Summary
باستخدام محبة للدهون 1،1'- ديوكتاديسي -3،3،3 '، 3'-تيتراميثيليندوكاربوسيانين البركلورات (الجاذبة) تقنية تلطيخ، أمبيستوما ميكسيكانوم يمكن أن يخضع نضح الأوعية الدموية للسماح لتصور سهلة من الأوعية الدموية.
Abstract
وقد استخدمت تقنيات الإرواء لعدة قرون لتصور تداول الأنسجة. أكسولوتل (أمبيستوما ميكسيكانوم) هو نوع من السمندل الذي برز كنموذج أساسي لدراسات التجدد. لا يعرف إلا القليل عن كيفية إعادة التوعي يحدث في سياق التجدد في هذه الحيوانات. هنا نحن الإبلاغ عن طريقة بسيطة لتصور الأوعية الدموية في أكسولوتل عن طريق نضح من 1،1'-ديوكتاديسي 3،3،3 '، 3'-تيتراميثيليندوكاربوسيانين البيركلورات (الجاذبة). الجاذبة هو صبغ كاربوسيانين محبة للدهون التي تدرج في غشاء البلازما من الخلايا البطانية على الفور. يتم الإرواء باستخدام مضخة تحوي بحيث يدخل الجاذبة الدورة الدموية من خلال الشريان الأبهر. خلال نضح، وتدفق صبغ من خلال الأوعية الدموية أكسولوتل ودمجها في طبقة ثنائية الدهون من الخلايا البطانية الوعائية عند الاتصال. الإجراء نضح يستغرق حوالي ساعة واحدة لمدة 8 بوصة أكسولوتل. مباشرة بعد نضح وايث داي، و أكسولوتل يمكن تصور مع المجهر متحد البؤر الفلورسنت. ينبعث مؤشر الجاذب الضوئي الضوء في نطاق أحمر برتقالي عندما متحمس مع مرشح الفلورسنت الأخضر. هذا الإجراء نضح الجاذبة يمكن استخدامها لتصور بنية الأوعية الدموية من أكسولوتلس أو لإظهار أنماط إعادة التوعي في تجديد الأنسجة.
Introduction
تصور الأوعية الدموية يلعب دورا حيويا في فهم بنية ووظيفة الكائنات الحية عبر العديد من الأنواع. ابتداء من القرن ال 16 مع ليوناردو دا فينشي، وقد تم دراسة النماذج والرسوم البيانية من الدورة الدموية 1 . باستخدام الشمع والقوالب المطاطية، تم بيرفوسد الأنسجة لخلق نماذج ثلاثية الأبعاد من الأوعية الدموية، مما سمح لدراسة أورغانوجينيسيس والمرضية 1 ، 2 . تم تلوين الراتنجات والشمع مع الأصباغ مثل الهند الحبر أو القرمزي الأحمر للسماح لتصورها سهلة 1 ، 2 . ومع ذلك، تسببت هذه التقنيات العديد من القضايا لأن اللزوجة العالية منعت نضح كامل من الأنسجة من الفائدة 1 . كما أصبح الحقل أكثر تطورا، واستخدام المجاهر متحد البؤر والإلكترون دخلت حيز اللعب، ونقل تيشنيق نضح إيس بعيدا عن قوالب الزهر نحو بيرفوسيونس السائل من الأوعية الدموية، وبعضها سمح للنضح والتصوير من الأوعية الدموية دون تدمير الأنسجة الأولية 3 . دي، صبغ كاربوسيانين الفلورسنت، هو واحد من مثل وصمة عار الذي يسمح لنضح الحيوانات دون الأضرار التي لحقت أنسجة الأوعية الدموية.
الأصباغ كاربوسيانين هي الأصباغ محبة للدهون التي تدمج في أغشية الخلايا عند الاتصال. هذه الأصباغ تسمح لتلطيخ سهلة وحظية من الخلايا البطانية الوعائية، والتي يمكن بعد ذلك أن ينظر إليها تحت المجهر متحد البؤر الفلورسنت. تتحرك الجاذبة عن طريق الانتشار الجانبي في غشاء الدهون من الخلايا، كما هو مبين في وضع العلامات وتعقب الخلايا العصبية 4 . كيميائيا، وسلاسل ألكيل اثنين من الجاذبة تعطي الصبغة تقارب عالية لأغشية الخلايا، في حين أن اثنين من حلقات مترافق من فلوريوكروم الذي هو المسؤول عن انبعاث الطول الموجي الأحمر عندما متحمس من الفلورسنت الضوء الأخضر مرشحات> 4. وقد استخدمت الجاذبة في العديد من القدرات، بما في ذلك وضع العلامات الناجحة للغشاء البلازما وعلى حد سواء أنتيروغريد والوراء إلى الوراء في الخلايا العصبية 5 ، 6 . وقد استخدمت سابقا الجاذبة في بروتوكولات نضح في حين تصور الأوعية الدموية من الفئران 7 .
أكسولوتلس ( أمبيستوما ميكسيكانوم ) هي السلمندرات التي تعيش حصرا في البحيرات المالحة بالقرب من مكسيكو سيتي، المكسيك. وقد أصبحت هذه الحيوانات نموذجا هاما لفهم عمليات التجدد لأنها يمكن أن تجدد أطرافه الكاملة والذيل (بما في ذلك الحبل العصبي)، وأجزاء من القلب والأعضاء الداخلية الأخرى، وأجزاء من العين والبالغين 8 ، 9 . بالإضافة إلى ذلك، مع التطبيق الأخير من الأدوات الجينية في أكسولوتلس، نظرة غير مسبوقة في الجزيئات والخلايا التي تقود هذه العمليات من الممكن الآن 8 . نجاح ريجينالتموينية من طرف كامل يتطلب عملية إعادة التوعي واسعة النطاق، والتي قد تلعب دورا هاما في تجديد بعد مجرد الوظائف التقليدية للأوعية الدموية في توفير الأكسجين والمواد المغذية. فهم إعادة التوعي في سياق تجديد الأنسجة أمر حتمي. وقد سبق تصور الأوعية الدموية أكسولوتل باستخدام الهند الحبر، وبينما كانت النتائج مثيرة للاهتمام، لم يتم إعادة النظر في هذه العملية في العقود اللاحقة 10 . سعينا إلى تكييف بروتوكول نضح الجاذبة وضعت لاستخدامها في الثدييات للسماح لنضح كاملة والتصور من الأوعية الدموية أكسولوتل 7 . يصف هذا البروتوكول الخطوات التي اتخذت لإرواء بنجاح وبعد ذلك تصور الدورة الدموية أكسولوتل مع تقنية تلطيخ الجاذبة. هذا الإجراء سوف يسمح لتصور دقيق من الأوعية الدموية براءات الاختراع في الأنسجة التماثل، وكذلك في تجديد الأنسجة، ويوفر طريقة جديدة ل فيسواليزاتيون وتحليل عملية إعادة التوعي في أكسولوتل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع التجارب أكسيولوتل وفقا ل بريغهام ومستشفى المرأة (بو) المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة.
1. إعداد تجربة الإرواء
- وضع أكسولوتل الكبار في حاوية بلاستيكية مليئة 0.1٪ تريكين حل (MS222) لمدة 15-20 دقيقة أو حتى تخدير تماما. تأكد من أن الحاوية مليئة ما يكفي من محلول تريكين بحيث يتم المغمورة تماما أكسولوتل.
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان المؤسسية. في بو، يعتبر أكسولوتل تخدير كامل عندما يفشل اختبار قرصة القدم، وهذا يعني أنه لا يوجد حركة الانعكاسية عندما يتم تقلص القدم بلطف.
الحذر: على الرغم من تريكين هو مخدر تستخدم خصيصا للكائنات المائية، وينبغي تجنب ملامسة الجلد مباشرة مع الحل تريكين. - إعداد محطة نضح أكسولوتل.
- ضع الوسادة ماصة على شقة، سطح مستو مع الجانب ماص مواجهة.
- قطع حفرة في إطار رغوة البوليسترين الذي هو الحجم المناسب والشكل ل أكسولوتل تخدير لوضعها في موقف ضعيف. وضع الإطار على وسادة ماصة.
ملاحظة: يمكن وضع بعض المناشف الورقية الإضافية مباشرة تحت الإطار لمزيد من الامتصاصية. - تحميل مضخة تحوي مع أنابيب نضح. تعيين المضخة إلى معدل تدفق 0.7 مل / دقيقة، وتتدفق في اتجاه عقارب الساعة.
- جعل الحل المخفف مع برنامج تلفزيوني 0.7x و 5٪ الجلوكوز في خليط 1: 4.
- مزيج 10 مل من محلول مخفف مع 200 ميكرولتر من حل الأسهم ديي في أنبوب مخروطي 50 مل. كاب ومزيج من انعكاس. تغطية هذا الأنبوب مع رقائق الألومنيوم ورقة لحماية حل العمل من التعرض للضوء.
ملاحظة: يجب تغيير الأحجام وفقا لحجم أكسولوتل نسبيا. هذه القيم هي حوالي 15 سم أكسولوتل (طول الذيل إلى الذيل). انيمالس من هذا الحجم قد لا تكون قد وصلت إلى النضج الجنسي الكامل حتى الجنس الحيوان قد لا يتم تحديدها في هذا الوقت. - ملء أنبوب مخروطي 50 مل مع برنامج تلفزيوني 0.7x.
ملاحظة: سيتم استخدام برنامج تلفزيوني لتشكيل الحلقة و إكسولانغيناتيون أكسولوتل. - نعلق إبرة فراشة 27 قياس إلى نهاية خروج أنابيب نضح. أضعاف أجنحة فراشة على بعضها البعض ومكان في موقف المشبك.
- وضع نهاية حرة من أنابيب نضح في أنبوب مخروطي 50 مل مليئة برنامج تلفزيوني 0.7X وتشغيل مضخة نضح حتى يتم تعبئة كامل أنابيب مع الحل. وقفة المضخة مرة واحدة يتم ملء أنابيب بأكملها مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: تأكد من أنابيب خالية من فقاعات الهواء في جميع الأوقات، وهذه سوف تسبب صمة الهواء في أكسولوتل ومنع نضح الكامل. - وضع منشفة ورقية في العفن على شكل أكسولوتل في إطار رغوة البوليسترين. باستخدام ماصة نقل، نقع منشفة مع الحل تريكين.
ملاحظة: قطع مربع صغير في منتصف سحب الورقإل للسماح لتصريف السوائل أثناء إجراء التروية. - وضع مستحلب أكسولوتل مستلق على منشفة ورقية داخل إطار رغوة البوليسترين.
2. فتح الصدر أكسولوتل
- استخدام ملقط الجراحية لقرصة الجلد على طول المحور المركزي للصدر أكسولوتل، فقط تحت خط الكتفين. اسحب.
- استخدام مشرط لجعل شق صغير حيث تم سحب الجلد.
- إزالة التصحيح مربع من الجلد على صدره من أجل الكشف عن اثنين من لوحات الغضروف.
- إزالة الجلد لفتح نافذة على التجويف الصدري كبيرة بما فيه الكفاية لرؤية بوضوح القلب وحوالي 5 ملم من الشريان الأورطي المتفرعة من القلب.
- تمزيق الأنسجة الضامة بعناية باستخدام ملقط أو مقص مغلقة من أجل تجنب قطع أي الأوعية الدموية الرئيسية.
- رفع كل لوحة الغضروف بشكل فردي باستخدام ملقط ومكوس لهم ثإيث مقص جراحي.
- قرصة بعناية التامور مع ملقط، سحب ما يصل، وثقب ذلك باستخدام مقص جراحي. وينبغي أن يكون هذا شق عميق فقط بما فيه الكفاية لثقب التامور رقيقة جدا، وينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي للسماح لإزالة التامور. الحرص على عدم قطع القلب.
- إزالة بدقة التامور لفضح القلب والشريان الأبهر.
ملاحظة: باستخدام ماصة نقل، دافق بشكل دوري تجويف الصدر والخياشيم مع حل تريكين للحفاظ على المنطقة واضحة والحفاظ على تخدير أكسولوتل.
3. إرواء أكسولوتل
- وضع موقف المشبك مع إبرة فراشة تحميل بجانب إطار رغوة البوليسترين، بحيث يمكن بسهولة التلاعب في ذراع المشبك لإدراج الإبرة في الشريان الأبهر أكسولوتل. نقطة طرف الإبرة نحو الجانب منقاري من الحيوان خلال الإدراج والحفاظ على موازية الإبرة إلى الشريان الأبهر لتجنب ثقب ذلك من خلال المرجعبوسيت الجانب.
- بدوره على مضخة تحوي. وينبغي أن يستمر برنامج تلفزيوني 0.7X في التدفق من خلال الأنابيب.
- إدراج الإبرة في الشريان الأبهر.
- حرك الملقط تحت القوس الأبهر وسحب ما يصل قليلا للسماح لسهولة الوصول إليها.
- مناورة مجموعة إبرة المشبك مثل أن الإبرة يمتد على طول الشريان الأبهر، لافتا نحو الرأس. إدراج الإبرة أثناء استخدام ملقط للدعم وراء الشريان الأبهر.
ملاحظة: يجب إدراج إبرة عميقة بما فيه الكفاية في الشريان الأورطي للتأكد من أنها لن تنزلق خلال نضح. قد يكون هذا حوالي 5 ملم ل 15 سم أكسولوتل. تأكد من أن الإبرة هو تماما في خط مع الشريان الأبهر لتجنب ثقب كامل من السفينة. من خلال-- من خلال-- ثقب من خلال يمكن أن يسبب نزيف هائل ونقصان معدلات نجاح نضح. يمكن تأكيد الإدراج الناجح عن طريق توسيع مرئية من أتريا القلب.
- بسرعة تمزيق أتريوم واحد مع الخيال العلميسسورس والسماح الدم لاستنزاف.
- دافق مع حل تريكين لمنع تراكم الدم وتشكل الجلطة في تجويف الصدر.
- يروي أكسولوتل مع حوالي 20-30 مل من برنامج تلفزيوني. الحيوان يجب أن تتغير من الضوء الوردي في اللون إلى الأبيض في نضح ناجحة.
- وقفة مضخة تحوي ونقل نهاية خالية من الأنابيب في أنبوب 15 مل من حل الجاذبة. إعادة تشغيل المضخة، ورعاية لتجنب خلق أي فقاعات الهواء في الأنابيب.
- يروي أكسولوتل مع الأسهم العمل بأكمله من الجاذبة.
ملاحظة: في نضح ناجحة، و أكسولوتل مع تغيير اللون إلى الوردي مشرق من الجاذبة. وهذا سيكون أكثر وضوحا في الخياشيم. - وقفة مضخة بعد نضح مع الجاذبة كاملة ووضع نهاية حرة من الأنابيب إلى 4٪ بارافورمالدهيد (بفا) حل لإصلاح الأنسجة. إعادة تشغيل مضخة وإرواء لا يقل عن 10 مل من بفا.
الحذر: بفا هو سامة ويجب التعامل معها و ديسبوسيد من المناسب. يجب ارتداء القفازات ونظارات السلامة، ويجب أن تكون الحلول داخل غطاء الدخان. إرواء من أكسولوتل مع بفا لإصلاح نتائج الأنسجة في وفاة الحيوان.
4. إنهاء الإرواء والتصور التحضير
- وقف مضخة تحوي وإزالة الإبرة من الشريان الأبهر أكسولوتل.
- وضع أكسولوتل على لوحة من البلاستيك.
ملاحظة: استخدام نصف طبق بتري كبير يعمل بشكل جيد ويسمح لصب كمية صغيرة من تريكين أو برنامج تلفزيوني على أكسولوتل للحفاظ على بشرتها الرطب وتحسين جودة التصور. - تخلص من جميع المواد المستخدمة في صناديق النفايات المناسبة. تنظيف الأدوات الجراحية مع الايثانول 70٪، وتطهير باستخدام معقم الزجاج حبة بين الحيوانات، وتعقيم عن طريق التعقيم بعد الإجراء. تدفق أنابيب مع الحل بس ومن ثم استنزاف، تجف تماما، وتخزين لمزيد من الاستخدام.
5. التصور بيرفوسد أكسولوتل
ملاحظة: للحصول على صورة ذات جودة عالية، يمكن استخدام المعلمات التالية: التعرض ل 1.1 ثانية، وكسب 1X، والتشبع من 1.0، والتكبير 2X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مع تلطيخ الجاذبة، والأوعية الدموية من أكسولوتل يمكن تصور بسهولة. الأوعية الدموية من الحيوانات بيرفوسد مع صبغ محبة للدهون هي مرئية على الفور تحت المجهر متحد البؤر الفلورسنت. الشكل 1-1-1.5 هو تمثيل تخطيطي لبروتوكول نضح. بعد نضح مع صبغ وردي مشرق، سوف بيرفوسد بيرفوسد بنجاح تظهر الوردي. باستخدام مرشح الفلورسنت الأخضر على المجهر متحد البؤر سوف تظهر الانبعاثات الحمراء للشبكة الأوعية الدموية. يحدث تلطيخ الجاذبة في جميع أنسجة الجسم عندما نضح ناجحا، بما في ذلك الذيل، وأطرافه، والخياشيم، والعينين ( الشكل 2A ، الشكل 2B ، الشكل 2C ، 2D الشكل ، على التوالي). يؤدي الإهمال غير الناجحة إلى نقص الأوعية الدموية الملطخة باللون الأحمر أو في تلطيخ غير مكتمل للأوعية.
نتنت "فو: كيب-together.within-بادج =" 1 ">
الشكل 1: تخطيطي للبروتوكول نضح. أكسولوتلس بنجاح بيرفوسد مع صبغ محبة للدهون، الجاذبة، وإظهار تلطيخ كامل من الأوعية الدموية عند التصوير. 1: مستلق كامل أكسولوتل قبل تجربة نضح. 2: فتح الصدر من أكسولوتل. 2: أكسولوتل مع تجويف الصدر مفتوحة. 3: إدراج 27 G فراشة إبرة في الشريان الأبهر من أكسولوتل. 4: يجب أن تحتوي الأنابيب أولا 0.7X برنامج تلفزيوني، ثم حل العمل الجاذبة، وأخيرا بفا 4٪. 5: بيرفوسد تماما أكولوتلس تظهر الوردي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور من أكسولو بيرفوسد تماماليرة تركية. تم التقاط صور من الأوعية الدموية أكسولوتل باستخدام المجهر مبائر الفلورسنت بعد نجاح نضح مع وصمة عار الجاذبة. 2A: الذيل. 2B: قدم. 2C: الخياشيم. 2D: العين. ويتم التصوير باستخدام المجهر متحد البؤر مع الأخضر الفلورسنت مرشح الانبعاثات مكعب. التكبير للصور A، B، C، و D، هي 1.74X، 2.16X، 1.18X، و 5.69X، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التصور من الأوعية الدموية من أكسولوتل يمكن أن يتحقق بنجاح عن طريق نضح مع صبغ كاربوسيانين محبة للدهون، الجاذبة. في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكول رواية لنضح من أكسولوتل مع الجاذبة باستخدام مضخة تحوي. وتبين لنا أيضا التصور اللاحق من الأوعية الدموية أكسولوتل باستخدام المجهر متحد البؤر الفلورسنت. وكان هذا البروتوكول التكيف من القوارض بروتوكول نضح الجاذب ينظر في لي وآخرون. 7 ، ولكن الاختلافات الرئيسية بين القوارض و أكسولوتل يتطلب تنقيح البروتوكول لتناسب نموذج أكسولوتل.
هذه الدراسة يناقش طريقة نضح الجاذبة من أكسولوتل من أجل تصور بنجاح الأوعية الدموية. الاختلافات في علم التشريح وعلم وظائف الأعضاء بين السمندل والقوارض تغيرات الطلب في الجوانب الرئيسية للنضح، بما في ذلك موقع إدخال الإبرة، وطريقة نضح، والكواشف المستخدمة. من أجل أتشإيفي نضح ناجحة، نحن محدودة الأضرار التي لحقت الأوعية الدموية من أكسولوتل. في حين فتح تجويف الصدر، اتخذت الرعاية للكشف عن القلب والشريان الأورطي تماما مع تجنب أي ضرر أو تمزقات الأوعية الدموية الرئيسية. الحد من استخدام المقص الجراحي منعت قطع عرضي من السفن الرئيسية في حين شقوق صغيرة الحفاظ على السيطرة على التعرض للقلب والشريان الأبهر. كما زادت معدلات نجاح بيرفوسيونس عندما تم إدخال إبرة الجاذبة من خلال الشريان الأبهر، وليس مباشرة إلى غرف القلب. و أكسولوتل، على عكس الماوس، لديه ثلاثة غرف غرف، تحتوي على بطين واحد فقط مع أقل بكثير من العضلات من الماوس. وبسبب هذه الاختلافات، كان يجب أن يتم نقل موقع إدخال الإبرة إلى الشريان الأورطي أكثر استقرارا. تم تحديد الشريان الأورطي ليكون الموقع الأمثل لإدراج إبرة نضح كما أنها كبيرة بما يكفي لثقب من قبل إبرة 27 G ولها حركة محدودة. وكانت الحركة إلى أدنى حدإيز من أجل تجنب إزالة عرضي أو الانزلاق من إبرة نضح أو من خلال و من خلال ثقب الشريان الأبهر. أثبتت عمليات الإيقاع القلبي باستخدام البطين كنقطة الإدراج أن معدل نجاحه أقل بكثير من معدل الإصابة بقسم الشريان الأورطي. ثقب خاطئ من الأوعية الدموية غالبا ما أدى إلى تشكيل صمات أو منع نضح، مما أدى إلى معدلات منخفضة جدا من الوسم الناجحة الأوعية الدموية. باستخدام حامل المشبك لعقد إبرة فراشة خلال نضح، ونحن قد انخفض حركتها، وبالتالي زيادة معدل الإيقاع ناجحة. بالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلك إلى حساسية الأنسجة أكسولوتل، بالمقارنة مع الماوس، كانت مضخة نضح تحوي اللازمة، على عكس نضح اليدوي المستخدمة سابقا. استخدام هذه المضخة يسمح لنهج حر اليدين لنضح أكسولوتل للحد من ثقب خاطئة من الأنسجة الرقيقة. لم تنجح العطاءات لعدة أسباب إضافية، بما في ذلك من خلال ومن خلال بونكتأور، تخثر، والانسداد. في حالة إدراج الإبرة في الشريان الأورطي وثقب ثان تم إنشاؤه من خلال الجدار الخلفي، فإن حل الجاذبة يتدفق مباشرة في تجويف الصدر بدلا من المرور عبر الدورة الدموية النظامية. بالإضافة إلى ذلك، بمجرد خروج الدم من الأوعية الدموية، وسرعان ما شكلت جلطة دموية التي يمكن أن تعرقل نضح. يمكن أن تشكل الجلطات والفقاعات الهوائية أيضا في الأوعية الدموية، مما تسبب في الصمات التي تحول دون نضح ناجحة. وأخيرا، فإن هذا البروتوكول دمج الكواشف تعديلها لتناسب الأسمولية أكسولوتل، والذي يختلف كثيرا عن ذلك من الثدييات. التكيف من هذا البروتوكول والتغيرات الهامة التي أدخلت لتناسب نموذج أكسولوتل سيساعد في السعي لفهم عملية إعادة التوعي من الأنسجة أثناء التجديد.
دي، وهو الوردي في اللون، سوف يروي الحيوان وتعطيه هوى الوردي مشرق. أصبح بيرفوسد بنجاح أكولوتلز الوردي مشرق إلى بالعين المجردة، مع درجة عاليةالمناطق الأوعية الدموية تظهر أكثر ملطخة بشكل مكثف. الحيوانات بيرفوسد ينظر مع المجهر متحد البؤر الفلورسنت باستخدام مرشح الأخضر يمكن تصور في الطيف الانبعاثات الأحمر والبرتقالي. كان أفضل تصور الأوعية الدموية في أنسجة أرق التي تقلل من تلطيخ الجاذبة عرضية من الأنسجة غير الأوعية الدموية. إرواء الأنسجة مع 4٪ بارافورمالدهيد (بفا) فورا بعد نضح الجاذبة ينبغي أن يتم لإصلاح الأنسجة.
ديفوسيونس الجاذبة هي نهاية نقطة التجارب ل أكسولوتل. خلال هذا الإجراء، يتم استنزاف كل من دم الحيوان بشكل فعال واستبداله مع برنامج تلفزيوني 0.7X، تليها فورا حل الجاذبة، وأخيرا 4٪ بفا. وهذا يعطل قدرة أكسولوتل على الانخراط في العمل الحيوي من تبادل الغاز ويفقد القدرة على أكسجين أنسجة الجسم. ونظرا لهذه الطبيعة نقطة نهاية، كل نضح يلتقط فقط نقطة واحدة من نمو الأوعية الدموية، والحيوان لا يمكن أن يكون بيرفوسد أبعد في وقت لاحق. بسبب هذا الوقت-ليميعامل تينغ، يجب أن تستخدم الحيوانات متعددة من أجل وصف مسار الزمن لتطوير الأوعية الدموية.
هذا بروتوكول الجاذبة، والتعديلات المطبقة لتحسينه، ويمكن استخدامها لتسمية بنجاح وتصور الأوعية الدموية من أكسولوتل. منذ أكسولوتل هو كائن نموذج أساسي لدراسة التجدد، والروائح ناجحة تفتح فرصا لاستجواب عملية الأوعية الدموية خلال التجديد. و أكسولوتل هو كائن نموذج لدراسة التجدد لأنه حيوان نيوتنوس وبالتالي يحتفظ قدرة ملحوظة لتجديد طوال سن البلوغ 8 . عملية إعادة التوعي من الأنسجة تجديد، ومع ذلك، ليست مفهومة جيدا، وبالتالي التكيف من نضح الجاذبة لنظام أكسولوتل يوفر فرصا لفهم التجدد التي لم تكن متوفرة مع نموذج الثدييات. نضح من أكسولوتل باستخدام الجاذبة هو تقنية جديدة لدراسة ريفاسكولاريزاتيون من الأنسجة تجديد في هذا النموذج الحيوان، وبالتالي، يمكن استخدام هذا البروتوكول كذلك لفهم أورغانوجينيسيس خلال التنمية وأوعية الدموية أثناء المرض، وكذلك أن تستخدم كأداة هامة أثناء دراسة التجديد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من قبل مستشفى بريغهام والمرأة ومارس دايمس. ويود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء مختبر وايتيد على دعمهم ومشورتهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
References
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
