Spettrometria di Massa e approcci Luminogenic a base di caratterizzare la fase I metabolica competenza di In Vitro colture cellulari

Sommario

Competenza metabolica dei sistemi in vitro è un requisito fondamentale per la biotrasformazione e la disposizione di farmaci e sostanze tossiche. In questo protocollo, si descrive l'applicazione di sonde metabolici riferimento per valutare fase del metabolismo in colture cellulari.

Abstract

enzimi che metabolizzano xenobiotici svolgono una funzione chiave nella biotrasformazione di farmaci e sostanze tossiche con l'aggiunta di gruppi funzionali che aumentano la solubilità e facilitano l'escrezione. In alcune occasioni quelle modifiche strutturali portano alla formazione di nuovi prodotti tossici. Al fine di ridurre la sperimentazione sugli animali, rischio chimico può essere valutata utilizzando cellule metabolicamente competenti. L'espressione degli enzimi metabolici, tuttavia, non è stabile nel tempo in molti sistemi di coltura primaria in vitro ed è spesso parziale o assente in linee cellulari. Pertanto, lo studio dei farmaci, additivi, e il metabolismo inquinanti ambientali in vitro dovrebbe idealmente essere condotta in sistemi cellulari in cui l'attività metabolica è stata caratterizzata. Spieghiamo qui un approccio per misurare l'attività di una classe di enzimi metabolici (Fase umana I) in linee cellulari 2D e 3D colture primarie utilizzando sonde chimici ed i loro prodotti metabolici quantificabili mediante spettrometria di massa e UPLCluminometria. Il metodo può essere implementato per testare l'attività metabolica in linee cellulari e cellule primarie derivate da una varietà di tessuti.

Introduzione

Metabolismo xenobiotico è il processo attraverso il quale le sostanze chimiche estranee all'organismo vengono modificati mediante l'aggiunta di gruppi idrofili e coniugati per facilitare il loro escrezione ^1. Tipicamente il metabolismo di xenobiotici è un processo in due fasi con la fase I che consiste principalmente di un'ossidazione con l'aggiunta di uno o più gruppi idrossilici ^{1, 2.} Nella fase II, i gruppi ossidrilici sono utilizzati come accettori per un coniugato idrofilo come glucuronide o un solfato porzione ^{1, 2.} Se un gruppo accettore è già presente sulle molecole, la fase di coniugazione può accadere indipendentemente metabolismo Fase I. Ogni reazione è eseguita da un gruppo specifico di enzimi, per esempio, CYP (citocromo P450), che catalizzano l'idrossilazione (figura 1) e dealchilazione di substrati chimici ^3. Conjugation è catalizzata da sulfotransferasi, UDP-glicuronosiltransferasi (Figura 1), glutatione-S-transferasi e N-acetiltransferasi ^4. Ogni tessuto e organo avranno uno specifico profilo di espressione dell'enzima metabolico, con il fegato esprimere più di queste proteine.

Figura 1: Esempio di fase I e II metabolismo fase per cumarina. CYP2A6 / CYP2A13 catalizzare l'7-idrossilazione di cumarina. 7-idrossicumarina è coniugato ad una porzione glucuronide dalla fase II enzimi UGT, con UGT1A6 e UGT1A9 mostra la più alta attività.

Comprensione del metabolismo degli xenobiotici è critico nella valutazione della sicurezza dei farmaci e per la valutazione del rischio chimico per due motivi: la cinetica di reazione determineranno quanto tempo un farmaco o chimiche rimarrà nel corpo in forma attiva o inattiva brima di escrezione; e il composto genitore può essere modificato per una specie più reattivo, instabile e tossico da enzimi metabolici. Tali reazioni note anche come "bioactivation" sono per lo più guidati da fase I CYP enzimi ma anche in occasioni rare per fase II coniugazione ^5.

Sulla base di questo, la capacità di un modello in vitro per prevedere con precisione i rischi associati a un farmaco o una sostanza chimica è fortemente dipendente dalla competenza metabolica del sistema di celle. Linee cellulari derivate da tessuti malati o dalla trasformazione di cellule normali spesso perdono parte se non tutto il profilo metabolico enzima rappresentative del loro tessuto di origine ^6. Il mantenimento del normale profilo metabolico enzima appare meglio in colture di cellule primarie (almeno nelle culture breve) ed è ulteriormente migliorata se il tessuto viene coltivato in una matrice permettendo così di mantenere la sua struttura 3D ^1. Pertanto, il characterization della competenza metabolica di un sistema cellulare in vitro è un passo preliminare importante nel guidare la decisione su quale modello cellulare è opportuno effettuare valutazioni di sicurezza chimici.

In questo articolo presentiamo un protocollo al profilo l'attività e l'espressione degli enzimi CYP Fase I in vitro con esempi della loro applicazione con una linea di cellule epatiche ⁷ e colture cellulari primarie polmone 3D ^8. substrati specifici CYP, loro prodotti metabolici e inibitore controlli sono descritti insieme spectrometry- massa e di quantificazione luminogenic-based. Poiché alcuni CYP sono inducibili e altri sono costitutive, esempi anche essere dati per questi due scenari.

Protocollo

NOTA: Il flusso generale per il saggio dell'attività metabolica è illustrato nella figura 2. Ogni passo del flusso di lavoro è successivamente dettagliato nei paragrafi successivi. Le tabelle dettagliate di reagenti e attrezzature sono riportati nella tabella dei materiali.

Figura 2: Flusso di lavoro per la Metabolic Probe Assay. Le cellule sono seminati e coltivati ​​a densità adeguata. Un passo di induzione CYP può essere necessaria in funzione dell'attività enzimatica saggiata. Il substrato sonda e inibitore viene aggiunto alla coltura cellulare. Dopo un periodo di incubazione, il mezzo viene raccolto per l'analisi e le cellule vengono lisate per la quantificazione della proteina. Il mezzo viene elaborato per l'analisi del prodotto metabolico del substrato sonda mediante spettrometria di massa o luminometria.annuncio / 55502 / 55502fig2large.jpg" target = '_ blank'> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Culture 1. cellule

Figura 3: trasmissione della luce Micrografia di una cellula epatica Culture Linea. La linea cellulare descritto in questo protocollo ⁵ tipicamente differenziare con una spaccatura 50% tra colangiociti ed epatociti in coltura (100x). bar scala = 100 pm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1. Epatica coltura linea cellulare
   NOTA: Una linea di cellule epatiche disponibile in commercio è stata usata come esempio di cellule metabolicamente competenti. La linea cellulare è stata derivata da un epatocarcinoma causata da infezione virale ⁷. Alla confluenza, questa linea cellulare differenzia in cellule cholangiocyte- ed epatociti-simile (figura 3) e ulteriori dettagli possono essere trovati in Guillouzo ^7. L'inclusione del 2% DMSO al mezzo di coltura supporta la differenziazione della linea cellulare e l'espressione di una varietà di CYP.
   1. Rimuovere le fiale criogeniche con cellule dal azoto liquido e posizionare in ghiaccio secco per il trasporto. Trasferire il esageratamente ad un bagno di acqua preriscaldata a 37 ° C per 1-2 minuti, e sterilizzare l'esterno del flacone con il 70% di etanolo prima di mettere in una cappa a flusso laminare.
   2. Pur lavorando in condizioni sterili, aprire con cautela la fiala criogenico per rilasciare eccesso di pressione e pipettare il contenuto della fiala criogenico in una provetta da 10 ml riempito con 9 mL di terreno E preriscaldata Williams' a 37 ° C.
   3. Centrifugare la soluzione per 10 min a 400 xg a temperatura ambiente, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml dimedia disgelo proprietaria pre-riscaldato a 37 ° C, integrato con glutammina o un supplemento di glutamina (2 mM concentrazione finale) (Williams' E + glutamina supplemento + supplementi disgelo).
   4. Contare le cellule vitali utilizzando un'aliquota di 500 microlitri con un contatore di cellule o qualsiasi altra idonea tecnica di conteggio delle cellule.
   5. Seme le cellule in un piatto di collagene rivestito da 24 pozzetti ad una densità di 0,6 x 10 ⁶ cellule vitali / pozzetto in un volume finale di 0,5 ml di mezzo di scongelamento.
   6. Posizionare la piastra (s) in un incubatore a 37 ° C con 5% / 95% di CO ₂ / aria e 100% di umidità relativa.
   7. 24 ore dopo la semina delle cellule, sostituire la media con 0,5 ml di mezzo di lavoro pre-riscaldato manutenzione / metabolismo (Williams' E + glutamina supplemento + supplemento metabolismo (questo mezzo contiene già DMSO)). Cambiare la media ogni due giorni.
   8. Dopo alcuni giorni di coltura le cellule formano una struttura trabecolare sub-confluenti (Figura 3). Metabolico ottimalel'attività è tipicamente osservata tra il giorno 7 e 10 ed è più basso al giorno 4.

Figura 4: Sezione trasversale di Alcian blu macchiato cellule delle vie aeree Cresciuto all'interfaccia aria-liquido ^8.
Ciliated, muco producendo e cellule basali sono chiaramente visibili. bar scala = 250 um.

2. Differenziate culture vie aeree epitelio
   NOTA: Il protocollo è mostrato con un completamente differenziata epitelio delle vie aeree primario disponibile commercialmente coltivate all'interfaccia aria-liquido su un inserto ⁸ (figura 4). La coltura di tessuti conserva un fenotipo mucocilliary e la polarità delle cellule ^8. Le celle possono essere di origine nasale o bronchiale. Qui, usare le cellule nasali umane. Le cellule sono forniti su un formato di piastra di coltura con 24inserisce all'interfaccia aria-liquido. Per facilitare il trasporto e evitare perdite medie gli inserti vengono spediti con la sezione basale incorporato in una matrice di agarosio mescolato con mezzo di coltura.
   1. Alla consegna delle cellule, sterilizzare le piastre contenenti 24 inserti con una soluzione di etanolo al 70% prima di mettere in una cappa a flusso laminare pulito.
   2. Preparare una piastra a 24 pozzetti sterili aggiungendo pre-riscaldato a 700 microlitri terreno di coltura proprietarie.
   3. Utilizzando una pinzetta sterile trasferire gli inserti cellulari per la nuova piastra pre-caricato con mezzo mediante sloggiare delicatamente l'inserto dalla matrice di agarosio.
   4. Posizionare la piastra (s) in un incubatore a 37 ° C con 5% / 95% di CO ₂ / aria e 100% di umidità relativa.
   5. Ogni 2 giorni trasferire gli inserti in un sterile 24 pozzetti pre-caricato con 700 microlitri caldo terreno di coltura cellulare vie aeree proprietarie.
   6. Valutare l'integrità del tessuto vie aeree utilizzando metodi, come la resistenza trans-epiteliale (TEER), oppurecilia sfiora frequenza (CBF) utilizzando un microscopio dotato di un sistema di imaging video dal vivo ^9. La misurazione di TEER e CBF è descritto nel Kuehn ^10.

2. CYP Attività Quantificazione in colture cellulari

NOTA: Come regola generale, solventi come DMSO e metanolo possono essere utilizzati per preparare le soluzioni madre per le diverse sonde metaboliche e inibitori presentate in questo documento. Tuttavia, si raccomanda di mantenere la concentrazione finale di DMSO nel mezzo di coltura al minimo (1% o inferiore) poiché concentrazioni elevate possono inibire enzimi metabolici. Quando possibile, si raccomanda l'uso di rosso fenolo libero e terreno privo di siero durante l'incubazione con sonde metabolici dal rosso fenolo può interferire con CYP e attività enzimatica fase II e componente del siero come albumina può diminuire la disponibilità sonda. Non sempre è possibile rispettare rigorosamente questi linee guida. Ad esempio, mezzo di coltura cellulare vie aeree è proprietaria e contiene rosso fenolo. Proprietary linea cellulare metabolismo epatico medio ⁷ contiene già DMSO superiore all'1%, come richiesto per le cellule di adottare il fenotipo epatociti simile.

NOTA: Per concludere, qui, il termine specifico della sonda / inibitore viene utilizzata, ma questa terminologia deve essere considerato con cautela. Anzi, è molto raro per una sonda metabolica sia un substrato enzimatico esclusivo. Le sonde descritte qui, tuttavia, hanno una elevata affinità per il loro bersaglio enzima e quindi sono considerati come marcatori affidabili di attività.

1. Metabolici sonde, induttori e inibitori
   1. Le sonde che utilizzano metodi basati Spettrometria di Massa
      NOTA: Le sonde e inibitori descritti in questa sezione sono adatti per testare l'attività di CYP2As ^11, CYP1A2 ^12,ref "> 13, CYP2B6 ^{7, 14,} CYP2F1 ^{15, 16,} e CYP2E1 ¹⁷ mediante spettrometria UPLC-massa. Le sonde, inibitori e CYP corrispondenti sono descritti nella Tabella 1 con i riferimenti corrispondenti. Tabella 1 elenca inoltre il prodotto metabolico del CYP attività che viene quantificata mediante spettrometria di massa. ogni lavorazione che comprende coltura e soluzioni di tessuto per l'uso in coltura tissutale deve essere effettuata in una cappa sterile coltura tissutale. una soluzione madre può essere preparata in DMSO per tutti i substrati sonda.
      1. Prima l'esperimento preparare due serie di inserti cellulari o pozzi, utilizzare una serie per l'esperimento di inibizione, l'altro solo per la sonda metabolica. Preparare una terza serie di celle come un controllo in bianco mezzo. Essi possono essere su piastre separate o nelle stesse piastre con un minimo di tre repliche. Un esempio di piastra trovavaout è illustrato nella figura 5.
      2. Il giorno dell'esperimento, sostituire il mezzo di coltura cellulare con 450 ml di terreno fresco.
      3. Preparare in una cappa sterile 10x concentrazione delle seguenti soluzioni utilizzando il terreno di coltura cellulare. Mescolare la sonda 10X CYP, inibitore del CYP 10x, 10x e l'inibitore del CYP più 10x sonda.
         NOTA: soluzioni Maestro archivi di inibitore e sonda possono essere preparati in 100% DMSO (ad esempio, 1,000x consistenze) e ulteriormente diluito in media per ottenere una soluzione 10x per evitare una concentrazione finale di DMSO superiore all'1% con la coltura cellulare . Le concentrazioni finali 1x che mirano per l'incubazione con le cellule sono mostrati in Tabella 1.
      4. Filtrare la soluzione differente 10x sonda con un filtro a siringa da 0,2 um.
      5. Aggiungere 50 ml di mezzo contenente l'inibitore CYP 10x alla serie di cellule preparate per l'esperimento inibizione e pre-incubare per 30 min.
      6. REPosizionare il mezzo di celle in serie inibizione con 450 ml di mezzo fresco e aggiungere 50 ml di mezzo contenente entrambi 10x inibitore CYP ed il substrato 10x sonda.
      7. Aggiungere alle altre cellule 50 microlitri di terreno con il substrato sonda 10x e aggiungere una quantità equivalente di veicolo diluito in terreno (ad esempio, DMSO) per i controlli di cella vuota come mostrato in Figura 5.
      8. Incubare le cellule per 0-5 min (tempo 0, il controllo di sfondo) e 16 ore nell'incubatrice cella.
         NOTA: Questo tempo di incubazione è stato utilizzato con successo con le cellule delle vie aeree e la linea di cellule epatiche; tuttavia epatociti primari freschi hanno un'alta competenza metabolica, in attesa della qualità della preparazione cellulare e genetica di donatore, quindi tempi più brevi (ad esempio, 2-4 h) potrebbe essere adatto. E 'sempre consigliabile eseguire un esperimento di corso momento in cui testare diverse linee cellulari o tipi di cellule.
      9. Al termine del periodo di incubazione, collect il mezzo in provette etichettate separate per la quantificazione del prodotto metabolico delle sonde. Congelare il supporto per l'elaborazione futura.
      10. Lyse le cellule per la quantificazione delle proteine.
          NOTA: Ogni kit di proteine quantificazione di serie e il protocollo è adatto per questo passo. BCA è una scelta adatta. Questo passaggio è facoltativo se le cellule devono essere utilizzati in un altro saggio.
   2. trattamento medio
      NOTA: Il mezzo raccolti dalla fase di incubazione contiene la sonda chimica genitore così come i suoi prodotti metabolici. Per misurare una specifica attività CYP solo il prodotto della reazione catalizzata dal CYP di interesse dovrebbe essere quantificato. Fase I metaboliti sono spesso trattati in tandem con il metabolismo di fase II (coniugazione) e pertanto non possono essere rilevati come tali. Pertanto, per avere la quantificazione più accurata di un'attività CYP, una fase deconiugazione è necessaria per rimuovere eventualiFase II modifica il metabolismo. Poiché coniugazione di fase I metaboliti comporta spesso glicuronidazione o solfatazione, deconiugazione è ottenuta mediante trattamento dei campioni da glucuronidases e solfatasi ^18. Glucuronidasi e solfatasi attività è pH dipendente con attività più alta glucuronidasi essendo ottenuta a pH 4,5-5,0 e solfatasi attività è massimo a pH 6.0-6.5. Pertanto, questa fase richiede la regolazione del pH. Nel metodo descritto qui, si misura il pH con le strisce di pH per motivi pratici, poiché le sonde metro più pH non rientrano in una provetta da microcentrifuga da 1,5. Commercialmente disponibili strisce di pH possono essere trovati con risoluzione partire da 0,3 a 0,2 unità di pH.
      1. Trasferire 250 ml di mezzo di incubazione per un microtubo mL 1.5 e aggiungere la soluzione standard interna magazzino 4-metilumbelliferone per raggiungere una concentrazione finale di 100 nM.
      2. Regolare il pH del mezzo a 4,5-5,0 aggiungendo 1 M HCl. Aggiungere 1 ml di HCl alla volta e verificare il pHpipettando 2 ml di terreno su una striscia pH. Il raggiungimento di un pH di 5,0 sarebbe tipicamente richiedono non più di 5-10 ml di 1 M HCl.
      3. Aggiungere 150 unità (1,8 ml di una / mL magazzino 85.000 unità) di β-glucuronidasi / arilsolfatasi da Helix pomatia e incubare per 1 ora a 37 ° C. Interrompere la reazione aggiungendo 250 ml di metanolo freddo (-20 ° C). Conservare i campioni a -20 ° C o ulteriore processo.
      4. Evaporare il solvente utilizzando una centrifuga sotto vuoto a 45 ° C. Ricostituire i campioni con 500 ml di acetonitrile al 30%: una soluzione di acqua. I campioni sono pronti per l'analisi di spettrometria di massa e possono essere conservati a -20 ° C in fiale di vetro ambrato.
   3. Spettrometria di Massa quantificazione basata
      NOTA: Tutte le UPLC e spettrometro di massa impostazioni sono dettagliate nella Tabella supplementare dedicato 1. Per un'analisi quantitativa, stabilendo una curva di calibrazione è necessaria. il calicurva bration è ottenuta eseguendo una serie di diluizione nota del composto da quantificare. In questo caso, le curve di calibrazione sono state generate oltre 10 diverse concentrazioni (Tabella 2), almeno 6 dei quali dovrebbe essere entro il 20% del range lineare ^19. più basso livello di rilevamento è determinato come la più bassa concentrazione che dà un segnale di maggiore o uguale a 3 volte il segnale di fondo media. Il livello più basso di quantificazione è determinato come campione di concentrazione minima che dà un segnale maggiore o uguale a 10 volte il segnale di fondo media entrambi dei quali sono stabiliti in almeno 3 piste indipendenti con campioni in triplo.
      1. Preparare una diluizione seriale di un metabolita sintetico nel mezzo di coltura tissutale secondo la Tabella 2, compreso lo standard interno. Un volume finale di 250 microlitri per diluizione standard è sufficiente.
      2. Evaporare le diluizioni seriali di standard, come descritto in vep 2.1.2.4 e risospendere in un volume di 30% acetonitrile: acqua equivalente al volume di media prima evaporazione (ad esempio, 250 microlitri 30% acetonitrile: acqua se la soluzione standard di partenza era di 250 ml di mezzo).
      3. Aggiungere 250 ml di ciascuno standard diluizione seriale a un UPLC fiala di vetro ambrato iniettabile nel campionatore automatico UPLC-MS.
      4. Aggiungere i campioni di prova (250 mL) ad ambra fiale UPLC e metterli nel campionatore automatico UPLC.
      5. Randomize tutte le fiale.
         NOTA: La configurazione spettrometro di massa abbiamo usato è uno spettrometro ibrido triplo quadrupolo / lineare di massa a trappola ionica accoppiata ad un'UPLC dettagliate nella tabella 1 supplementare. Altre piattaforme avrebbero software e configurazione diversa, ma avrebbero seguito una procedura simile per eseguire la quantificazione.
      6. Eseguire l'UPLC-MS utilizzando le impostazioni dettagliate nella Tabella 1 supplementare a seconda della sonda specifica per quantificare.
      7. Usoil "Quantificazione - Costruire metodo di quantificazione" strumento strumenti spettrometro di massa quantificazione (Table of Materials) per generare la curva di calibrazione dallo standard sintetico acquisita e standard interno.
      8. Utilizzare la "quantificazione Wizard" per selezionare il lotto di campioni ed i campioni di quantificare ed eseguire il "Quantificazione Method". Il software spettrometro di massa quantificazione mostra un foglio con i valori di quantificazione del composto obiettivo in ciascun campione di prova.
   4. Sonde utilizzando metodi di luminescenza base
      NOTA: Le sonde Luminogenic per misurare una serie di attività CYP sono disponibili in commercio; Tuttavia, non tutti sono adatti per saggi basati cellulari. Qui, un protocollo viene presentato per misurare l'attività del CYP1A1 / CYP1B1. CYP1A1 / 1B1 è stato scelto per illustrare come per saggiare l'attività di CYP inducibili e per dare un esempio di come sonde luminogenic può essere utilizzato come un alternativo ai metodi di spettrometria di massa basati. Tabella 3 riassume le concentrazioni e incubazione volta abbiamo usato per le cellule delle vie aeree e la linea cellulare epatico; tuttavia, quelli potrebbero essere adattato per altri tipi di cellule. Altre sonde luminogenic sono disponibili in commercio e possono essere utilizzati come substrati per una varietà di CYP.
      1. Preparare cellule sufficiente per includere un controllo non indotto, un test indotta, e un indotto + inibitore di prova. Un esempio di un layout di piastra è mostrato in figura 5B.
      2. Per indurre CYP1A1 / 1B1, incubare le cellule con una concentrazione finale di 10 nM TCDD in terreno per un periodo di 72 ore (periodi più brevi di 24 a 48 h possono essere adatti).
         ATTENZIONE: TCDD è un agente cancerogeno e teratogeno. Indossare indumenti di protezione adeguati, rivedere il fornitore di scheda scheda di sicurezza ed eseguire una valutazione del rischio prima dell'uso.
      3. Dopo questo periodo, rimuovere il supporto, lavare i pozzetti con PBS 3 volte, e aggiungere un po mezzo fresco.
      4. Prior di incubazione delle cellule con la sonda giornalista luminogenic, pre-incubare il sottoinsieme designato di cellule indotte per 30 minuti con una concentrazione finale di 10 uM CYP1A1 / 1B1 inibitore, α-naftoflavone, in mezzo.
      5. Aggiungere la sonda luminogenic LUC-CEE (Luciferin 6'-cloroetil etere) ad una concentrazione finale di 50 pM ai + inibitori cellule non indotte, indotte e indotte.
      6. Incubare per 4 ore in un incubatore di coltura cellulare. Al termine del periodo di incubazione ritirare il mezzo per la quantificazione della sonda luminogenic.
      7. Trasferire 25 ml di terreno di coltura ad un bianco opaco 96 pozzetti e aggiungere 25 ml di reagente di rilevamento luciferina fornito dal produttore. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Leggere la piastra immediatamente utilizzando un luminometro.
      8. Risciacquare le cellule con PBS e lisare per la quantificazione delle proteine ​​totali.
         NOTA: questo passaggio è facoltativo se le cellule vive sono conservate per futuri esperimenti. iot è importante notare tuttavia che induttori come TCDD sono tossici e danneggiare le cellule.

Tabella 1: Elenco dei metabolici sonde, prodotti e inibitori con il loro enzima corrispondente. peso molecolare e concentrazioni raccomandate utilizzati con le vie aeree e le cellule epatiche sono anche indicati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5: consigliata 24 pozzetti layout delle piastre per eseguire un CYP Assay. (A) La configurazione consigliata per CYP costitutivamente espresso comprende una serie di pozzi per mezzo vuoto, La sonda metabolica, e l'inibitore della sonda più metabolica. Questa disposizione può essere moltiplicata per il numero di punti temporali che vengono testati. (B) L'esempio di layout di CYP inducibili comprende una serie di bene per uno sbozzato di media, una sonda metabolico unico controllo, cellule indotte (ad esempio, con TCDD) incubati con le sonde ed incubate con le sonde e un inibitore.

Tabella 2: diluizione degli standard sintetici utilizzati per le curve di calibrazione e LD rispettivi e LOQ. La gamma di diluizioni da utilizzare può variare in base alla piattaforma di spettrometria di massa e la sensibilità. Qui, abbiamo utilizzato uno spettrometro di massa a trappola ionica ibrido triplo quadrupolo / lineare collegato a un UPLC. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questafigura.

Tabella 3: Luminogenic Sonda, induttore e l'inibitore di CYP1A1 / 1B1 Assay. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Risultati

Esempi di attività metabolica misurati per due coppie di CYP (CYP1A1 / 1B1 e CYP2A6 / 2A13) nelle colture cellulari vie da tre diversi donatori (vie aeree M360, M370, M417) e la linea cellulare epatica (line Hep) sono mostrati in figura 6 ^20.

Attività CYP misurata da luminometria
La Figura 6A mostra la luminescenza relativa prodotte dall'attività CYP1A1 / 1B1 O-dealchilazione di Luc-CEE (Luciferin 6'-cloroetil etere) in cellule delle vie aeree (3 donatori) e cellule epatiche con e senza TCDD induzione. CYP1A1 / 1B1 sono enzimi altamente inducibile e sono tipicamente non espresso ad un livello costitutivo nella maggior parte dei tessuti. Come visibile in figura 6A, nessun segnale luminogenic viene rilevata quando le cellule non sono indotte. Quando entrambi i tipi di cellule vengono pre-incubate con TCDD, un forte CYP1A1 / 1B1 induttore, un marchiosegnale ed luminogenic viene rilevato rispetto al controllo (Figura 6A). Ciò indica che la sonda Luc-CEE è stato metabolizzato che porta al rilascio della frazione luciferina che viene quantificata in seguito. Nel complesso l'attività dalla linea cellulare epatico TCDD trattata è inferiore di quella delle cellule delle vie aeree, anche dopo la normalizzazione delle proteine ​​totali. Questo non è insolito in quanto linee cellulari tendono ad essere meno metabolicamente attivo di cellule primarie. Aggiunta di α-naftoflavone ha un chiaro effetto inibitorio sull'attività CYP1A1 / 1B1 in tutti i tipi di cellule che conferma ulteriormente la CYP dipendenza del metabolismo Luc-CEE.

La quantificazione di metaboliti CYP450 usando UPLC-MS
La Figura 6B illustra la quantificazione di CYP2A6 / 2A13 attività in cellule delle vie aeree da 3 donatori (Airway M343, M345, M347) e le cellule epatiche (linea Hep) dopo incubazione con cumarina in presenza e assenza della INHIBITOR 8-metossipsoralene. I dati sono normalizzati per proteine ​​totali. Nel controllo cumarina incubazione 0 min, senza 7-idrossicumarina viene rilevata (Figura 6B). CYP2A6 / 2A13 sono espressi costitutivamente in alcuni tessuti e quindi dopo 16 h di incubazione con formazione di cumarina 7-idrossicumarina viene rilevata nei diversi tipi cellulari testate, anche senza induzione. Quando 8-psoralene, viene aggiunto un inibitore di CYP2A (figura 6B), la formazione di 7-idrossicumarina è notevolmente ridotta.

Va notato che in presenza dell'inibitore CYP, è normale rilevare ancora qualche attività residua come inibizione è raramente completa e poiché altri CYP potrebbe anche essere in grado di riconoscere il substrato ma elaborarlo molto meno efficiente. Si può anche osservare che l'attività metabolica registrato può essere differente tra i donatori utilizzando cellule primarie come è visibile per CYP2A6 in cellule delle vie aeree(Figura 6B). Questo è previsto come l'attività CYP è suscettibile di genotipo e polimorfismi di ciascun donatore.

Figura 6: Saggio di attività Risultato per CYP1A1 / 1B1 attività (A) e CYP2A6 / 2A13 attività (B) nella epatica Cell Line e in tre Airway cellulare donatori (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE attività dealchilazione è mostrato con e senza induzione di CYP1A1 / 1B1 da TCDD. α-naftoflavone stato utilizzato come inibitore del CYP1A1 / 1B1. All'attività sono espressi come unità relative luminescenza (RLU) normalizzati dal tempo di incubazione in minuti (min) e proteina totale (mg). (B) CYP2A6 / 2A13 non richiedono l'induzione come sono espresse costitutivamente. Cumarina attività 7-idrossilazione in proteine ​​pmol / min / mg è indicata a tempi diversi con e senza l'inibitore 8-methoxypsorAlen. Tutti i risultati sono presentati come un valore medio di tre misurazioni indipendenti con deviazioni standard dalla media. Questa figura è stata modificata da Baxter ^20.

Supplemental Tabella 1: UPLC e impostazioni spettrometro di massa. Cliccate qui per scaricare questo file.

Discussione

Attualmente, molti sistemi di test tossicologici standardizzati utilizzano batteri ingegneristiche, linee cellulari o cellule embrionali che non sono rappresentativi della normale metabolismo umano ^1. Questo può portare a previsioni inesatte del potenziale attività tossica di una sostanza chimica o medicina. Innovativo in vitro, quali colture cellulari 3D e organo su un chip, vengono sviluppati in un tentativo di replicare meglio la morfologia normale attività metabolica dei tessuti umani ^{21, 22, 23.} competenza metabolica è un criterio che può essere utilizzato per decifrare quali modelli sono più adatti per gli studi di valutazione e di biotrasformazione di droga tossicologici.

Il protocollo che abbiamo descritto in questo documento è progettato per misurare l'attività degli enzimi CYP utilizzando cellule vive. È flessibile e può essere utilizzato per diversi sistemi cellulari in 2D o 3D culturES e offre la possibilità di utilizzare un probe- luminogenic o di un approccio basato su spettrometria di massa. Entrambi i metodi sono sufficientemente sensibili per rilevare quantità nanogrammi di materiali e richiedono solo un piccolo numero di cellule cresciute in un formato multipozzetto. Essi possono anche essere applicati a sferoide o cellule coltivate in matrici complesse. La scelta del substrato sonda è ovviamente un elemento critico del protocollo. La specificità del test si basa sulla sonda essere selettivi dell'enzima CYP e un altro strato di affidabilità può essere ottenuta mediante l'impiego di un inibitore selettivo CYP. I substrati e inibitori elencati nel presente documento sono solo alcuni esempi, ma altri possono essere trovati nella letteratura.

È importante considerare diversi tempi di incubazione quando si lavora con un nuovo tipo di cella come CYP risultato negativo attività potrebbe essere dovuto al enzima è espressa ad un livello basso. L'aggiunta di un tipo di cellula che può essere utilizzato come controllo positivo è opportuno garantire che unrisultato negativo non è legata a un problema tecnico e per aiutare con la risoluzione dei problemi. cellule epatiche primarie sono metabolicamente competenti e possono essere utilizzati come controllo, per esempio epatociti primari in sospensione sono molto facile da usare, ma la loro vitalità è limitato nel tempo. Linee di cellule epatiche sono possibili alternative che sono relativamente facili da usare come descritto in questo protocollo, ma alcuni sono migliori di altri in termini di attività metabolica ^{6, 21.}

Poiché il saggio è non distruttiva, meno proteine totali è quantificato, è possibile seguire l'attività CYP nel tempo in studi longitudinali ^20. Questo è un punto importante perché alcune cellule avranno attività di CYP variabile nel tempo in coltura. Un risultato negativo potrebbe essere associato con la mancanza di confluenza, progresso con la differenziazione o dedifferentiation in vitro. In tal caso, l'approccio è semi-QUANTITATIVAve poiché i dati non è normalizzata dalla quantità totale di proteina in ciascuna coltura cellulare. Non è sempre possibile o consigliabile riutilizzare il tessuto dopo la misurazione dell'attività CYP l'esposizione a sonde, inibitori o induttori possono avere un effetto tossico sul tessuto come avviene per TCDD.

frazioni cellulari come microsomi potrebbero anche essere utilizzati per caratterizzare l'attività CYP di un dato tipo di cellula. Microsome preparati, tuttavia, richiedono un sacco di materiale cellulare, l'aggiunta di cofattori adeguate e tampone per assicurare che gli enzimi rimangono attivi. Utilizzando cellule vive elimina la fase di preparazione microsome ingannevole e di lavoro fuori che buffer e cofattori funzionano meglio.

Come raccomandazione generale, è una pratica migliore per caratterizzare ulteriormente il profilo di espressione di CYP in colture cellulari per verificare che corrisponda l'attività enzimatica. Questo ulteriore livello di verifica è raccomandato dato che le sonde metaboliche non sono Enticontare specifico per un singolo CYP e dà maggiore fiducia che l'attività metabolica misurata corrisponde l'espressione dell'enzima corrispondente. Poiché CYP sono proteine di membrana sono relativamente difficili da preparare per western blot, quindi RT-PCR è stato l'approccio preferito al profilo questi enzimi ^20.

È importante notare che questo protocollo descrive un metodo per attività enzimatica assay CYP che rappresenta solo una famiglia di enzimi metabolici, anche se importante. La flessibilità di un approccio spettrometria di massa permette lo sviluppo di metodi di acquisizione di altre trasformazioni metaboliche dei substrati sonda. Tuttavia, coloro che devono essere sviluppati, uno alla volta e ci sono attualmente meno noti sonde specifiche e inibitori selettivi per altre famiglie di enzimi metabolici. Questa distanza deve essere indirizzata a consentire una valutazione completa della competenza metabolica di cellule in vitro sisteSignorina.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagente & Cellule
2 μ m filtro per siringa	Whatman	UN203NPEORG
piastra a 24 pozzetti	Corning	3524
4-metilumbelliferone	Sigma	Aldrich M1381
5-fenil pentyne	Sigma Aldrich	CD5001437
6-idrossibupropione	Sigma	Aldrich H3167
6-idrossiclorzoxazone	Sigma Aldrich	UC148
7-etossicumarina Sigma	Aldrich	195642
7-idrossicumarina	Sigma Aldrich	H24003
8-metossipsoralene	Sigma Aldrich	M3501
acido acetico	Sigma Aldrich	695092
acetonitrile	Fisher	A/0626/17
&alfa;-naftoflavone	Sigma Kit	Aldrich N5757
	Thermo Scientific	23227
b-glucuronidasi / arilsulfatasi	Sigma Aldrich	G0876
Bupropione	Sigma Aldrich	B102
Carbamazepina	Sigma Aldrich	C4024
clorzoxasone	Sigma Aldrich	C4397
collagene	Cell Systems	5005-B
cumarina	Sigma Aldrich	C4261
disulfiram	Sigma Aldrich	86720
fluvoxamina	Sigma Aldrich	F2802
Glutamax (integratore di glutammina)	Fisher	35050061
integratore per il metabolismo HepaRG	Merck	MMAD621
scongelamento HepaRG integratore di terreni	Merck	MMADD671
HepaRG	Merck	MMHPR116
Luciferin-CEE	Promega	V8751
metanolo	Fisher	M/4056/17
Cellule delle vie aeree MucilAir	Epithelix	EP01
Mezzi di manutenzione delle cellule delle vie aeree MucilAir	Epithelix	EP04MM
Phenomenex Kinetex 2.6 μ m, PFP 100A	Phenomenex	00B-4477-AN
TCDD	Sigma Aldrich	48599
thioTEPA	Sigma Aldrich	T6069
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µ m 2,1 x 50 mm	Waters	86003538
Williams' E media	Fisher	17704-024
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Equipment
UPLC	Waters	Acquity
QTRAP MS	Sciex	ABI Sciex 4000
QTRAP MS software	Sciex	Analista 1.4.2
luminometro	Molecular Devices	SpectraMax M3
spettrofotometro	Molecular Devices	SpectraMax M3
contatore di celle	Beckman Coulter	Vi-Cell XR
evaporatore rotante	Eppendorf	Eppendorf-5301