Combinazione di Raman Imaging e analisi multivariata per la visualizzazione di lignina, cellulosa e emicellulosa nella parete cellulare delle piante

La biomassa vegetale è la risorsa rinnovabile più abbondante sulla Terra; è composta principalmente da lignina, cellulosa ed emicellulosa; ed è considerata una fonte attraente di bioenergia e prodotti chimici a base biologica¹. Sfortunatamente, può resistere alla degradazione e conferire stabilità idrolitica o robustezza strutturale alla parete cellulare della pianta. Tale resistenza è attribuibile all'area superficiale accessibile, alla dimensione delle particelle di biomassa, al grado di polimerizzazione, alla cristallinità della cellulosa e alla lignina protettiva ². Una comprensione completa della natura strutturale e chimica della parete cellulare vegetale è quindi significativa dal punto di vista della biologia e della chimica vegetale, così come da quello dell'utilizzazione commerciale. Le analisi di chimica umida comunemente utilizzate, come la cromatografia, la spettrometria di massa e la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, forniscono solo dati di composizione medi del campione misurato. Inoltre, questi metodi sono invasivi e distruggono la struttura originale del tessuto vegetale³.

La tecnica di imaging Raman è un potente strumento per la visualizzazione non distruttiva di informazioni chimiche spazialmente risolte⁴. Utilizza una luce laser per causare una dispersione anelastica con un fotone e si basa sui cambiamenti di polarizzabilità derivanti dalle vibrazioni molecolari. In questo caso, l'acqua provoca una debole dispersione Raman, il che rende questo approccio adatto per indagini in situ di campioni biologici⁵. L'applicazione della tecnica di imaging Raman alla parete cellulare vegetale può chiarire la struttura e la composizione delle pareti cellulari vegetali nel loro stato nativo, con la risoluzione sulla scala della singola cellula e persino degli strati della parete cellulare⁶. Una tipica analisi di imaging Raman di una parete cellulare vegetale consiste generalmente in tre fasi: 1) preparazione del campione, 2) acquisizione spettrale e 3) elaborazione dei dati.

Sebbene uno dei principali vantaggi dell'imaging Raman sia la capacità di ottenere spettri privi di etichette e non distruttivi con una preparazione minima del campione, il sezionamento fisico del campione è ancora necessario per esporre la superficie di interesse. Questo processo deve essere eseguito con attenzione per ottenere una superficie piana, poiché la tecnica dipende dal mantenimento della messa a fuoco ottica⁷. L'acquisizione spettrale richiede un equilibrio tra qualità dell'immagine e tempi di acquisizione estesi⁸. L'elaborazione dei dati mira a estrarre efficacemente le informazioni chimiche dai dati dell'immagine, in particolare per i componenti con strutture chimiche simili, come la cellulosa e l'emicellulosa. A causa della forte sovrapposizione spettrale, gli spettri esatti sono difficili da discernere. In questo caso, l'analisi multivariata è un approccio semplice per scoprire efficacemente le informazioni strutturali e chimiche nascoste⁹. Questo lavoro presenta un protocollo generale che descrive l'uso dell'imaging Raman per visualizzare i componenti principali nelle pareti cellulari delle piante, tra cui lignina, cellulosa ed emicellulosa.

1. Preparazione del campione

1. Tagliare un piccolo blocco di tessuto (circa 3 mm x 3 mm x 5 mm) dal campione vegetale ( ad es. Un gambo di pioppo).
2. Immergere il tessuto in acqua bollente di deionizzazione per 30 min. Trasferire immediatamente in acqua deionizzata a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti. Ripetere questo passaggio finché il tessuto non si affonda sul fondo del contenitore, indicando che l'aria nel tessuto è stata rimossa e che il tessuto si è ammorbidito.
   Nota: Per i campioni che si affondano sul fondo prima di questo passaggio, ripetere generalmente questo ciclo 3-5 volte.
3. Preparare 20, 50, 70, 90% (v / v) aliquote di polietilenglicole (PEG) in acqua deionizzata, pure pure PEG e mantenere le soluzioni a 65 ° C.
4. Incubare il tessuto in una serie di bagni PEG classificati per spostare l'acqua e consentire l'infiltrazione del PEG.
   Nota: In genere, PEG con peso molecolare 2.000 (PEG2000) viene utilizzato per l'incorporamento.
   1. Processare il tessuto con g(A) 20% PEG per 1h, (b) 50% PEG per 1,5h, (c) 70% PEG per 2h, (d) 90% PEG per 2 ore e E) 100% PEG per 10 h.
5. Preriscaldare una cassetta a 65 ° C in un forno. Versare il PEG contenente il blocco nella cassetta e quindi posizionare il blocco di tessuto in una posizione desiderata utilizzando pinzette o aghi preriscaldati.
6. Lentamente raffreddare la cassetta e conservare il tessuto in RT fino all'uso.
7. Sezionare il blocco PEG contenente il tessuto bersaglio in un piccolo blocco (circa 1 cm x 1 cm x 2 cm) usando una lama raso tagliente e montarla sul microtomo.
8. Tagliare le sezioni sottili dal blocco PEG (tipicamente 3-10 μm).
9. Sciacquare la sezione con acqua deionizzata in un vetro da orologio 10 volte per rimuovere la PEG dal tessuto.
10. Immergere le sezioni con toluene / etanolo (2: 1, v / v) per 6 ore per rimuovere gli estrattivi. Preparare il liquido di reazione mescolando 65 ml di acqua deionizzata, 0,5 ml di acido acetico e 0,6 g di sodio chloRito in un bicchiere. Aggiungere una sezione e 3 ml di liquido di reazione a una fiala da 5 ml. Avvitare la parte superiore della fiala.
11. Scaldare la fiala in bagno d'acqua a 75 ° C per 2 ore per rimuovere la lignina del tessuto. Sciacquare la sezione con acqua deionizzata in un vetro da orologio 10 volte.
12. Trasferire la sezione non trattata / delignificata ad una vetrina del microscopio di vetro. Aprire con cura la sezione con spazzole o aghi. Rimuovere l'acqua extra deionizzata con carta velina.
13. Immergere la sezione in D ₂ O. Coprire il campione con una slitta di copertura in vetro. Sigillare il coperchio della copertura con smalto per prevenire l'evaporazione del D ₂ O.

2. Acquisizione spettrale

1. Aprire il software operativo dello strumento del microscopio Raman confocale. Accendere il laser (lunghezza d'onda = 532 nm), mettere a fuoco sulla superficie del silicio cristallino con un obiettivo microscopico 100X e fare clic sul pulsante di calibrazione per calibrare lo strumento.
2. Spostare lo strumentoAlla modalità microscopica ottica e accendere la lampada del microscopio. Montare la diapositiva del microscopio sul palco, con la slitta di copertura rivolta verso l'obiettivo.
3. Visualizzare il campione con un obiettivo del microscopio 20X e individuare l'area di interesse. Applicare olio di immersione sul coperchio e passare all'obiettivo del microscopio di immersione (60X, apertura numerica NA = 1,35). Focus sulla superficie del campione.
4. Passare lo strumento alla modalità di prova Raman e spegnere la lampada del microscopio.
5. Scegliere un'area di mappatura utilizzando uno strumento rettangolare. Modifica la dimensione del passo per determinare il numero di spettri ottenuti.
   Nota: tenere presente la dimensione del passo (di solito più grande del diametro del punto calcolato dall'apertura numerica dell'obiettivo, teoricamente 1.22λ / NA). Le dimensioni sotto di questo provocheranno un oversampling.
6. Impostare i parametri ottimali di spettro per ottenere il miglior rapporto segnale / rumore (SNR) e qualità spettrale in un opportuno tempo di acquisizione (generalmente <8 h), depeSulla conformità del campione. In genere, immettere i parametri di imaging nel software dello strumento come nel seguente modo: laser (532 nm), filtro (100%), foro (300), fessura (100), spettrometro (1.840 cm ^-1 ), scanalature (1200t) Olio 60X) e tempo di acquisizione (2 s).
7. Salvare i dati spettrali prima dell'elaborazione dei dati e convertirli in un formato universale ( ad esempio, file TXT).

3. Analisi dei dati

1. Caricare i dati spettrali (file TXT) nel software di analisi dei dati ( ad esempio, Matlab). Applicare una tecnica di riduzione del rumore sul set di dati per migliorare il SNR ( ad esempio, l'algoritmo Savitzsky-Golay o l'algoritmo wavelet)
2. Utilizzare campioni non trattati per produrre le immagini di lignina e polisaccaridi. Per l'imaging di lignina, considerare il picco spettrale di circa 1.600 cm ^{-1 a} causa della vibrazione simmetrica di stretching anulare. Per la formazione di polisaccaridi (inclusa la cellulosa e l'emicellulosa), utilizzare il picco spettrale aIntorno a 2.889 cm ^{-1 a} causa dei tratti CH e CH2.
3. Utilizzare campioni delignificati per generare le immagini di cellulosa e emicellulosa. Eseguire la risoluzione della curva di auto-modellizzazione (SMCR) sugli spettri acquisiti per discriminare lo spettro di cellulosa e emicellulosa e per rappresentare le loro distribuzioni.
4. Eseguire l'analisi dei componenti principali (PCA) e l'analisi clustering sui dati acquisiti per distinguere gli spettri Raman da diversi strati di parete cellulare.

La figura 1 presenta una panoramica di un tipico sistema micro-Raman per l'imaging Raman di una parete cellulare. Ad esempio, gli spettri Raman originali del pioppo ( Populus nigra L.) presentano significative derive e spicchi di base ( Figura 2a ). Dopo aver eseguito il metodo automatico di pre-elaborazione per il set di dati Raman Imaging (APRI), questi due contaminanti spettrali vengono eliminati con successo ( Figura 2b ). Un tipico spettro di Raman di pioppo è mostrato in Figura 3 e le sue assegnazioni di banda sono elencate nella Tabella 1 . L'immagine Raman di lignina è generata dall'integrazione della regione spettrale da 1.550-1.650 cm -1 , attribuita alla struttura anulare aromatica ( Figura 4a ). La Figura 4d mostra l'immagine Raman di polisaccaridi, whIch viene raggiunto integrando il picco a 2.889 cm -1 . Per l'immagine della cellulosa e dell'emicellulosa, SMCR viene eseguita sui dati di Raman di un campione delignificato. Gli spettri e le immagini corrispondenti sono mostrati in Figura 5 . La Figura 6 presenta i risultati ottenuti mediante analisi PCA e clustering.

Figura 1: Schema di Raman Imaging per la parete cellulare delle piante. Il campione di sezione (pioppo come esempio) è misurato da un sistema micro-Raman che accoppi un microscopio ottico a uno spettrometro ad alta risoluzione Raman con un rilevatore di un dispositivo accoppiato a carica (CCD). Nell'immagine a campo luminoso, la parete cellulare è organizzata nell'angolo della cella (CC), nella lamella centrale composta (CML) e nella parete secondaria (SW). Convenzionale, un'immagine Raman viene generata da singolo piccoIntegrazione o intensità. Nei dati originali si trovano due contaminanti spettrali ( vale a dire, derive di base e spike cosmiche). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: La Raman Spectra Prima ( a ) e Dopo ( b ) Pre-elaborazione da APRI. Due contaminanti spettrali sono stati rimossi con successo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Un tipico spettro Raman della parete cellulare delle pioppi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagini Raman di Lignina ( a ) e Polisaccaridi ( b ) all'interno della parete cellulare delle pioppi. L'immagine della lignina viene generata integrando il picco intorno a 1.600 cm -1 . L'immagine della polisaccaride è prodotta integrando il picco intorno a 2.889 cm -1 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini Raman di cellulosa ( a ) e emicellulosa ( b ) all'interno della parete cellulare delle pioppi. La SMCR viene eseguita sui dati di Raman di un campione delignified. La delignificazione contribuisce all'esposizione delle caratteristiche spettrali di cellulosa e emicellulosa. La cellulosa è prevalentemente concentrata nel SW, mentre la distribuzione dell'emicellulosa è quasi uniforme per tutta la parete cellulare delle pioppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Risultati PCA e clustering analisi per identificare automaticamente diversi livelli di parete cellulare nella parete cellulare delle pioppi. Usando PCA e analisi clustering, gli spettri sono divisi in quattro parti corrispondenti al lumen cellulare, CC, CML e SW. Lo spettro medio di questi strati è riportato di seguito. I risultati hanno rivelato che la lignina è concentrata lungo il CML e nel CC, mentre i polisaccaridi sono per lo più concentrati nel SW. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Posizioni di Raman Peak e assegnazioni di banda

Gli autori non hanno niente da rivelare.