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Bioengineering

Glycoengineering metabolica di acido sialico utilizzando N-acil-per volta Mannosamines

Published: November 25, 2017 doi: 10.3791/55746
Automatic Translation
1,2, 3
1Max von Pettenkofer-Institut & Genzentrum, Virologie, Nationales Referenzzentrum für Retroviren, Medizinische Fakultät, LMU München, 2Institut für Laboratoriumsmedizin, klinische Chemie und Pathobiochemie, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Institut für Physiologische Chemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Summary

Acido sialico è una tipica unità di monosaccaride trovata nei glycoconjugates. È coinvolto in una pletora di interazioni cellulari e molecolari. Qui presentiamo un metodo per modificare l'espressione di superficie acido sialico cellulare utilizzando glycoengineering metabolica con N- monosaccaridico derivati.

Abstract

Acido sialico (Sia) è un costituente importante di glicoconiugati, quali N- e O- glicani o glicolipidi. Grazie alla sua posizione presso le estremità non riducente di oligo - e polisaccaridi, come pure le sue caratteristiche chimiche uniche, acido sialico è coinvolto in una moltitudine di interazioni recettore-ligando diverso. Modificando l'espressione di acido sialico sulla superficie delle cellule, interazioni acido sialico-dipendente di conseguenza saranno influenzati. Questo può essere utile per indagare le interazioni acido sialico-dipendente e ha il potenziale per influenzare determinate malattie in modo benefico. Via metabolica glycoengineering (MGE), l'espressione di acido sialico sulla superficie delle cellule può essere modulata. Nel presente documento, cellule, tessuti o addirittura interi animali sono trattati con derivati C2-modificati del N- monosaccaridico (ManNAc). Questi zuccheri amminici fungere da molecole di acido sialico precursore e pertanto sono metabolizzati della corrispondente specie di acido sialico ed espressi sulla glycoconjugates. L'applicazione di questo metodo produce effetti intriganti su vari processi biologici. Ad esempio, e può drasticamente ridurre l'espressione di acido polisialico (polySia) in cellule di un neurone trattate e quindi colpisce differenziazione e crescita neuronale. Qui, indichiamo la sintesi chimica di due dei più comuni C2-modificato N- acilmannosammina derivati, N- propionylmannosamine (ManNProp) così come N- butanoylmannosamine (ManNBut) e ulteriormente mostrano come questi non-naturali aminici possono essere applicati in esperimenti della coltura cellulare. L'espressione di acido sialico modificato specie è quantificata mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e ulteriormente analizzato tramite spettrometria di massa. Gli effetti sull'espressione acido polisialico sono chiariti tramite Western blot usando un anticorpo acido polisialico commercialmente disponibili.

Introduction

Acido sialico è un monosaccaride che è reperibile in genere le estremità non riducente dei glicoconiugati, quali N- e O- glicani o glicolipidi. Tra tutti i monosaccaridi, acido sialico ha alcune caratteristiche chimiche uniche. Ha una spina dorsale C-atomo 9, un gruppo carbossilico in posizione C-1, che è deprotonato e quindi negativamente caricate sotto condizioni fisiologiche e una funzione amminica nella posizione C-5. Anche se oltre 50 varianti di acido sialico naturali sono stati caratterizzati a data1, la forma predominante di acido sialico trovato in esseri umani è acido N- acetilneuraminico (Neu5Ac). Altri mammiferi anche esprimono una maggiore quantità di N- glycolylneuraminic acido (Neu5Gc)2,3.

Grazie alla sua posizione esposta nei glycoconjugates, acido sialico è coinvolto in una pletora di interazioni recettore-ligando, ad esempio, l'associazione dipendente emagglutinina del virus dell'influenza a host cellule4. Un epitopo di acido sialico con importanti funzioni biologiche, soprattutto durante l'embriogenesi e nel sistema nervoso, è l'acido polisialico. Acido polisialico è un polimero di fino a 200 2,8-collegato sialico acidi alfa. Il vettore di proteina principale di acido polisialico è la molecola di adesione neurale delle cellule (NCAM). Espressione di acido polisialico modula le proprietà adesive di NCAM in quanto espressione acido polisialico diminuisce l'adesione e aumenta la plasticità con il sistema nervoso5.

Cambiamenti nell'espressione di acido sialico (poli) influirà in definitiva una moltitudine di interazioni biologiche diverse. Questo può essere utilizzato per studiare processi dipendenti noto acido sialico a livello molecolare, per scoprire nuovi glicoconiugati interazioni, o esplorare i possibili approcci terapeutici. Ci sono diversi metodi disponibili da cui l'espressione di acido sialico sulla superficie delle cellule può essere modulata, ad esempio il trattamento con acido sialico specifiche glicosidasi (sialidasi), inibizione di enzimi coinvolti nella biosintesi di acido sialico6 ,7,8, o di abbattere o cambiare l'espressione dell'enzima chiave della biosintesi di acido sialico9.

Un altro metodo versatile per modulare l'espressione di acido sialico è MGE (ingegneria conosciuto anche come metabolica oligosaccaride, MOE). Nel presente documento, cellule, tessuti o anche gli animali sono trattati con derivati non naturali della ManNAc che recano modifiche C2-amminico. Essendo molecole precursori dell'acido sialico, dopo l'assorbimento cellulare, questi analoghi ManNAc sono unidirezionale metabolizzato a non naturali sialico acidi e possono essere espressa su sialilato glicoconiugati. Le cellule trattate con derivati di ManNAc portando alifatiche C2-modifiche, come ManNProp o ManNBut, incorporare N- propionylneuraminic (Neu5Prop) o N- butanoylneuraminic acido (Neu5But) nel loro glicoconiugati10 , 11. utilizzando gruppi funzionali introdotti alla C2-posizione della ManNAc, gli acidi di sialico non naturali che si verificano possono essere accoppiati, per esempio, tramite la legatura di Staudinger o l'azide alkine cicloaddizione, con le tinture fluorescenti e pertanto visualizzate sulla superficie delle cellule12.

L'espressione di questi acidi sialici non naturali ha intriganti effetti su molti processi biologici, tra cui infezioni da agenti patogeni, l'adesione e la migrazione di cellule tumorali, adesione cellulare generale, come pure vascolarizzazione e differenziazione (per revisione vedere: Wratil et al. 13). interessante, MGE con N-acil per volta mannosamines può essere utilizzato anche per interferire con l'espressione di acido polisialico. Acido polisialico è generato da due differenti polysialyltransferases (ST8SiaII e ST8SiaIV). È stato dimostrato, che polysialyltransferase ST8SiaII è inibita da precursori di acido sialico innaturali, come ad esempio ManNProp o ManNBut14,15. Inoltre, è stato dimostrato in cellule umane di neuroblastoma che ManNProp o ManNBut applicazione riduce anche sialylation in totale15.

MGE con N-acil per volta mannosamines è un facile da applicare il metodo che è stato utilizzato con successo, non solo in coltura delle cellule dei batteri ma anche nell'intero animali di specie diverse, ad esempio Caenorhabditis elegans16e mammiferi zebrafish17, o topi18,19,20,21. Soprattutto i derivati di ManNAc recanti modifiche alifatiche, compreso ManNProp e ManNBut, sono modo trascurabile citotossici, anche alle concentrazioni millimolar in terreno di coltura delle cellule o plasma sanguigno. Inoltre, sono relativamente facili da sintetizzare.

Qui, forniamo i dettagli su come utilizzare MGE con N-acetile per volta mannosamines. In primo luogo, la sintesi chimica di due dei derivati ManNAc più ampiamente usati in questo campo, ManNProp e ManNBut, è spiegata. Successivamente, vi mostriamo come MGE può essere applicata in un esperimento in vivo . Ad esempio, la linea cellulare di neuroblastoma Kelly è stato scelto per dimostrare la diminuita espressione dell'epitopo polisialico mediante Western blot dopo il trattamento con i derivati di ManNAc. Gli acidi sialici non naturali sulla superficie delle cellule sono stati quantificati da HPLC e ulteriormente analizzati tramite spettrometria di massa.

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Protocol

1. preparazione dei tamponi e reagenti

  1. Preparazione della soluzione di idrossido di sodio 3 mM
    1. Sciogliere metossido di sodio 8,1 mg in 50 mL di metanolo (3 mM) in una bottiglia di vetro 100ml con un'ancoretta. Conservare a temperatura ambiente (TA) per diverse settimane.
  2. Preparazione del tampone Tris-HCl
    1. Combinare 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl e 146 mg EDTA in un flacone di vetro da 100 mL con un'ancoretta e sciogliere in 80 mL di acqua.
    2. Aggiungere alla soluzione mescolando, idrossido di sodio (1 M, in acqua) o HCl (20%, in acqua) rispettando il pH con un pH-metro e regolare il pH a 8.0.
    3. Aggiungere il volume di acqua necessaria per ottenere un volume finale di 100 mL. Filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtro sterile da 0,22 µm.
      Nota: 100 mL di Tris-HCl buffer conterrà 150 mM NaCl, Tris-HCl 10 mM e 5 mM EDTA (pH 8.0). La soluzione può essere conservata a 4 ° C per diverse settimane.
  3. Preparazione della soluzione di aprotinina
    1. Sciogliere aprotinina 10 mg in 1 mL di acqua (1,54 millimetri). Aliquota della soluzione di aprotinina in 10 x 1,5 mL-plastica tubi (100 µ l). Conservare a-20 ° C per diverse settimane.
  4. Preparazione della soluzione leupeptina
    1. Sciogliere leupeptina 10 mg in 2 mL di acqua (10 mM). Aliquotare la soluzione leupeptina 10 x 1,5 mL-plastica tubi. Conservare a-20 ° C per diverse settimane.
  5. Preparazione della soluzione di fluoruro (PMSF) phenylmethylsulfonyl
    1. Sciogliere 34,8 mg PMSF in 2 mL di etanolo (100 mM). Aliquota della soluzione PMSF in 10 x 1,5 mL-plastica tubi. Conservare a-20 ° C per diverse settimane.
  6. Preparazione della soluzione di 1,2-diamino-4,5-methyldioxybenzol-dicloridrato (DMB)
    1. Combinare 15,62 mg DMB, 352 µ l β-mercaptoetanolo e 48 µ l sodio bisolfito-soluzione (39%) e aggiungere acqua mL 9,6 (6,9 mM DMB, 500mm β-mercaptoetanolo e 0,19% sodio bisolfito). Aliquota della soluzione DMB in 40 x 1,5 mL-plastica tubi (250 µ l). Conservare al riparo dalla luce a-20 ° C per diverse settimane.
  7. Preparazione 1 M trifluoroacetico (TFA) di soluzione di acido
    1. 770.3 µ l di 100% TFA a 9,23 mL di acqua in un tubo di plastica da 15 mL (1 M). Conservare a 4 ° C per diverse settimane.
  8. Preparazione della soluzione TFA 120 mM
    1. µ L 92,4 TFA (100%) a 9,91 mL di acqua (120 mM) in un tubo di plastica da 15 mL. Conservare a 4 ° C per diverse settimane.
  9. Preparazione della soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 400 mM
    1. Sciogliere 160 mg di NaOH in 10 mL di acqua (400 mM) in un tubo di plastica da 15 mL. Conservare a 4 ° C per diverse settimane.
  10. Preparazione del tampone di lisi di Western blot
    1. Sciogliere 5,84 g NaCl, 0,1 g Tris (idrossimetil)-aminomethan (Tris), 0,1 g CaCl2, 0,95 g MgCl2e 1 g Triton-X100 in 100 mL di acqua e regolare il pH a 7,8. Conservare a 4 ° C. Aggiungere 100 µ l di ogni inibitore di proteasi (aprotinina, leupeptina e PMSF) prima di utilizzare il buffer di lisi.
  11. Preparazione del buffer di sodio dodecil solfato del gel di poliacrilammide elettroforesi (SDS-PAGE)
    1. Sciogliere 0,3 g Tris, glicina 1,5 g e 0,1 g SDS in 100 mL di acqua e regolare il pH a 7,3. Conservare a RT.
  12. Preparazione del buffer di Western blot
    1. Sciogliere 0,3 g Tris, glicina 1,1 g in 90 mL di acqua e aggiungere 10 mL di etanolo. Conservare a RT.
  13. Preparazione della soluzione di blocco
    1. Sciogliere 1 g di potere di grasso del latte gratis in salino di 25 mL tamponato fosfato (PBS). Sempre preparare fresco.

2. sintesi di ManNProp e correlati N-acil-per volta Mannosamines

  1. Sciogliere mg 431,2 mannosammina cloridrato in soluzione di idrossido di sodio 3 mM 10 mL in una bottiglia di vetro 50ml con un'ancoretta.
  2. Raffreddare la miscela sul ghiaccio a 0 ° C. Per la soluzione di agitazione, aggiungere lentamente goccia a goccia 210 µ l propionil cloruro (2,4 mmol), o 248 µ l butanoil (2,4 mmol) di sintetizzare ManNProp o ManNBut, rispettivamente. Incubare la miscela agitazione a 0 ° C per 4 h.
  3. Trasferire la soluzione in un tubo di plastica da 50 mL. Poke 4-8 fori nel coperchio del tubo di plastica con un ago sottile. Congelare rapidamente la soluzione usando azoto liquido e successivamente lyophilize (congelamento a secco) e per 48 ore o fino a quando non si è completamente asciugata.
  4. 350 g gel di silice 60 si mescolano 750ml etil-acetato/metanolo/acqua (15:2:1) (si tratta di una sospensione). Riempire una colonna di vetro (35 mm di diametro e 70 cm di lunghezza) con la sospensione di gel di silice 60 e lavare la colonna preparata con un ulteriore 100 mL etil-acetato/metanolo/acqua (15:2:1) prima dell'uso.
  5. Sciogliere i secchi prodotti dal passaggio 2.3 (5g essiccato prodotto) in 10 mL di etil-acetato/metanolo/acqua (15:2:1) e carico di loro utilizzando una pipetta sulla silice gel colonna. Raccogliere le frazioni 4 mL dopo 500 mL (per ManNProp). Nota: ManNBut sarà eluire dalla colonna dopo circa 700 mL.
  6. Trasferire le frazioni eluite in tubi di plastica da 15 mL. Poke 3-6 fori nel coperchio del tubo di plastica con un ago sottile. Rapid congelare la soluzione usando azoto liquido e successivamente si lyophilize fino a quando non si è completamente asciugata.
    Nota: I prodotti liofilizzati possono essere memorizzati per diversi mesi a TA.
  7. Verificare la purezza dei prodotti mediante spettrometria di massa (cfr. capitolo 9).
    Nota: In alternativa, purezza può essere verificata anche da 1H a risonanza magnetica nucleare (NMR).

3. coltura cellulare

  1. Cellule di neuroblastoma di Kelly di cultura in mezzo di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenente 10% siero bovino fetale, 100 U penicillina, streptomicina 100 mg, 2 mM L-Glutammina contenente 5 mM ManNAc, 5mm ManNProp o 5 mM ManNBut, a 37 ° C e 5% CO2.
    Nota: Le cellule coltivate in medium senza ManNAc o i suoi analoghi sono utilizzate come controllo.
  2. Prima dell'applicazione della mannosamines, staccare le cellule di neuroblastoma Kelly incubando li per 10 min con tripsina/EDTA (0,25%, 0,02% in PBS) e contare utilizzando un contatore di Neubauer-camera o cella. Le cellule a numeri definiti in base alla dimensione del piatto/piatto del seme.
    1. Per misurare l'acido sialico monosaccaridi, seme 1 x 105 cellule nel mezzo di 500 µ l in una piastra di coltura del tessuto 48 pozzetti. Per l'analisi degli acidi polisialico, seme 1 x 106 cellule in 3 mL di terreno su una piastra di coltura cellulare di diametro 6 cm. Incubare a 37 ° C e 5% CO2. Sostituire il mezzo ogni 24 ore.
      Nota: L'effetto di MGE aumenta con il tempo totale di trattamento. Per alta efficienza metabolica trattare le cellule per 5-7 giorni.
  3. Dopo il trattamento, decantare il mezzo. Lavare i piatti/piatti con PBS. Staccare le cellule incubando li per 10 min con tripsina/EDTA (0,25%, 0,02% in PBS). Neutralizzare la tripsina aggiungendo lo stesso volume di terreno di coltura delle cellule alle cellule indipendente. Trasferire le cellule indipendente in tubi di plastica da 15 mL. Centrifugare i campioni per 3 min a 500 x g e scartare il surnatante.
    1. Aggiungere 5 mL PBS e centrifuga celle (Vedi punto 3.3). Ripetere il lavaggio due volte.
      Nota: Il pellet cellulare lavato senza surnatante possa essere memorizzato a-20 ° C per diversi giorni. Se l'espressione di acido polisialico deve essere delucidato continuare alla sezione 10.

4. cellula Lisi per l'analisi HPLC

  1. Preparazione del tampone di lisi HPLC
    1. Combinare il buffer di 5 mL di Tris-HCl, 5 µ l di soluzione di aprotinina, 20 µ l di soluzione di leupeptina e 50 µ l di soluzione PMSF.
      Nota: 5 mL di tampone di lisi HPLC conterrà 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 aprotinina µM, 40 µM leupeptina e 1 mM PMSF (pH 8.0). Questo buffer dovrebbe sempre essere preparato freschi prima della lisi cellulare.
  2. Risospendere il pellet cellulare raccolti (punto 3.3) ogni in 500 µ l ghiacciata HPLC-tampone di lisi e ultra-Sonicare i campioni con un ago di processore ultra-sonico tre volte per un periodo di 30 s a medio-alte ampiezze. Raffreddare i campioni su ghiaccio per almeno 1 min tra i cicli.

5. la separazione della frazione della membrana

  1. Centrifugare i campioni lisati cellulari per 2 h a 20.000 x g e a 4 ° C. Separare il surnatante (circa 480 µ l), che rappresentano proteine citosoliche, in tubi di plastica da 1,5 mL. Determinare la concentrazione di proteina di queste frazioni utilizzando, ad esempio, il Bradford o il dosaggio (BCA) acido bicinconinico.
    Nota: La concentrazione di proteina (circa 1 mg/mL) delle frazioni citosoliche più tardi può essere correlata agli importi misurati delle specie rispettato acido sialico. Il pellet rappresenta la frazione di membrana, che viene utilizzata nel passaggio 6.1.

6. acido idrolisi

Nota: Oligo - e polisaccaridi nelle membrane cellulari sono idrolizzati a monosaccaridi. Inoltre, possibile O-modifiche nei monosaccaridi sono idrolizzate, pure. Ciò è necessario per l'analisi HPLC quantitativa, perché la stragrande maggioranza degli acidi sialici nelle frazioni della membrana è naturalmente incorporata nei glycoconjugates e potrebbe possibilmente bear O-acetile o O- lactolyl modifiche.

  1. Aggiungere 150 µ l 1 M TFA-soluzione per le frazioni di membrana separati (pellet dalla sezione 5). Incubare i campioni per 4 h a 80 ° C con agitazione a 200-600 giri/min.
  2. Centrifugare i campioni per circa 30 min a 20.000 x g e 21 ° C, utilizzando tubi filtro 0,5 mL con 3 membrane di esclusione di kDa, fino a quando il volume di fase superiore è meno di 20 µ l.
    Nota: Questo passaggio è importante smaltire detriti molecolare più elevato.
  3. Trasferire la fase inferiore contenenti molecole più piccole, comprese le specie di acido sialico, in tubi di plastica di 2 mL. Poke 2-4 fori nei tappi dei tubi in plastica con un ago sottile. Rapid congelare i campioni utilizzando azoto liquido e poi li lyophilize durante la notte.
    Nota: I campioni essiccati possono essere conservati per diversi giorni a RT. Sostituisci un cappuccio senza fori per archiviazione a lungo.

7. fluorescente etichettatura

  1. Risospendere i campioni essiccati in soluzione TFA di 10 µ l 120 mM e aggiungere 50 µ l di soluzione DMB. Trasferire i campioni in provette scuro 1,5 mL per proteggerli dai raggi ultravioletti.
  2. Per gli standard, sciogliere 1 µ l Neu5Ac (60 ng/mL, in acqua) o 1 µ l Neu5Gc (60 ng/mL, in acqua) in soluzione di TFA mM 120 µ l 10 provette scuro 1,5 mL. Aggiungere 50 µ l di soluzione DMB.
  3. Incubare i campioni di membrana delle cellule e gli standard per 1,5 h a 56 ° C al riparo dalla luce. Dopo l'incubazione, aggiungere 4 µ l 400 mM della soluzione di NaOH per ogni campione per arrestare la reazione d'etichettatura.

8. analisi HPLC

Nota: Con etichettati campioni vengono analizzati su un sistema HPLC equipaggiato con una colonna C18 RP (110 Å, dimensione delle particelle di 3 µm, 4.6 x 150 mm), un rivelatore a fluorescenza e un collezionista di frazione. I solventi utilizzati sono metanolo, acetonitrile e acqua. Assicurarsi di degassare tutti i solventi prima le misurazioni, se il sistema HPLC manca un degasatore interna.

  1. Impostare la temperatura della colonna a 40 ° C e configurare il rivelatore a fluorescenza con 373 nm per l'eccitazione e 448 nm per l'emissione, rispettivamente. Iniettare 10 µ l di campione e separare le sonde per 50 min a 0,5 mL/min di portata con metanolo/acetonitrile/acqua (6:8:86) come eluente. Per l'analisi di spettrometria di massa, raccogliere i picchi di interesse.
    Nota: Neu5Gc è previsto di eluato dopo 6-8 min, Neu5Ac dopo 9-12 min, Neu5Prop dopo 17-23 min e Neu5But dopo 38-44 min. I campioni frazionati possono essere conservati per diverse ore a 4 ° C al riparo dalla luce.
  2. Dopo la misurazione ogni campione, lavare la colonna per 7,5 min a portata di 1,0 mL/min (volumi di colonna 1,5 ≈) con metanolo/acetonitrile/acqua (6:25:69) e riequilibrare il sistema per 7,5 min a 1,0 mL/min di portata con metanolo/acetonitrile/acqua (6:8:86).
  3. Per l'analisi quantitativa, calcolare l'area sotto la curva dei picchi di interesse utilizzando il software operativo del rispettivo sistema HPLC22acido sialico.
    Nota: I dati ottenuti possono essere correlati per il Neu5Ac o lo standard di Neu5Gc e per le concentrazioni di proteina misurati nelle frazioni citosoliche (vedere paragrafo 5.1).

9. spettrometria totale analisi di acido sialico monosaccaridi

Nota: Picchi di ritenzione HPLC di interesse possono essere ulteriormente analizzati tramite spettrometria di massa di cromatografia liquida (LC)-elettrospray (ESI-MS), al fine di verificare le specie di acido sialico innaturale.

  1. Per l'analisi di spettrometria di massa, iniettare 20 µ l di campione raccolto in un sistema rivelatore selettivo LC/massa (MSD) con 79,9% metanolo, alcool isopropilico al 20% e 0,1% acido formico come eluente, portata 0,5 mL/min, 4 kV tensione capillare e 350 ° C di temperatura capillare 22 , 23.
  2. Il software di valutazione del rispettivo sistema LC/MSD, selezionare il picco di interesse nel cromatogramma totale dello ione. Mostra lo spettro di massa del picco risolto. Visualizzare il rapporto massa/carica positiva tra 300 e 700.
    Nota: DMB etichettatura degli acidi sialici conduce ad un aumento della massa molecolare di 116,2 g/mol. Le specie di DMB-etichettati acido sialico hanno le masse molecolari seguenti: DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441,8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436,2 g/mol, DMB-Neu5But = 453,2 g/PM comune addotti sono acetonitrile, sodio o alcool isopropilico.

10. Western Blot analisi di acido polisialico in cellule di Neuroblastoma di Kelly

  1. Preparazione dei lisati cellulari
    1. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi Western blot per il pellet cellulare dalla fase 3.3 e vortice. Incubare per 30 min in ghiaccio. Vortice ogni 5 min. Centrifugare i campioni per 1,5 h a 20.000 x g e a 4 ° C. Raccogliere il surnatante contenente le proteine dalle cellule lisate.
    2. Determinare la concentrazione di proteina le frazioni di proteine, per esempio, il Bradford o il dosaggio BCA. Diluire i campioni ad una concentrazione di proteina di 1,5 µ g / µ l di tampone di lisi.
    3. Preparare i campioni per la SDS-PAGE con l'aggiunta di tampone di Laemmli 10 µ l dei campioni alla frazione di proteina 90 µ l (1,5 µ g / µ l) e far bollire il campione per 5 min24.
  2. Immunoblotting
    1. Utilizzare gel SDS-acrilammide 8% con 20-30 µ l tasche e 0,75 o 1 mm di spessore. Esegua il gel a 25 mA per 2 h a TA.
    2. Rimuovere attentamente la copertura di vetro dal gel. Tagliare ed eliminare la parte superiore del gel contenente le tasche di caricamento. Collocare il gel su una membrana di nitrocellulosa (0,2 µm), precedentemente ammollato nel buffer di Western blot. Trasferire le proteine alla nitrocellulosa secondo la raccomandazione del sistema (ad es., 250 mA per 1 h a 4 ° C).
    3. Rimuovere la membrana di nitrocellulosa dal sistema macchiante. Macchia la macchia con Ponceau rosso per visualizzare le proteine. Trasferire la membrana di nitrocellulosa in un alloggiamento di plastica e aggiungere 10 mL di soluzione di blocco. Incubare per 1 h a RT o durante la notte a 4 ° C.
    4. Decantare la soluzione bloccante e aggiungere dell'anticorpo monoclonale anti-polySia 735 (1 µ g/mL) in PBS. Incubare la membrana per 1h a RT o durante la notte a 4 ° C. Dopo l'incubazione, lavare la membrana almeno tre volte per 5 min con PBS.
    5. Aggiungere policlonale anticorpo secondario di IgG anti-topo (1 µ g/mL) accoppiato alla perossidasi di rafano (HRP) o un'etichetta fluorescente in PBS. Incubare la membrana per 1 h a TA. Dopo l'incubazione, lavare la membrana almeno tre volte per 5 min con PBS.
    6. Trasferire la membrana su un piatto di un imager appropriato. Rilevare il segnale secondo le istruzioni del produttore.

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Representative Results

Cromatogrammi HPLC di fluorescente etichettati Neu5Ac e gli standard di Neu5Gc sono rappresentati in Figura 2. Utilizzando il metodo qui descritto, Neu5Gc DMB-labeled eluisce in genere tra 7-9 min tempo di eluizione e DMB-Neu5Ac tra 10-12 min. Parecchi più piccoli picchi nel cromatogramma appaiono in genere tra 2-6 min. Questi picchi rappresentano non reagito DMB e reazione intermedi25.

La figura 3 Mostra cromatogrammi rappresentativi dei lisati cellulari. Rispetto ai cromatogrammi degli standard DMB-etichetta (Figura 2), in questi cromatogrammi sono visibili numerose vette non definiti. Questo è molto probabilmente dovuto l'impurità interna dei lisati cellulari e al fatto che DMB reagisce non solo con acido sialico specie, ma anche con altri α-Cheto acidi presenti in lisati cellulari, tra cui di piruvato, succinato e α-chetoglutarato26. La presenza di piccole quantità di acidi sialici cuscinetto O-modifiche di acetile che non sono stata spaccate tramite idrolisi acetico potrebbero essere discusse anche come un motivo per questi picchi indefinito23. Cromatogrammi da lisato cellule non trattate vengono confrontati con cromatogrammi dalle cellule che sono state trattate in precedenza con ManNAc o i suoi analoghi. Come illustrato di seguito, il trattamento con ManNAc spesso conduce ad uno svuotamento quasi intero di Neu5Gc sulla superficie delle cellule. Nei cromatogrammi di lisato cellule trattate con Neu5Prop o Neu5But, picchi sono visibili che non appaiono nei cromatogrammi di cellule non trattate. Questi picchi (per ManNProp cellule trattate circa 19 min tempo di eluizione e per ManNBut trattato le cellule a 42 min) indicano l'aspetto degli acidi sialici non naturali corrispondenti, Neu5Prop e Neu5Gc. Come descritto nella sezione 8.3 del protocollo, i cromatogrammi HPLC possono essere analizzati al fine di quantificare la quantità di specie diverse di acido sialico nei lisati cellulari.

Il fatto che picchi distinti di ritenzione HPLC corrispondono ad alcune specie di acido sialico è stato verificato tramite spettrometria di massa. Rappresentante-ESI-MS dati dalle vette HPLC raccolti di interesse sono rappresentati in Figura 4: lo spettro del picco di ritenzione di DMB-Neu5Ac raccolto nel pannello di sinistra superiore, DMB-Neu5Gc nel riquadro in alto a destra e le due specie di acido sialico non naturali, DMB-Neu5Prop e DMB-Neu5But nei pannelli inferiori destro e sinistro. La reazione con DMB conduce ad un aumento nella massa molecolare di Da 116,2, rispetto alla specie di acido sialico che non sono etichettati con questo colorante. Negli spettri di massa, quando si Visualizza il rapporto massa/carica positiva dei campioni iniettati tra 300 e 700, sono visibili numerose vette. Ciò è dovuto alla formazione della sonda DMB-labeled rispettata del complesso. Oltre lo ione protonati [M + H]+, il sodio addotti [M + Na]+ e [M + 2Na-H]+ vengono visualizzati. Come acetonitrile (ACN) è presente durante l'analisi di LC, può essere trovato come un addotto negli spettri di massa (indicato per DMB-Neu5Gc, Figura 4: pannello superiore destro). A causa della frammentazione causata da attivazioni di scompenso collisionale generate nella regione electronspray trasporto tra il capillare e il primo skimmer, disidratati acido sialico specie [M + H]+-H2O può anche essere osservata (mostrato per DMB-Neu5Ac, Figura 4: Pannello di sinistra superiore)23,27. Nell'impostazione di LC, DMB-Neu5Gc eluisce poco dopo il DMB-specie non reagiti o parzialmente reagito. Quindi, la sonda di DMB-Neu5Gc raccolta può contenere impurità causate da questi intermedi di reazione. Questo serve come una spiegazione per l'aspetto di indefinito picchi nello spettro di massa di DMB-Neu5Gc (Figura 4: pannello superiore destro).

Trattamento delle cellule di neuroblastoma di Kelly con ManNProp o ManNBut conduce all'espressione riduttrice di acido polisialico su NCAM, come dimostrato da analisi Western blot della membrana cellulare da cellule lisate (Figura 5). Acido polisialico appare normalmente come una sbavatura al sua eterogeneità in dimensioni e carica di (≈ 200 kDa). Il trattamento con gli analoghi ManNAc conduce alla riduzione di acido polisialico sulla superficie di cellule: il più a lungo l' alifatici N-acil lato catena, più forte la riduzione28.

Figure 1
Figura 1: Il principio generale di MGE con N-acil per volta mannosamines. Dopo il trattamento con N-acil modificato mannosamines, questi analoghi ManNAc sono unidirezionalmente metabolizzato (metabolismo intracellulare) agli acidi sialici non naturali corrispondenti. Questi sono trasportati al Golgi, trasferiti il ricettore di rispettivi oligosaccaride da recettoriali ed espresso sulla superficie delle cellule come sialosides (qui, una glicoproteina). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: cromatogrammi rappresentativi degli standard DMB-etichettati acido sialico. DMB-etichetta Neu5Ac (pannello superiore) e Neu5Gc (pannello inferiore) sono stati analizzati da HPLC. Ritenzione volte (linee tratteggiate) e le aree dei picchi di entrambi gli acidi sialici sono state determinate dopo l'iniezione di 10 ng della specie rispettato DMB-identificati nel sistema HPLC. Nei cromatogrammi rappresentativi qui mostrati, DMB-Neu5Gc eluito dopo circa un tempo di ritenzione di 8 min e DMB-Neu5Ac a 11 min, rispettivamente. Parecchi più piccoli picchi nel cromatogramma appaiono in genere tra 2-6 min, che rappresenta non reagiti intermedi DMB e reazione. Una piccola frazione di DMB-labeled Neu5Ac appare come una minore impurità nello standard DMB-Neu5Gc (pannello inferiore). Questa figura è stata modificata da riferimento22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: caratterizzazione degli acidi sialici membrana-limita da DMB-HPLC. Le cellule sono state coltivate in assenza (non trattato, superiore Pannello) o in presenza con 5 mM ManNAc (secondo pannello dall'alto), ManNProp (terzo pannello dall'alto), o ManNBut (pannello inferiore), rispettivamente per 7 giorni. Il mezzo è stato cambiato ogni 24 h. le cellule sono state raccolte e frazioni della membrana sono state preparate, etichettate con DMB e analizzate da HPLC. Confronto con i cromatogrammi standard DMB-etichettati acido sialico (Figura 2), picchi ai tempi di ritenzione tra 8-9 min sono stati identificati come DMB-Neu5Gc e cime tra 10-11 min come DMB-Neu5Ac. Rispetto ai picchi ottenuti dall'iniezione standard DMB-etichettati acido sialico, cromatogrammi da lisati cellulari mostrano picchi aggiuntivi, indefiniti. Ciò è dovuto l'impurità interna delle sonde, oltre al fatto che la DMB può reagire non solo con acido sialico presente nei lisati cellulari, ma anche con altri α-Cheto acidi presenti in lisati cellulari, tra cui piruvato, succinato e α-chetoglutarato. Picchi che sono presenti solo nei cromatogrammi dei campioni dalle cellule coltivate in presenza di N-acil per volta mannosammina analoghi indicano i corrispondenti DMB-etichettato non naturali sialico acidi. Questa figura è stata modificata da riferimento22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: massa spettri di DMB-etichettati acido sialico specie osservate in lisati cellulari. Picchi di ritenzione HPLC di interesse (Vedi Figura 3) sono stati raccolti e successivamente analizzati mediante ESI-MS. 20 µ l delle ritenzioni raccolte picchi sono stati iniettati nel sistema LC-MSD. Reazione con DMB conduce ad un aumento nella massa molecolare di 116,2 Da rispetto alle specie non reagito acido sialico corrispondenti. Sono raffigurati gli spettrogrammi di rapporto massa/carica positiva ottenuti da specie diverse di acido sialico (DMB-Neu5Ac: Pannello di sinistra superiore, DMB-Neu5Gc: pannello superiore destro, DMB-Neu5Prop: pannello inferiore sinistro, DMB-Neu5But: Pannello di destra più bassa). Dovuta alla formazione del complesso diverse cime sono visibili. Oltre lo ione protonati [M + H]+, sodio addotti [M + Na]+ e [M + 2Na-H]+ vengono visualizzati. Acetonitrile, che è presente durante l'analisi di LC, può anche essere trovato come un addotto (pannello superiore destro). DMB-Neu5Ac disidratati, che è generato dalla frammentazione dello strumento [M + H]+-H2O può essere osservato (pannello di sinistra superiore). La sonda di DMB-Neu5Gc raccolta può contenere impurità causate da DMB non reagito, come pure la reazione intermedi visti come ulteriori picchi non definiti (pannello superiore destro). ACN, acetonitrile; H, idrogeno; Na, sodio. Questa figura è stata modificata da riferimento22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: analisi di polysialylation di NCAM. Cellule di neuroblastoma di Kelly sono state coltivate in assenza o presenza di 5mm ManNAc, ManNProp o ManNBut per 7 giorni. Le cellule sono state raccolte e proteine sono state separate su gel di SDS-acrilammide 8% e analizzate mediante Western blot con anticorpi monoclonali anti-polySia 735. Si noti che polySia viene visualizzato come una sbavatura a causa della sua eterogeneità nel numero della ASI, risultante in diverse dimensioni e costi di polySia.

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Discussion

Se i derivati chimicamente sintetizzati di ManNAc, ManNProp e ManNBut vengono analizzati tramite spettrometria di massa, solo il picco di massa corretto per entrambi gli esemplari deve essere identificato. Di conseguenza, i prodotti possono essere presupposto per avere una purezza superiore al 99%. Piccole quantità di Neu5Gc, che normalmente non viene trovato in cellule umane29, vengono rilevati nelle frazioni della membrana delle cellule lisate. Questo si verifica più probabilmente attraverso una via di salvataggio che reclute Neu5Gc da siero bovino fetale sialoglicoconiugati in media30. Il trattamento con il precursore naturale della biosintesi dell'acido sialico, ManNAc, abbassa drasticamente l'espressione dell'epitopo Neu5Gc sulla superficie delle cellule.

Applicazione di mannosamines modificate è trascurabile tossico alle cellule tutti studiate finora. Le celle accettare le concentrazioni millimolar aumentato dello zucchero all'interno del mezzo, che è necessario, poiché non ci sono nessun trasportatori specifici per N- acylmannosamines. È stato dimostrato che vie di trasduzione del segnale sono attivate su richiesta di N- acylmannosamines, che possono influire sulle cellule crescita o differenziazione31,32. Se questo è a causa di un modello modificato sialylation o riflette effetti diretti sulla sialylation modificate non è noto finora. Crescita delle cellule in presenza di analoghi ManNAc C2-modificato, ManNProp o ManNBut determina l'espressione di specie acido sialico non naturali che trasportano il corrispondente N-sostituzione dell'acilico. L'efficienza metabolica delle due testate N-acil per volta mannosamines varia. Trattamento con ManNProp di solito porta all'espressione della Neu5Prop corrispondente sulla superficie delle cellule e per una diminuita espressione di Neu5Ac così come Neu5Gc. Altri N-acil per volta mannosammina analoghi, come N- cyclopropylcarbamyl mannosammina, tendono ad avere un maggiore efficienza metabolica22.

Gli studi precedenti hanno rivelato che precursori sialico interferiscano con polysialylation. Polisialico acidi sono espresse quasi esclusivamente il NCAM. È interessante notare che, NCAM può essere polysialylated di due distinte polysialyltransferases espresso nel Golgi (ST8SiaII e ST8SiaIV). Si è scoperto che ManNProp, ManNBut e altri N-acil-mannosamines modificate interferire con polysialylation e che questo è principalmente dovuto interazione con ST8SiaII14. Questo sialil è espresso durante lo sviluppo ed è importante per lo sviluppo del cervello. È interessante notare che anche, molti tumori di origine neuronale ri-esprimere ST8SiaII aumentare loro malignità e ulteriormente rendendoli non rilevabili dal sistema immunitario33. Al contrario, l'applicazione della ManNAc conduce ad un aumento di polySia, poiché conduce ad un aumento di CMP-Neu5Ac, che è il substrato naturale di entrambi polysialyltransferases.

MGE è un metodo unico per introdurre nuovi sialico acidi sulle proteine di interesse (ad es., eritropoietina) e per modulare quindi la sua funzione. Inoltre, può essere utilizzato per modulare la glicosilazione superficie cellulare, che potrebbe essere di interesse per molte malattie come il cancro, dal momento che molte cellule tumorali cercano di fuggire il sistema immunitario che esprimono alti livelli di acido sialico. Il metodo qui presentato consente: in primo luogo, eseguire glycoengineering utilizzando colture cellulari, e la seconda, di analizzare ingegnerizzato glicani per dimostrare il successo glycoengineering. Il metodo è molto robusto e fino ad ora, trabocchetti non sono segnalati; al contrario, il metodo è stato ampliato per introdurre gruppi chimici attivi per eseguire clic-chimica su cellule13.

Qui presentiamo due ManNAc analoghi con alifatici N-acil lato catena che modifiche relativamente semplice per sintetizzare, anche da laboratori con meno attrezzature e meno esperienza nella sintesi chimica. Gruppi che sono più familiari alla chimica organica potrebbero sintetizzare altri analoghi di ManNAc con strutture più complesse e usare questi per MGE, tra cui i cosiddetto 'bioorthogonal' analoghi, che possono essere utilizzate, ad esempio, per visualizzare sialilato glicoconiugati. Non ci sono articoli di revisione dando una panoramica della N-acetile-mannosammina derivati che sono stati sintetizzati finora13,34. N- azidoacetyl mannosammina (ManNAz), una sostanza che viene spesso utilizzata, per visualizzare sialilato glicani, è disponibile in commercio. A causa della permeabilità di membrana bassa di ManNAc analoghi, può essere vantaggioso utilizzare derivati di questi zuccheri con idrossile-gruppi protetti, ad esempio, peracetylated ManNAc analoghi. Dopo aver inserito il citoplasma, i gruppi di protezione sono spaccati dalle esterasi citoplasmatiche, liberando l'attiva monosaccaridi35,36,37. Tuttavia, peracetylated ManNAc analoghi espongono citotossicità superiore rispetto ai corrispondenti derivati non protetti.

In questo manoscritto, abbiamo scelto le cellule di neuroblastoma immortalizzate per i nostri esperimenti con MGE. In genere, MGE (soprattutto con ManNProp e ManNBut) può essere applicato in una vasta gamma di linee cellulari, comprese le linee cellulari immortalizzate (Vedi Wratil et al. 13 per esempi) e cellule primarie38,39. Inoltre, MGE è stata utilizzata con successo per alterare sialylation in vivo in c. elegans40, zebrafish17,41, mouse19,20,42e ratto 43 , 44. la durata del trattamento e la concentrazione degli analoghi ManNAc negli esperimenti MGE possono essere variati per interessare l'efficienza metabolica di questo metodo. Dalla nostra esperienza, trattamento più lungo e più alte concentrazioni corrispondono con sostituto migliore delle specie naturali acido sialico nei glycoconjugates da Neu5R modificate. Se le concentrazioni molto alte di ManNAc derivati devono essere utilizzati, la citotossicità del trattamento dovrebbe essere valutata, per esempio, dall'analisi di MTT o l'analisi di riduzione di resazurin.

In questo manoscritto, suggeriamo di usare ultra-sonicazione per omogeneizzazione delle cellule. Altri metodi di lisi delle cellule sono stati testati nel nostro laboratorio, tra cui douncing sul ghiaccio (circa 250 colpi) e francese interruzione stampa (10.000 psi, 4 passaggi), con risultati comparabili per quanto riguarda la quantità di acido sialico rilevato nei campioni. Il vantaggio di ultra-suono omogeneizzazione è che ha bisogno di poco tempo e non richiede l'aggiunta di dnaasi ai campioni prima della lisi.

Abbiamo focalizzato la nostra analisi sulle frazioni di membrana dei lisati cellulari, perché abbiamo voluto mostrare alterazioni della sialylation della membrana collegato glicoconiugati. Derivati dell'acido sialico e le relative concentrazioni possono anche essere misurate nel citosol delle cellule, dopo la frazione di membrana è stata separata per centrifugazione ad alta velocità, utilizzando lo stesso metodo, come descritto in precedenza. Tuttavia, le concentrazioni di acido sialico nel citosol sono fino a 100 volte inferiore rispetto all'acido sialico espressione sulla membrana cellulare7. Così, grandi quantità di cellule sono necessarie per generare risultati affidabili. La piscina di acido sialico CMP citosolico, attivato può essere misurata indirettamente da pre-trattare le frazioni citosoliche di lisati cellulari con boroidruro di sodio prima dell'idrolisi7,45. Al fine di idrolizzare l'acido sialico nei glycoconjugates e acido sialico con modifiche dell'idrossile, le cellule sono state incubate con 1m TFA. Altre soluzioni acide possono essere utilizzati per idrolisi, anche, ad es., 2 M di acido propionico, acido acetico 2 M o 1 M HCl.

Un possibile problema rilevato durante l'analisi in HPLC è che picchi di interesse sono sovrapposte con picchi non definiti. Questo è particolarmente problematico quando la quantità di acido sialico in un campione deve essere calcolato dall'area sotto la curva di un certo picco. Per separare un picco di interesse da un picco non definito, la concentrazione di acetonitrile nel solvente HPLC potrebbe essere regolata (± 3%). Suggeriamo di utilizzare concentrazioni di solvente costante per l'analisi HPLC, dando il vantaggio di preparare la miscela solvente prima di cromatografia. Pertanto, il nostro metodo richiede solo una pompa HPLC ed è fattibile per una vasta gamma di differenti sistemi HPLC. Se più di una pompa è disponibile nel sistema HPLC, una pendenza isocratic con aumento delle concentrazioni di acetonitrile può essere applicata, ad esempio, il 4-9% in 35 min45. Utilizzando questa tecnica, verrà modificato considerevolmente il tempo di ritenzione di alcuni picchi HPLC. Questa strategia può anche contribuire a realizzare la migliore separazione dei picchi di sovrapposizione. Matrix-assisted laser desorbimento ionizzazione spettrometria di massa (MALDI-MS) è stata stabilita correttamente per verificare l'espressione di per volta specie di acido sialico sulla superficie cellulare45e quindi serve come equivalente al metodo ESI-MS presentato qui .

A causa dell'idrofilia di ManNAc analoghi e la mancanza di trasportatori specifici per l'assorbimento di questi derivati46, alte concentrazioni sono necessari negli esperimenti MGE con questi composti. Pertanto, negli esperimenti in scala fino e, specialmente in prove in vivo , grandi quantità dei rispettivi ManNAc analoghi sono necessarie mostrando una possibile limitazione di questa tecnica. D'altra parte, a seconda le linee cellulari utilizzate, un certo numero minimo di cellule trattate è necessario per ottenere risultati affidabili nell'analisi HPLC. Dalla nostra esperienza, è sufficiente un minimo di circa 100.000 cellule aderenti o 150.000 cellule in sospensione (1-2 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con cellule confluenti). Questo può diventare un collo di bottiglia, se l'analisi è quello di essere ridimensionato, ad esempio in approcci di screening.

Con i metodi presentati in questo manoscritto, acido sialico e dei suoi derivati possono essere rilevati in lisati cellulari. Tuttavia, la struttura e la composizione di glicoconiugati in cellule trattate con ManNAc derivati non può essere valutati con la tecnica descritta nel presente documento. Risolvere la struttura di glicoconiugati, e.g.,N- e O- glicani, richiede generalmente una maggiore esperienza e un impianto di glycomics47. A nostra conoscenza, finora, non sono disponibili dati sulla struttura distinta di glicoconiugati dalle cellule che sono state trattate con gli analoghi ManNAc.

Analisi di Western blot di acido polisialico è un metodo molto veloce e facile. Tuttavia, i dati ottenuti da questo metodo non sono quantitativi, poiché il rilevamento utilizza anticorpi e chemiluminescenza. Pertanto, l'uso di metodi HPLC è un vantaggio rispetto a macchiarsi occidentale. Tuttavia, si consiglia di utilizzare il metodo di immunoblotting, dal momento che è noto a lavorare in modo molto affidabile e facile da applicare.

L'espressione di acido sialico sulla superficie delle cellule può essere alterata anche con metodi diversi da MGE. Come descritto in precedenza, le cellule possono essere trattate con sialidasi, un enzima che idrolizza i residui di acido sialico da glycoconjugates in maniera relativamente aspecifiche. Di conseguenza, il trattamento di sialidasi induce hyposialylation in cellule trattate. Purtroppo, trattamento di sialidasi è una tecnica piuttosto limitata, come è citotossico, non è fattibile per il trattamento a lungo tempo e non applicabile in esperimenti in vivo . Un'altra tecnica per indurre hyposialylation nelle cellule è usando inibitori della biosintesi dell'acido sialico. Una varietà di inibitori è disponibile che sia come target l'enzima chiave della biosintesi dell'acido sialico, la UDP -N- acetylglucosamine-2-epimerase /N- acetilmannosammina-chinasi (GNE/MNK), o il gruppo di sialiltransferasi6, 7,8,48. Uno di questi composti, un acido sialico di C3-fluorurati analogico, è stato indicato per abbassare l'espressione di acido sialico in vita topi49. Gli animali trattati con questa sostanza, tuttavia, ha mostrato l'insufficienza epatica, disfunzione renale irreversibile e omissione di prosperare49. Questi risultati confermano il ruolo cruciale di Neu5Ac nella funzionalità epatica e renale e indicano ulteriormente i limiti di sialylation inibitori per esperimenti in vivo . Un terzo metodo per generare cellule con alterata delle cellule superficiali sialylation è interferendo con l'espressione degli enzimi che sono cruciali per la biosintesi di acido sialico. Un knock-down della GNE/MNK in cellule immortalizzate, ad esempio, è stato indicato per eseguire il rendering di queste cellule hyposialylated 9. La possibilità di relativamente facilmente knock-in e - geni nel cellulare e in vivo usando il romanzo e ben riconosciuto CRISPR-Cas9 tecnica potrebbe portare a nuove scoperte per quanto riguarda la biosintesi dell'acido sialico e cellulari di superficie sialylation.

Il vantaggio di MGE rispetto alle tecniche descritte qui, è che è facile da applicare ed adattabile ad una miriade di diversi esperimenti, dalle prove in vitro per analisi di base e gli esperimenti in vivo delle cellule. Un metodo alternativo per misurare l'espressione e le concentrazioni di acido sialico diverse specie nei campioni delle cellule è mediante cromatografia a scambio anionico ad alte prestazioni (HPAEC) con rilevazione elettrochimica pulsata50. Utilizzando che questo metodo, l'espressione di acido sialico è misurato direttamente e non dopo etichettatura con un colorante fluorescente. Il vantaggio di questo metodo è che può essere utilizzato anche per analizzare i monosaccaridi diversi da acido sialico e suoi derivati in campioni delle cellule e proteine. Purtroppo, la sensibilità di HPAEC è inferiore rispetto alla rilevazione fluorometrica di acido sialico DMB. Pertanto, HPAEC è limitato agli esperimenti con la disponibilità di campioni di grandi importi51.

I metodi descritti nel presente documento possono essere utilizzati per rivelare caratteristiche sconosciute di glicoconiugati. Una moltitudine di esempi per l'uso di MGE investigare acido sialico dipendente interazioni già esiste13, mostrando la fattibilità di questa tecnica nel contesto di una vasta gamma di configurazioni sperimentali.

Oggi, MGE con N- acetylmannosamines è utilizzato principalmente dai ricercatori nel campo della glicobiologia. Ci auguriamo che questa tecnica venga riconosciuta da un pubblico più ampio come uno strumento versatile per modificare glicoconiugati. Altri campi, tra cui immunologia, virologia, neurologia o oncologia beneficeranno adattando questa tecnica per i propri scopi. Tale ricerca incrociata potrebbe consentano l'individuazione di aree ancora inesplorate e quindi dare una migliore comprensione della salute e della malattia. Negli studi iniziali, ad esempio, questa tecnica è stata utilizzata per la produzione di glicoproteine con glicosilazione modificata, che poi servono per la vaccinazione in vivo . In alcuni casi, il trattamento con tali vaccini glycoengineered conduce alla produzione di anticorpi che esposto avanzata avidità e tossicità per i rispettivi obiettivi52,53. Altri usato con successo MGE per sviluppare un modello per la terapia mirata del tumore in topi54. Un altro studio ha mostrato che l'iniezione sistemica in vivo di ManNProp promosso di rigenerazione del nervo55. Nel caso di polySia, è stato dimostrato che diminuire l'espressione di questo epitopo in cellule di neuroblastoma con i metodi presentati in questo manoscritto, aumenta la sensibilità di queste cellule del tumore a radiazioni o a trattamento con farmaci antitumorali56.

Gli importi di acido sialico misurata all'interno di campioni potrebbero differire a seconda del metodo utilizzato per dissociare le cellule trattate. In questo manoscritto, incubazione con tripsina è stato utilizzato per staccare le cellule. Se altre tecniche devono essere utilizzati, ad esempio raschiando le cellule o dal trattamento con PBS + EDTA, gli importi di acido sialico misurata nei campioni potrebbero essere diverso. Anche adattare il tempo di incubazione con tripsina possono avere un impatto sulle concentrazioni acido sialico misurare successivamente. Dalla nostra esperienza, l'impatto del metodo distacco cellulare sugli importi di acido sialico misurato è inferiore al 15%, ma se i risultati devono essere normalizzati e rispetto, questo potrebbe diventare un importante collo di bottiglia. Inoltre, il metodo per la lisi delle cellule può influenzare l'esito dell'analisi HPLC. Così, si consiglia al lettore di standardizzare distacco cellulare e Lisi nei loro esperimenti.

Per ottenere la separazione della frazione della membrana in lisati cellulari, abbiamo usato la centrifugazione per 2 h a 20.000 x g a 4 ° C (vedere paragrafo 5.1). Altri protocolli di centrifugazione potrebbero influire la separazione e pertanto la quantità di acido sialico rilevati nei campioni. Un critico composto all'interno di questo protocollo è DMB, perché è molto sensibile alla luce e si degrada nel tempo. Qui si consiglia di aliquotare piccole porzioni della DMB-soluzione e negozio come scorte a - 20 ° C, al riparo dalla luce (sezione 1.6.1). In questo modo la DMB-soluzione può essere conservato per diverse settimane. Se i risultati dall'analisi di DMB-HPLC mostrano segnali per acido sialico specie di diminuendo o aumentando i segnali entro i primi 6 min della misurazione HPLC, che rappresenta la DMB e i suoi prodotti di reazione, nuova DMB-soluzione deve essere preparata. Non ricongelare e riutilizzo DMB-soluzione dopo lo scongelamento. Dopo DMB etichettatura, tutti i campioni devono essere analizzati immediatamente. Se un numero maggiore di campioni (> 10) devono essere analizzati, questi esempi dovrebbero essere suddiviso in più piccoli distintivi e gradualmente identificati con DMB. Entrambi la reazione d'etichettatura volte così come le sonde DMB-etichetta devono essere protetti dalla luce a tutti. Dopo eluizione, la DMB-etichettati acido sialico specie dovrebbero essere analizzata immediatamente da ESI-MS. diretto accoppiamento di HPLC con il sistema ESI-MS (in una configurazione di LC-ESI-MS) non è necessaria, ma può essere vantaggioso per ottenere una qualità superiore di spettrometria di massa analisi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo L. D. Nguyen per la correzione del manoscritto e per discussioni fruttuose. Inoltre, ringraziamo J. Dernedde e H. G. Nguyen per aiutarci a preparare le riprese video. La maggior parte delle scene del video sono state girate nei laboratori di R. Tauber. Ringraziamo anche il Max Planck Institute per i colloidi e le interfacce e per averci dato libero accesso alla loro funzione di spettrometria di massa. RH è stata sostenuta dal DFG (ProMoAge).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

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References

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. , 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

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Glycoengineering metabolica di acido sialico utilizzando <em>N</em>-acil-per volta Mannosamines
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Wratil, P. R., Horstkorte, R.… More

Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

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