 70%. Faça uma incisão de 15 mm na cabeça usando um bisturi. Usando fórceps, puxe suavemente o couro cabeludo longe da linha média nos quatro cantos. Coloque um pouco de algodão embebido em solução salina abaixo da pele para manter a incisão bem aberta ( Figura 1D ).
- Encontre os pontos bregma e lambda no crânioE marcá-los com um lápis. Use uma agulha de seringa (26 G) para fazer dois buracos no córtex pré-frontal (PFC) e no hipocampo.
OBSERVAÇÃO: O PFC está localizado a +1,8 mm posterior ao bregma e -0,5 mm lateral à linha média, enquanto o hipocampo está localizado a -2,0 mm anterior ao bregma e ± 0,5 mm lateral à linha média ( Figura 1D e E ). A profundidade do eletrodo não deve ser mais de 2 mm abaixo da superfície cortical para minimizar os danos cerebrais. - Use pinças para segurar os eletrodos e insira os eletrodos de referência e gravação no PFC e no hipocampo, respectivamente. Aplique pomada de eritromicina ao redor do eletrodo para evitar qualquer possível infecção. Fixar o eletrodo utilizando cianoacrilato.
- Prepare o cimento acrílico dental de modo que tenha uma consistência gluey e viscous. Aplique o cimento dental para cobrir os eletrodos eo resto do crânio.
NOTA: Secar completamente o crânio antes de aplicar o cimento dental. Aplique 5% de ácido pícrico nos eletrodos para protegê-los.
NOTA: Todo o procedimento deve ser feito em um cofre de biossegurança para manter condições estéreis. - Remover o animal do quadro estereotáxico e injectar 300 μL de glucose a 10% por via subcutânea. Coloque-o sobre um cobertor aquecido para recuperação. Certifique-se que o animal é quente (37 ° C) e ambulatorial ( ou seja, completamente recuperado). Administrar buprenorfina intraperitonealmente (0,05 mg / kg) para dor pós-cirúrgica.
NOTA: Não deixe um animal sozinho até que ele tenha recuperado consciência suficiente (ou seja, comportamento normal e movimento). - Retornar o filhote para sua gaiola casa com a sua barragem depois que ele recupera a consciência. Aguarde dois dias até que o animal esteja totalmente recuperado.
3. Gravação EEG
- Após a recuperação completa, conecte os eletrodos implantados no crânio do filhote de cachorro ao amplificador em sua própria gaiola. Ligue o amplificador a um cabo analógico-digitalOnverter e conecte o conversor a um computador; As linhas de ligação devem ser tratadas cuidadosamente de modo a não ficar enredadas.
- Selecione pelo menos 10.000 Hz taxa de amostragem na unidade de aquisição de dados para gravação (a largura de banda do transmissor é 1-100 Hz). Certifique-se de que os dados são amostrados corretamente.
- Depois de obter o registo da linha de base, injectar o filhote intraperitonealmente com ácido cainico (KA) (2 mg / kg) para induzir convulsões epilépticas. 15 min após a injecção de KA observar e registar as descargas epilépticas. Os produtos da apreensão através de KA são geralmente físicos.
NOTA: A duração ictal-tónica é de cerca de 15,2 ± 0,9 s, a duração da crise é de cerca de 62 ± 5 s. As convulsões podem ser prevenidas no rato neonatal, dando uma injecção IP de hidrato de cloral (400 mg / kg). - Salve os dados digitalizados e analise-os usando pacotes de software de processamento de sinal, como spike2. Revelar o nível de potência de diferentes componentes de freqüência no sinal EEG neonatalOrming uma análise de espectro de potência. Calcule a potência em um período de tempo de 1 min, encontrando a amplitude de quadrado médio-raiz de 1 a 100 Hz (banda de EEG) 9 .
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Representative Results
Se os procedimentos cirúrgicos acima forem conduzidos adequadamente, será realizada com êxito um registo de EEG de um rato de rato neonatal de rato. 10 min após a injeção de KA, um padrão regular de sinais comportamentais surgiu na forma de movimentos irregulares e arranhões, tremores e perda de equilíbrio. A Figura 2 mostra os vestígios brutos representativos de EEG e traços expandidos interictal, ictal-tónico e ictal-clónico. Os padrões interictais e ictais de descarga reticente do EEG começaram 15-60 min (30 ± 5,2 min, média ± SEM) após a injeção de KA ( Figura 2A e 2B ). A Figura 2D e 2E representa as convulsões tónico-clónicas que são o tipo mais comum. A duração ictal-tônica durou 15,2 ± 0,9 s ( Figura 2D ). Os resultados representativos mostraram que as descargas tónicas foram seguidas por explosões clónicas ( Figura 2B, 2D e 2 E ).
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Figura 1: Ilustração do Protocolo de Implantação Cirúrgica. ( A ) Pinos minúsculos do computador. ( B ) Pino fêmea (esquerda) e pino macho (direita). A barra de escala é usada para medir o comprimento do pino fêmea. ( C ) Pino fêmea e macho conectado. ( D ) Crânio exposto. N ° 1 apresenta o local de referência, o N ° 2 apresenta Bregma, N ° 3 e 4 apresentam locais de registo, e N ° 5 apresenta Lambda. ( E ) Implantação do eletrodo. O nº 1 apresenta o eléctrodo de referência, os n.os 3 e 4 apresentam o eléctrodo de gravação. ( F ) Filhote de rato recuperado (P9). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2: Convulsão Neonatal induzida por KA. ( A ) Um traço EEG representativo de um rato P10 que foi injectado com KA (2 mg / kg, ip) mostrou descargas de ruptura epilépticas recorrentes. ( B ) Visão ampliada de descargas epilépticas de tipo cluster simples da caixa em A. ( C , D e E ) Traços típicos interictal, ictal-tônico e ictal-clônico expandidos da caixa em B. ( F ) Dados resumidos mostrando A potência média de EEG (janela de tempo de 1 min) antes e depois da injecção de KA (média ± SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Configuração de gravação EEG. A gravação representativa do traço é shoWn em cachorro de rato livremente em movimento neonatal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, relatamos procedimentos cirúrgicos e de registro para a aquisição de EEG em filhotes de ratos neonatais movidos livremente por um método com fio ( Figura 3 ). Tem sido sugerido que o filhote de rato P7-P12 está na idade de desenvolvimento que corresponde a um recém-nascido a termo a termo 10 , 11 . É tecnicamente difícil obter dados de gravação de EEG de alta qualidade quando se trabalha com filhotes de ratos nesta faixa etária. Além disso, requer um tratamento especializado e um grande cuidado 8 .
Estudos anteriores que examinam gravações de EEG in vivo em ratos neonatais foram conduzidos utilizando soluções de gravação com fios em P12 ou animais mais antigos 12 , mas estas abordagens são muito dispendiosas. Ao confiar em eletrodos simples, temos sido capazes de fazer um eletrodo ( Figura 1 ) que reduz o custo da experiência para tão pouco quanto $ 1 enquanto ainda dando alta densidade EEGGravações. A implantação cirúrgica neste método pode levar apenas 10 min, dependendo da complexidade da cirurgia.
Os passos críticos neste protocolo são a implantação de eletrodos. Deve ser feito com cuidado. Para manter o contato constante do eletrodo com o crânio, os seguintes passos são importantes a considerar. Em primeiro lugar, remova os detritos de tecido no crânio com a ajuda de cotonete de algodão esterilizado porque ele pode separar o eletrodo do crânio. Em segundo lugar, usar cianoacrilato adequadamente para anexar o eletrodo com o crânio. Em terceiro lugar, manter a viscosidade adequada do cimento dental. É melhor aplicar cimento dental em duas camadas; Primeira camada deve ser um pouco densa para cobrir o crânio, enquanto a segunda camada deve ser um pouco líquido para cobrir os cantos da primeira camada. Toque o cimento dental suavemente com uma ponta de pipeta para assentá-lo para baixo para fazer a ligação adesiva forte. Se for muito aguado, pode construir uma camada isoladora sob oOde, e se for demasiado densa, o cimento dental cai facilmente fora do crânio devido a seu próprio peso. Também é importante manter a temperatura corporal do filhote a 37 ° C durante a cirurgia para sobreviver.
A aplicação deste procedimento é limitado ao registro de EEG em filhotes de ratos neonatos entre as idades de P8 e P15 porque os filhotes em crescimento podem remover o cimento dental eo eletrodo de seu crânio. Em termos de outras aplica�es, este m�odo tamb� pode ser utilizado para registar a actividade el�trica de ratos adultos e ratinhos ap� modifica�o menor. Além disso, este método presta-se bem a utilização em várias experiências comportamentais, tais como o labirinto elevado elevado.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais da China (31171355) e pela Fundação de Ciências Naturais de Guangdong (S2011010003403, 2014A030313440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
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