Summary
체외 시스템의 신진 대사 능력은 약물 및 독성 물질의 생체 내 변화 및 처분을위한 핵심 요구 사항입니다. 이러한 프로토콜에서는, I는 세포 배양 대사 위상을 평가하기위한 기준 대사 프로브의 적용을 설명한다.
Abstract
생체이 대사 효소는 용해도를 증가 및 배설을 촉진 작용기를 첨가하여 약제의 독성 물질 및 생물 전환에 중요한 기능을 담당한다. 어떤 경우에 그 구조 변경은 새로운 독성 제품의 형성으로 이어질. 동물 실험을 줄이기 위해, 화학적 위험은 대사 능력이 세포를 이용하여 평가 될 수있다. 대사 효소의 발현은, 그러나, 체외 차 문화 시스템에서 많은 시간 이상 안정되지 종종 세포 라인의 일부 또는 존재하지 않는다. 따라서, 생체 외 의약품, 첨가제, 환경 오염 물질 대사의 연구는 이상적으로 신진 대사 활동이 특징되었습니다 전지 시스템에서 수행되어야한다. 우리는 UPLC 질량 분석에 의한 정량적 화학 프로브 및 대사 제품을 사용하여 2D 세포주 및 기본 3D의 문화 대사 효소의 클래스의 활동 (인간 단계 I)를 측정하기 위해 여기에 방법을 설명하고luminometry. 방법 세포주 및 다양한 조직으로부터 유도 된 세포의 주 대사 활성을 테스트하도록 구현 될 수있다.
Introduction
생체이 대사는 신체 외부 화학 물질들이 배출을 용이하게 한 친수성기와 복합체의 첨가에 의해 수정되는 과정이다. 일반적으로 생체 이물질의 대사 제가 하나 이상의 수산기 (1, 2)의 첨가와 함께 산화 주로 이루어지는 단계와 두 단계 프로세스이다. 예컨대 글루 쿠로 니드 또는 황산 부분 (1, 2)과 같은 친수성 복합체에 대한 수용체로서 단계 II에서, 수산기가 사용된다. 셉터 그룹이 이미 분자에 존재하는 경우, 접합 공정 독립적 I 상 대사 일어날 수있다. 각 화학 반응 기판 (3)의 특정 효소의 기, 예를 들어, 히드 록 실화를 촉매 CYPs (시토크롬 P450s) (도 1), 탈 알킬화에 의해 수행된다. ConjugatioN sulfotransferases에 의해 촉매되는, UDP-glucuronosyltransferases (도 1), 글루타티온 S 트랜스퍼 - 및 N- 아세틸 트랜스퍼 4. 각 조직 및 기관은 그 대부분의 단백질을 발현시키는 간암으로 특정 대사 효소의 발현 프로파일을 가질 것이다.
그림 1 : 단계 I와 쿠마린을위한 단계 II 대사의 예. CYP2A6은 / 쿠마린의 7 수산화을 촉진 CYP2A13. 7- 하이드 록시 쿠마린이 UGT1A6 및 UGT1A9 가장 높은 활성을 보여주는, 단계 II 효소에 의한 글루 쿠 UGTs 잔기에 접합된다.
생체 이물질의 신진 대사를 이해하는 것은 두 가지 이유에 대한 약물 안전성 평가 및 화학 위험 평가에 중요한 : 반응 속도론은 약물이나 화학 물질은 활성 또는 비활성 형태 B의 몸에 남아 시간을 결정합니다는 efore 배설; 및 모 화합물 대사 효소에 의해 더 반응성 불안정한 독성 종으로 변형 될 수있다. 또한 "생리 활성"로 알려진 이러한 반응은 대부분 내가뿐만 아니라 상 II 결합 (5)에 의해 희소 한 경우에 효소를 CYP 단계에 의해 구동된다.
이를 바탕으로 정확하게 약물이나 화학 물질과 관련된 위험을 예측하는 체외 모델의 능력은 전지 시스템의 신진 대사 능력에 크게 의존한다. 병든 조직 또는 정상 세포의 변형 유래 세포주에 종종 부분 아니라면 원점 (6)의 이들 조직의 대사 효소 프로필 대표 모두 잃는다. 정상 대사 효소 프로파일의 유지는 (적어도 단기간 배양)에서 일차 세포 배양 물에 잘 나타나 조직이 그것의 3 차원 구조 (1)를 유지할 수 있도록 매트릭스 배양 할 경우 더욱 향상된다. 따라서 문자체외 전지 시스템의 신진 대사 능력의 acterization 세포 모델은 화학 물질 안전성 평가를 수행 할 적절한에 관한 결정을 안내하는 중요한 예비 단계입니다.
본 연구에서 우리는 간 세포주 7 3D 차 폐암 세포 배양 8 애플리케이션의 예는 시험관 내에서의 활성 및 단계 I CYP 효소의 발현을 프로필에 대한 프로토콜을 제시한다. CYP 특정 기질 대사 억제제 제품 및 컨트롤 질량 spectrometry- 및 luminogenic 기반 정량 방법과 함께 설명한다. 일부 CYPs을 유도하고 다른 구성적인 때문에, 예는 그 두 가지 시나리오에 대해 구체적으로 살펴 보도록한다.
Protocol
참고 : 신진 대사 활동 분석을위한 일반적인 작업은 그림 2에 설명되어있다. 이 워크 플로의 각 단계는 다음 단락 이후에 자세히 설명되어 있습니다. 시약 및 장비의 상세 테이블은 재료의 표에 제시되어있다.
그림 2 : 대사 프로브 분석을위한 워크 플로우. 세포를 시딩하고 적절한 밀도로 성장한다. CYP 유도 단계는 분석 효소의 활성에 따라 요구 될 수도있다. 프로브 기판 및 억제제는 세포 배양 물에 첨가한다. 인큐베이션 기간 후, 배지는 분석을 위해 수집하고 세포 단백질 정량 용해된다. 배지 질량 분석법 또는 luminometry하여 프로브 기질의 대사 산물의 분석을 위해 처리된다.광고 / 55502 / 55502fig2large.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 세포 배양
그림 3 : 간 세포주 문화의 광 투과 현미경. 이 프로토콜 (5)에 기술 된 세포주는 통상적으로 배양 간세포 담관 간의 50 % 스플릿 (100X)와 구별. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 간 세포주 배양
참고 : 시판 간 세포주 대사 능력이 세포의 예로서 사용되었다. 세포주는 바이러스 감염 (7)에 의해 야기 된 간암으로부터 유래 된. 포화 상태에서,이 세포주 (도 3) cholangiocyte- 간세포와 같은 세포로 분화 더욱 상세한 Guillouzo 7에서 찾을 수있다. 배양액을 2 % DMSO의 포함은 다양한 CYPs의 세포주 및 발현의 분화를 지원한다.- 액체 질소에서 세포 극저온 튜브를 제거하고 전송을 위해 드라이 아이스에 배치합니다. 1-2 분 동안 37 ℃의 수욕 예열로 cryovial 전송 및 층류 후드에 배치하기 전에 70 % 에탄올로 병의 외부 살균.
- 멸균 조건하에 작업하는 동안 신중 과잉 압력을 해제하고, 37 ℃에서 예열 된 윌리엄 E 배지 9 ml로 채워진 10 ㎖ 튜브에 저온 바이알의 내용물을 피펫 극저온 병을 연다.
- 실온에서 400 XG에서 10 분 동안 상기 용액을 원심 분리하여 상층 액을 제거하고, 5 ml의 세포를 재현 탁특허 해동 매체는, 37 ℃에서 예열 된 글루타민 글루타민 보충제 (2 mM의 최종 농도) (윌리엄스 E + 글루타민 보충 + 해동 첨가제)로 보충.
- 세포 계수기 또는 기타 적합한 세포 계수기 기법 500 μL 분취를 사용하여 생존 세포 수를 계산.
- 0.6 × 106 생세포의 밀도 / 웰 해동 배지 0.5 ㎖의 최종 부피에서 24- 웰 콜라겐 - 코팅 된 플레이트에서 세포를 종자.
- 5 % / 95 % CO 2 / 공기 및 100 % 상대 습도와 37 ℃의 배양기에서 플레이트 (들)를 놓는다.
- 24 시간 세포를 시딩 한 후, 예열 유지 / 대사 작동 매체 0.5 ㎖ (윌리엄스 E + 글루타민 + 보충 대사 보충 (이 매체는 이미 DMSO 함유))와 매체를 교체한다. 매 2 일 매체를 변경합니다.
- 배양 며칠 후, 세포는 서브 컨 플루 언트 해면골 구조 (도 3)을 형성한다. 최적의 대사활동은 일반적으로 7 일 및 10 일 사이에 관찰 최저 4이다.
그림 4 : 공기 - 액체 인터페이스 8에서 자란 알 시안 블루 스테인드기도 세포의 단면.
섬모, 점액 생산 및 기저 세포는 명확하게 볼 수 있습니다. 스케일 바 = 250 μm의.
- 차별화 된기도 상피 문화
참고 : 프로토콜이 삽입 8 (그림 4)에서 공기 - 액체 인터페이스에서 성장 시판 완전히 차별화 된 차기도 상피로 표시됩니다. 조직 배양은 세포 표현형 mucocilliary 극성 8을 유지한다. 세포는 비강 또는 기관지 기원이 될 수 있습니다. 여기, 사람 코 점막 세포를 사용합니다. 세포를 24 배양 판에 전달되는 형식공기 - 액체 계면에 삽입한다. 전송을 용이하게하고 삽입은 배양 배지와 혼합하여 아가 로스 매트릭스에 매립 된 기초 부에 제공되는 중간 유출을 방지한다.- 셀 전송시 클린 층류 후드에 배치하기 전에 70 % 에탄올 용액으로 인서트 (24)를 포함하는 플레이트를 멸균.
- 예열 700 μL를 소유 배양액을 첨가하여 멸균 24 웰 플레이트를 준비한다.
- 사용 무균 핀셋 부드럽게 아가 로스 매트릭스로부터 빠지 삽입하여 새로운 플레이트 배지에 미리로드 셀 인서트 옮긴다.
- 5 % / 95 % CO 2 / 공기 및 100 % 상대 습도와 37 ℃의 배양기에서 플레이트 (들)를 놓는다.
- 매 2 일에 삽입을 전송 새로운 멸균 24 웰 플레이트 사전로드 700 μL 따뜻한 독점기도 세포 배양 배지.
- 이러한 트랜스 - 상피 저항 (티이), 또는 방법을 사용하여기도 조직의 무결성을 평가섬모는 라이브 비디오 이미징 시스템 (9)가 장착 된 현미경을 사용하여 주파수 (CBF)를 이겼다. 티이 및 CBF의 측정 Kuehn는 10에서 설명한다.
세포 배양 2. CYP 활동 정량화
주 : 일반적으로, 예컨대 DMSO, 메탄올 같은 용매는이 논문에서 제시 한 다른 프로브와 대사 저해제 스톡 용액을 제조 할 수있다. 그러나, 고농도의 대사 효소를 억제 할 수 있으므로 최소 (1 % 이하)로 배지에서의 최종 DMSO 농도를 유지하도록 권장한다. 가능하다면, 또한 페놀 레드는 프로브의 유용성을 감소시킬 수 알부민 CYPs 및 단계 II 효소 활성과 혈청 성분을 방해 할 수 있기 때문에, 대사 프로브와 인큐베이션 중에 페놀 레드없는 및 무 혈청 배지를 사용하는 것이 권장된다. 엄격히 준수하는 것이 항상 가능한 것은 아니다 가이드 라인. 예를 들어,기도 세포 배양 배지는 독점 및 페놀 레드가 포함되어 있습니다. 세포는 간세포와 같은 표현형을 채택하는 것이이 요구되는 것처럼 독점적 간 세포주 대사 매체 (7)는 이미 상술 1 % DMSO를 포함한다.
참고 : 마지막으로, 여기, 용어 특정 프로브 / 억제제를 사용하지만,이 용어는 신중하게 고려되어야한다. 대사 효소 프로브 기판 배타적이기 위해서는 실제로는 매우 드물다. 여기에 설명 된 프로브는, 그러나, 이들 효소 표적에 대한 높은 친 화성을 가지므로 활성의 신뢰성 지표로 간주된다.
- 대사 프로브, 유도 및 억제
- 질량 분석 기반 방법을 사용하여 프로브
주 :이 절에 설명 된 프로브 및 억제제 CYP2As (11)의 활성을 시험하기에 적합한, CYP1A2 12REF "> 13, CYP2B6 7, 14, CYP2F1 15, 16, CYP2E1 17 UPLC 질량 분광기. 프로브 억제제 및 CYP 대응은 해당 참조하여 표 1에 기재되어있다. 표 1은 또한 CYP의 대사 산물을 나열 질량 분석에 의해 정량화되는 활성. 조직 배양에 사용하기위한 조직 배양 및 솔루션을 포함한 모든 작업은 멸균 조직 배양 후드에서 수행되어야한다. 원액 모든 프로브 기판에 대한 DMSO에서 제조 될 수있다.- 단지 대사 프로브, 다른 실험 전에, 셀 웰 인서트 또는 두 시리즈를 준비 저해 실험 한 계열을 사용한다. 매체 블랭크 대조군 세포의 세번째 시리즈를 준비. 그들은 별도의 플레이트 또는 세 개의 복제 중 최소한 같은 플레이트 일 수있다. 판의 예는 누워아웃도 5에 제시되어있다.
- 실험의 날, 새로운 매체의 450 μL와 세포 배양 매체를 교체합니다.
- 무균 후드 세포 배양 배지를 사용하여 다음 용액의 10 배 농도로 준비한다. 10 배 CYP 프로브 CYP 억제제 배, 10 배 CYP 억제제를 더한 배 프로브를 섞는다.
주 : 억제제 및 프로브 마스터 스톡 솔루션 (1000 개 배 주식 등) 배지에서 희석하고, 추가로이 세포 배양액 1 %를 초과하여 최종 DMSO 농도를 방지하기 위해 10 배 용액을 얻었다 100 % DMSO에서 제조 될 수있다 . 세포와 배양을 목적으로하는 최종 1X 농도는 표 1에 나타내었다. - 0.2 μm의 주사기 필터를 다른 배 프로브 용액 필터.
- 억제 실험 30 분 동안 예비 배양을 위해 준비 셀의 일련의 10 배 CYP 억제제를 함유하는 배지의 50 μL를 추가한다.
- 아르 자형신선한 배지 450 μL와 억제 직렬 셀의 매체 eplace 10 배 CYP 억제제와 배 프로브 기판을 모두 함유 배지의 50 μL를 추가한다.
- 다른 셀은 10 배의 프로브 기판과 매체의 50 μL를 추가하고,도 5에 도시 된 바와 같이, 빈 셀에 제어 (예를 들어, DMSO) 배지에서 희석 된 차량의 당량을 추가한다.
- 5 분간 (0 시간, 배경 제어) 및 세포 배양기에서 16 시간 0 - 세포를 인큐베이션.
참고 :이 배양 시간은기도 세포와 간 세포 라인을 성공적으로 사용되었다; 그러나 신선한 차 간세포가 셀 준비의 품질과 기증자의 유전 적 구성, 따라서 짧은 시간 보류, 높은 신진 대사 능력을 가지고 (예를 들면, 2-4 시간)이 적합 할 수 있습니다. 항상 세포주 또는 세포 유형 다른를 테스트 할 때 시간 코스 실험을 수행하는 것이 좋습니다. - 잠복기, 콜의 끝에서요법 프로브의 대사 산물의 정량화를위한 별도의 표지 튜브 매체. 미래 처리를 위해 매체를 고정.
- 단백질 정량를 Lyse는 세포.
주 : 표준 단백질 정량 키트 및 프로토콜이 단계에 적합합니다. BCA는 하나 개의 적합한 옵션입니다. 세포가 다른 분석에서 사용할 수있는 경우이 단계는 선택 사항입니다.
- 중간 처리
참고 : 배양 단계에서 수집 된 매체는 부모 프로브 화학뿐만 아니라 신진 대사 제품이 포함되어 있습니다. 특정 CYP 활동을 측정하기 위해에만 관심 CYP에 의해 촉매 반응의 제품은 정량화되어야한다. I 상 대사 제품은 종종 II 상 대사 (접합)와 협력하여 처리되어 있으므로 등을 검출 할 수 없다. 따라서, CYP 활성의 가장 정확한 정량 분석을 얻기 위해, deconjugation 단계는 제거 할 필요단계 II 신진 대사를 수정. I는 대사 산물의 위상 공액 종종 글루 쿠로 나이드 또는 황산을 포함하기 때문에,이 deconjugation glucuronidases하여 시료의 처리에 의해 달성 18 sulfatases된다. 및 글루 쿠로 sulfatase 활성은 높은 활성을 갖는 글루 쿠로 종속 pH가 4.5-5.0의 pH 및 sulfatase 활동의 pH 6.0-6.5에서 높은 인 달성되고있다. 따라서,이 단계는 pH 조정을 필요로한다. 이 방법은 여기에서 설명에서는 가장 pH 미터 프로브를 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 적합하지 않기 때문에 실용적인 이유로 산도 스트립을 사용하여 pH를 측정한다. 시판 스트립의 pH 0.3 내지 0.2의 pH 단위만큼 낮은 해상도로 찾을 수있다.- 1.5 ㎖의 마이크로 튜브에 배양 배지 250 μL를 전송하고 100 nm의 최종 농도에 도달 -4- 메틸 움 내부 표준 원액을 추가한다.
- 1 M 염산을 첨가하여 4.5-5.0로 배지의 pH를 조정한다. 한번에 HCl을 1 μL를 첨가하고 pH를 확인pH가 스트립 상에 매체를 2 μL 피펫 팅. 통상적으로 5.0의 pH에 도달 할 5-10 μL의 1 M HCl을 넘지 필요 없다.
- 헬릭스 pomatia에서 β 글루 쿠 / arylsulfatase 150 개 단위 (AN 85,000 단위 / ㎖ 스톡 1.8 μL)를 첨가하고, 37 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. 냉 메탄올 250 μL를 첨가하여 반응을 정지 (-20 ° C). 더 -20 ° C 또는 프로세스에서 샘플을 저장합니다.
- 45 ℃에서 진공 원심 분리기를 이용하여 용매를 증발시켰다. 수용액 : 30 % 아세토 니트릴 500 μL로 샘플들을 재구성한다. 샘플은 질량 분광 분석을위한 준비와 앰버 글래스 병에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 질량 분석 기반의 정량화
참고 : 모든 UPLC 및 질량 분석기 설정은 전용 보충 표 1에 자세히 설명되어 있습니다. 정량적 분석을 위하여, 검량선을 설정하는 것이 필요하다. 칼리bration 곡선 정량 화합물의 공지의 희석 범위를 실행함으로써 얻어진다. 이 경우, 교정 곡선은 선형 영역 (19)의 20 % 이내이어야 적어도 6있는 10 개 가지 다른 농도 (표 2)를 통해 생성 하였다. 검출 최저 레벨 신호보다 크거나 평균 배경 신호를 3 배 동일 제공 최저 농도로 결정된다. 정량의 최저치는 10 배 중으로 샘플을 적어도 3 개 개의 독립적 인 실행을 통해 결정 모두의 평균 배경 신호에 신호가 크거나 같은 범 낮은 농도의 시료로한다.- 내부 표준을 포함하여, 표 2에있어서, 조직 배양 배지 내 대사 산물 합성의 일련의 희석을 준비한다. 표준 희석 당 250 μL의 최종 부피는 적절하다.
- 명세서에 기술 된 바와 같이 표준의 연속 희석을 증발30 % 아세토 니트릴의 부피에 재현 탁하고 EP 2.1.2.4 : 미디어 전에 증발 물 부피 당량 (예를 들면, 250 μL의 30 % 아세토 니트릴 : 출발 표준 용액 250 μL 매체 인 경우, 물).
- UPLC-MS 오토 샘플러에 주입 UPLC 호박색 유리 바이알에 각각 직렬 희석 표준 250 μL를 추가한다.
- UPLC 유리 병을 황색과 UPLC의 자동 시료 주입기에 배치하는 시험 샘플 (250 μL)를 추가합니다.
- 모든 병을 무작위.
주 : 우리가 사용하는 질량 분광계 설정은 기업 표 1에 자세히 UPLC 결합 하이브리드 삼중 사중 극 / 선형 이온 트랩 질량 분석기이다. 다른 플랫폼은 다른 소프트웨어 및 구성을 것이다하지만, 정량을 수행 할 수있는 유사한 단계를 수행합니다. - 정량화하는 특이 적 프로브에 따라 기업의 표 1에 설명 된 설정을 사용 UPLC-MS를 실행.
- 용도은 "정량 - 정량 방법을 구축"질량 분광계 정량 도구 도구 (재료 표)는 취득한 합성 표준과 내부 표준 물질의 보정 곡선을 생성한다.
- 정량화하고 "정량 방법"을 실행하는 샘플 배치 및 샘플을 선택하기 위해 "정량 마법사"를 사용합니다. 질량 분광계 측정 장치 소프트웨어는 각각의 테스트 샘플의 표적 화합물의 정량 값으로 스프레드 시트를 표시한다.
- 발광 기반 방법을 이용하여 프로브
참고 : Luminogenic 프로브는 CYP 활동의 범위를 측정하기 위해 상업적으로 사용할 수 있습니다; 그러나, 모든 세포 기반 분석에 적합합니다. 여기에서, 프로토콜은 CYP1A1 / CYP1B1의 활성을 측정하기 위해 제공된다. CYP1A1은 / 1B1는 유도 CYPs의 활성을 분석하기와 같이 바꾼다 사용될 수 있는지 luminogenic 프로브의 예를 제공하는 방법을 설명하기 위해 선택되었다질량 분석 기반 방법 네이티브. 표 3은 우리가기도 세포와 간세포 라인에 사용 된 농도와 항온 처리 시간을 요약; 그러나, 사람들은 다른 세포 유형에 적응해야 할 수도 있습니다. 다른 luminogenic 프로브는 시판되고 CYPs의 다양한 기질로서 사용될 수있다.- 비 - 유도 제어 유도 테스트 및 유도 + 억제제 테스트를 포함하기에 충분한 셀을 준비한다. 플레이트 레이아웃의 예는도 5b에 도시된다.
- , CYP1A1 / 1B1 유도 (또한 적합 할 수있는 24 ~ 48 시간의 짧은 기간)의 72 시간 동안 배지에서 10 nM의 TCDD의 최종 농도로 세포를 배양.
주의 : TCDD는 발암 및 기형이다. 적절한 보호 장비를 착용 공급 업체 MSDS 시트를 검토하고 사용하기 전에 위험 평가를 수행합니다. - 이 기간 후, 매체를 제거 PBS 3 회와 우물을 씻어하고 신선한 매체를 추가 할 수 있습니다.
- 홍보IOR luminogenic 리포터 프로브 세포 배양에 배지에서 10 μM CYP1A1 / 1B1 억제제, α-naphthoflavone의 최종 농도로 30 분 동안 유도 된 세포의 지정된 서브 세트를 사전 배양.
- 비 - 유도 된 유도하고, 유도 된 억제제 + 세포가 50 μM의 최종 농도로 luminogenic 프로브-LUC CEE (루시페린 6'- 클로로 에틸 에테르)를 첨가.
- 세포 배양 인큐베이터에서 4 시간 동안 배양. 배양 시간의 끝에서 luminogenic 프로브 정량 매체를 수집한다.
- 이전 25 백색 불투명 한 96 웰 플레이트에 배지 μL하고 제조업체에서 제공 루시페린 검출 시약 25 μL를 추가한다. 실온에서 20 분 동안 인큐베이션. 바로 루미를 사용하여 판을 읽어보십시오.
- PBS로 세포를 씻어 총 단백질 정량 용균.
참고 : 살아있는 세포는 미래의 실험을 위해 보유하는 경우이 단계는 선택 사항입니다. 나는t는 TCDD로 유도 물질은 독성과 세포를 손상 것이다 그러나주의하는 것이 중요하다.
- 질량 분석 기반 방법을 사용하여 프로브
표 1 : 해당 효소와 대사 프로브, 제품 및 억제제의 목록. 분자량 및기도 및 간 세포를 사용 권장 농도도 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 제안 된 24 웰 플레이트 레이아웃은 CYP 분석을 수행 할 수 있습니다. (A) 구성 적으로 발현 CYPs 권장 레이아웃 블랭크 매체 일련의 웰을 포함상기 대사 프로브 및 프로브 플러스 대사 억제제. 이 레이아웃은 테스트중인 시점의 수를 곱한 수 있습니다. (B)가 유도 CYPs에 대한 예시적인 배치는 중간 빈 잘 일련 대사 프로브 (TCDD 가진 예) 만 제어 유도 세포 프로브와 함께 배양하고, 프로브 및 억제제와 함께 배양을 포함한다.
표 2 : 검량선 각각의 LOD를 사용하고 LOQs 합성 표준 희석. 사용하는 희석 범위는 질량 분석 플랫폼과 감도에 따라 달라질 수 있습니다. 여기서, 우리는 UPLC 연결된 하이브리드 삼중 사중 극 / 선형 이온 트랩 질량 분광계를 사용 하였다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림.
표 3 : Luminogenic 프로브, CYP1A1에 대한 유도 물질과 억제 / 1B1 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
세 가지 공여체 (기도 M360, M370, M417) 및 간 세포주 HEP (선)에서기도 세포 배양 두 CYPs 쌍 (CYP1A1 / 1B1 및 CYP2A6 / 2A13) 측정 대사 활성의 예는도 6에 나타낸다 (20).
CYP 활성 측정 luminometry
도 6a는 호흡기 세포에서 룩 - CEE (루시페린 6'- 클로로 에틸 에테르) (3 도너)와 함께 및 TCDD 유도없이 간 세포의 CYP1A1 / 1B1 O-탈 알킬화 활동에 의해 생성 된 상대 발광을 나타낸다. CYP1A1 / 1B1 높게 유도 효소이며, 통상적으로 대부분의 조직의 구성 적 수준에서 발현되지 않는다. 세포가 유도되지 않는 경우도 6a에서 알 수있는 바와 같이, 더 luminogenic 신호가 검출되지 않는다. 두 세포 유형은 TCDD 강한 CYP1A1 / 1B1 유발제 마크로 사전 배양하면ED luminogenic 신호는 제어부 (도 6a)와 비교하여 검출된다. 이는 룩 - CEE 프로브 이후 정량화 루시페린 부분의 박리로 이어지는 대사되었음을 나타낸다. 전체적으로 TCDD 처리 간 세포주에서 활성 심지어 총 단백질 정규화 후에,기도 세포보다 낮다. 세포주는 일차 전지보다 대사 활성화하는 경향이 있기 때문에 이것은 드문 일이 아니다. α-naphthoflavone 첨가 CEE 상기 룩 - 대사 CYP 의존성을 확인 모든 세포 유형에서 CYP1A1 / 1B1 활성에 명확한 억제 효과를 갖는다.
UPLC-MS를 사용 CYP450 대사 산물의 정량
도 6b는 INHI의 존재와 부재 및 쿠마린과 배양 후 3 도너 (기도 M343, M345, M347) 및 간 세포 (간염 라인)에서기도 세포 CYP2A6 / 2A13 활성의 정량화를 도시BITOR 8 methoxypsoralen. 데이터는 전체 단백질 정규화된다. 0 분 쿠마린 배양 컨트롤 어떠한 하이드 록시 쿠마린 (7)는 (도 6b) 검출되지 않는다. CYP2A6 / 2A13 특정 조직에서 구성 적으로 발현되는 7 하이드 록시 쿠마린의 형성 쿠마린 따라서 후 16 시간 배양에도 유도하지 않고, 테스트를 다른 유형의 세포에서 발견된다. 8-methoxypsoralen 때 CYP2A 억제제 (도 6B)는, 7 하이드 록시 쿠마린의 형성이 상당히 감소된다 첨가한다.
억제가 거의 완료되는 다른 CYPs 또한 기판을 인식하지만, 훨씬 덜 효율적으로 처리 할 수 있습니다 이후 CYP 억제제의 존재, 여전히 잔존 활동을 감지하는 것이 정상입니다 주목해야한다. 또한 그것이기도 세포 CYP2A6 볼 같이 일차 전지를 사용하는 경우, 기록 대사 활성은 공여체와 상이 할 수 있음을 관찰 할 수있다(도 6b). 이것은 CYP 활동이 각 기증자의 유전자형과 유전자 다형성에 대한 책임이로 예상된다.
도 6 : 활성 분석법은 CYP1A1에 대한 결과 / 1B1 활성 (A) 및 간 세포주 세기도 세포 기증자 (M360, M370, M417)에 CYP2A6 / 2A13 활성 (B). (A) - 루크 CEE 탈 알킬화 활성와 TCDD 의한 CYP1A1 / 1B1의 유발없이 나타낸다. α-naphthoflavone은 CYP1A1 / 1B1 억제제로서 사용 하였다. 활성 분 (최소)으로 배양 시간에 의해 정규화 된 상대 발광 단위 (RLU) 총 단백질 (㎎)으로 표현된다. 들은 항시 적으로 발현 될 때 (B) CYP2A6 / 2A13 유도를 필요로하지 않는다. pmol의 / 분 / mg의 단백질의 쿠마린 -7- 히드 록 실화 활성 억제제와 8 methoxypsor없이 다양한 시점에서 도시ALEN. 모든 결과는 평균의 표준 편차와 3 개 개의 독립적 인 측정의 평균 값으로 표시하고 있습니다. 이 수치는 박스터 (20)에서 수정되었습니다.
보충 표 1 : UPLC 및 질량 분석기 설정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
현재, 많은 표준화 된 독성 시험 시스템은 정상적인 인간의 신진 대사 하나의 대표하지 않습니다 엔지니어링 세균, 세포 선, 또는 배아 세포를 사용합니다. 이것은 화학 물질 또는 약의 잠재적 인 독성 활동의 부정확 한 예측으로 이어질 수 있습니다. 이러한 칩 3D 세포 배양 및 장기 등의 생체 외 모델의 혁신적인 개선 인체 조직 21, 22, 23의 일반적인 형태 및 대사 활성을 복제하기위한 시도로 개발되고있다. 대사 능력 모델이 가장 독성 약물 평가 및 연구에 적합한 생물 전환 된 해독하는데 사용될 수있는 하나 개의 기준이다.
우리는이 논문에서 설명했다 프로토콜은 살아있는 세포를 사용하여 CYP 효소의 활동을 측정하도록 설계되었습니다. 그것은 유연하고 2D 또는 3D이 배양 다른 전지 시스템에 사용할 수 있습니다ES와 luminogenic 프로브 - 또는 질량 분석 기반 접근 방식을 사용 할 수있는 옵션을 제공합니다. 두 가지 방법은 재료의 나노 그램 수량을 감지하고 만 다공 형태로 성장하는 소수의 세포를 필요로 할만큼 민감하다. 또한 회전 타원체에 적용 할 수 또는 세포는 복잡한 매트릭스에서 재배. 프로브 기판의 선택은 분명 프로토콜의 중요한 요소이다. 상기 분석의 특이성은 선택적 CYP 억제제의 사용에 의해 얻어 질 수 CYP 효소 보증 다른 층의 선택적 인 프로브에 의존한다. 기판 및이 문서에 나와 억제제는 몇 가지 예에 불과하지만, 다른 사람은 문헌에서 찾을 수 있습니다.
이 효소는 낮은 수준으로 발현되는 것에 기인 할 수있는 네거티브 CYP 활성 결과로서 새로운 세포 유형으로 작동 할 때 복수의 배양 시간을 고려하는 것이 중요하다. 양성 대조군으로 사용할 수있는 세포 유형의 추가한다는 보장하는 것이 바람직부정적인 결과는 기술적 인 문제에 어떤 문제 해결에 도움이 연결되지 않습니다. 주 간 세포가 대사 능력이 서스펜션 예를 차 간세포를 들어, 대조군으로 사용 할 수있는 것은 매우 쉽게 쓸 수 있지만 그들의 생존은 시간에 제한됩니다. 간 세포 라인이 프로토콜에 설명 된대로 사용하는 것이 상대적으로 용이 가능한 대안이지만, 일부는 신진 대사 활동 (6), (21)의 측면에서 다른 사람보다 더 낫다.
분석은 총 단백질 정량되지 않는 비 파괴적이기 때문에, 종 공부 (20)에 시간 경과 CYP 활성을 수행 할 수있다. 일부 세포는 배양 시간이 지남에 따라 변수 CYP 활동을하고 있기 때문에 이것은 중요한 포인트입니다. 음의 결과는 시험관 내에서 분화 또는 탈분화로 포화 상태의 부족, 진행과 연관 될 수 있습니다. 이 경우, 접근 방식은 반 quantitati입니다데이터는 각각의 세포 배양 물에서 단백질의 총량에 의해 정규화되지 않으므로했습니다. TCDD의 경우와 같이 조직에 대한 독성 효과를 가질 수있는 프로브, 억제제 또는 유도 물질에 대한 노출로 CYP 활성을 측정 한 후, 조직을 재사용하는 것이 불가능하거나 바람직하지 않습니다.
같은 마이크로 솜 같은 셀 분수는 주어진 세포 유형의 CYP 활동을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 미크로 제제는, 그러나, 셀 재 적절한 보조 인자의 첨가 많이 필요하고, 효소 활성을 유지하도록 버퍼. 살아있는 세포를 사용하여 까다로운 마이크로 좀의 준비 단계를 제거하고 버퍼링 공동 인자가 가장 잘 작동하는 운동.
일반적인 추천 정보로서, 추가로이 효소 활성과 일치하는지 확인하는 세포 배양에서 CYPs의 발현 프로파일을 특성화하기위한 가장 좋은 방법이다. 검증이 추가 레벨은 신진 대사 프로브는 enti되지 않습니다 주어진 권장단일 CYP 특정 의존하며 측정 된 대사 활성은 해당 효소의 발현에 의해 일치 증가 된 신뢰도를 제공한다. CYPs 멤브레인 단백질이기 때문에 그러므로 그들은 정량적 RT-PCR이 효소 20 프로파일에 바람직한 접근왔다 웨스턴 블랏을 준비하기 위해 상대적으로 어렵다.
이 프로토콜은 단지 하나의 중요한이라도 대사 효소 패밀리 중 하나를 나타내는 분석 CYP 효소 활성에 대한 방법을 설명하는 것이 중요하다. 질량 분광 분석 방법의 유연성은 프로브 기판의 다른 대사 변환에 대한 취득 방법의 개발을 허용한다. 그러나, 그것들은 한번에 하나씩 개발되어야 할 현재 공지 적은 특정 프로브 및 다른 대사 효소 군에 대한 선택적 억제제가있다. 이 격차는 체외 세포 등산용의 신진 대사 능력의 종합적인 평가를 할 수 있도록 해결해야MS.
Disclosures
AB와 EM이 원고 작성 당시 브리티쉬 아메리칸 토바코의 직원이었다. 이 논문에서 설명하는 작업은 브리티쉬 아메리칸 토바코에 의해 투자되었다,이 비디오 기사에 대한 출판 비용은 브리티쉬 아메리칸 토바코 지불했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent & Cells | |||
| 2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
| 5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
| 6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
| 6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
| 7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
| 7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
| 8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
| acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
| α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
| BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
| Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
| Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
| chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
| collagen | Cell Systems | 5005-B | |
| coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
| disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
| fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
| Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
| HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
| HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
| HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
| Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
| methanol | Fisher | M/4056/17 | |
| MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
| MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
| Phenomenex Kinetex 2.6 μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
| TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
| thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
| Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µm 2.1 x 50 mm | Waters | 86003538 | |
| Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UPLC | Waters | Acquity | |
| QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
| QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
| luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
| rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |
References
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