Summary
Этот протокол призван представить общий метод визуализации лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы в растительных клеточных стенках с использованием рамановского изображения и многомерного анализа.
Abstract
Применение изображений Raman для выращивания биомассы возрастает, поскольку оно может предлагать пространственную и композиционную информацию о водных растворах. Анализ обычно не требует обширной подготовки проб; Структурная и химическая информация может быть получена без маркировки. Однако каждый рамановский образ содержит тысячи спектров; Это создает трудности при извлечении скрытой информации, особенно для компонентов с аналогичными химическими структурами. В этой работе представлен многомерный анализ для решения этой проблемы. Протокол устанавливает общий метод визуализации основных компонентов, включая лигнин, целлюлозу и гемицеллюлозу в стенке растительной клетки. В этом протоколе описаны процедуры подготовки образцов, спектрального сбора и обработки данных. Он сильно зависит от навыков оператора при подготовке проб и анализе данных. Используя этот подход, рамановское расследование может быть выполнено неспециалистским пользователем для полученияH-качества и значимых результатов для анализа клеточной стенки растений.
Protocol
1. Подготовка образца
- Вырежьте небольшой образец ткани (около 3 мм х 3 мм х 5 мм) из образца растения ( например, стебель тополя).
- Погрузите ткань в кипящую деионизированную воду в течение 30 мин. Немедленно переносите его в деионизированную воду при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут. Повторите этот шаг, пока ткань не опустится до нижней части контейнера, что указывает на то, что воздух в ткани был удален и что ткань смягчилась.
Примечание. Для образцов, которые опускаются на дно до этого шага, обычно повторяйте этот цикл 3-5 раз. - Подготовьте 20, 50, 70, 90% (об. / Об.) Аликвоты полиэтиленгликоля (ПЭГ) в деионизированной воде, а также чистый ПЭГ и поддерживайте растворы при 65 ° С.
- Инкубируйте ткань в серии градуированных ванн PEG, чтобы вытеснить воду и позволить ПЭГ проникать.
Примечание. Обычно для встраивания используется ПЭГ с молекулярной массой 2000 (PEG2000).- Обработать ткань с помощью g(А) 20% ПЭГ в течение 1 ч, (б) 50% ПЭГ в течение 1,5 ч, (с) 70% ПЭГ в течение 2 ч, (г) 90% ПЭГ в течение 2 ч и (E) 100% ПЭГ в течение 10 ч.
- Предварительно нагрейте кассету при 65 ° C в духовке. Налейте ПЭГ, содержащий блок, в кассету, а затем поместите блок ткани в нужное положение, используя предварительно разогретые пинцеты или иглы.
- Медленно остывайте кассету и храните ткань при комнатной температуре до использования.
- Раскройте блок ПЭГ, содержащий ткань-мишень, в небольшой блок (около 1 см х 1 см х 2 см), используя острый лезвие бритвы и установите его на микротом.
- Вырезать тонкие секции из блока ПЭГ (обычно 3-10 мкм).
- Промойте секцию деионизированной водой в часовом стекле 10 раз, чтобы удалить ПЭГ из ткани.
- Погрузите секции толуолом / этанолом (2: 1, об. / Об.) В течение 6 часов, чтобы удалить экстракторы. Подготовьте реакционную жидкость, смешав 65 мл деионизированной воды, 0,5 мл уксусной кислоты и 0,6 г хлорида натрияОбряд в стакане. Добавьте один участок и 3 мл реакционной жидкости в 5 мл флакон. Вверните верхнюю часть флакона.
- Нагреть флакон в водяной бане при 75 ° C в течение 2 часов для удаления лигнина ткани. Промойте секцию деионизированной водой в часовом стекле 10 раз.
- Перенесите необработанную / делигнифицированную секцию на слайд стеклянного микроскопа. Разверните секцию осторожно, используя кисти или иглы. Удалите лишнюю деионизированную воду с помощью бумажной салфетки.
- Погрузите секцию в D 2 O. Накройте образец прокладкой из стеклянной крышки. Уплотните крышку с помощью лака для ног, чтобы предотвратить испарение D 2 O.
2. Спектральное приобретение
- Откройте программное обеспечение для работы с прибором конфокального рамановского микроскопа. Включите лазер (длина волны = 532 нм), сосредоточьтесь на поверхности кристаллического кремния с объективом 100X микроскопа и нажмите кнопку калибровки для калибровки прибора.
- Переключить инструментВ режим оптического микроскопа и включите лампу микроскопа. Установите скобу микроскопа на сцене, при этом обложка крышки обращена к объективу.
- Просмотрите образец с объективом микроскопа 20X и найдите интересующую область. Нанесите погружное масло на покровное стекло и переключитесь на объектив погружного микроскопа (60X, числовая апертура NA = 1,35). Сосредоточьтесь на поверхности образца.
- Переключите прибор в режим проверки комбинационного рассеяния и выключите лампу микроскопа.
- Выберите область отображения с помощью прямоугольного инструмента. Измените размер шага, чтобы определить количество полученных спектров.
Примечание. Помните о размере шага (обычно большем, чем диаметр пятна, рассчитанный с помощью числовой апертуры объекта, теоретически 1,22λ / NA). Размеры ниже этого приведут к передискретизации. - Установите оптимальные спектральные параметры для получения наилучшего отношения сигнал / шум (SNR) и спектрального качества в соответствующее время сбора (обычно <8 ч), depeНа пригодность образца. Как правило, вводятся параметры изображения в программном обеспечении следующим образом: лазер (532 нм), фильтр (100%), отверстие (300), щель (100), спектрометр (1840 см -1 ), канавки (1200 т), объектив ( 60X) и время сбора (2 с).
- Сохраните спектральные данные перед обработкой данных и преобразуйте их в универсальный формат ( например, файлы TXT).
3. Анализ данных
- Загрузите спектральные данные (файлы TXT) в программное обеспечение для анализа данных ( например, Matlab). Примените метод шумоподавления в наборе данных для улучшения SNR ( например, алгоритм Савицкого-Голея или алгоритм вейвлета)
- Используйте необработанные образцы для получения изображений лигнина и полисахаридов. Для визуализации лигнина рассмотрим спектральный пик около 1600 см -1 из-за симметричного колебания растяжения ароматического кольца. Для получения полисахаридов (включая целлюлозу и гемицеллюлозу) используйте спектральный пик aВокруг 2889 см -1 из-за растяжения CH и CH 2 .
- Используйте делигнифицированные образцы для получения изображений целлюлозы и гемицеллюлозы. Выполните разрешение самомодельной кривой (SMCR) на полученных спектрах для выделения спектров целлюлозы и гемицеллюлозы и изображения их распределений.
- Выполните анализ основных компонентов (PCA) и анализ кластеризации по полученным данным, чтобы отличить спектры комбинационного рассеяния от разных слоев клеточных стенок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 представлен обзор типичной системы микрораманов для рамановской визуализации стенки клетки растения. В качестве примера, исходные спектры комбинационного рассеяния тополя ( Populus nigra L.) имеют значительные базовые дрейфы и всплески ( рис. 2а ). После выполнения автоматического метода предварительной обработки для набора данных изображений Raman (APRI) эти два спектральных загрязнителя успешно удаляются ( рисунок 2b ). Типичный спектр комбинационного рассеяния тополя показан на рисунке 3 , а его присвоения полос перечислены в таблице 1 . Рамановское изображение лигнина генерируется интегрированием спектральной области от 1,550 до 650 см -1 , что объясняется структурой ароматических колец ( рис. 4а ). На рис. 4, d показано изображение Рамана из полисахаридов, whIch достигается путем интегрирования пика при 2889 см -1 . Для изображения целлюлозы и гемицеллюлозы SMCR выполняется на данных изображения Raman с делигнифицированным образцом. Соответствующие спектры и изображения показаны на рисунке 5 . На рисунке 6 представлены результаты, полученные в результате анализа СПС и кластеризации.
Рисунок 1: Схема рамановской визуализации для стенок клетки растения. Образец поперечного сечения (пример тополя) измеряется с помощью микрорамановской системы, которая соединяет оптический микроскоп с рамановским спектрометром высокого разрешения с детектором с зарядовой связью (CCD). В изображении яркого поля клеточная стенка растения организована в угол ячейки (CC), составную среднюю пластинку (CML) и вторичную стенку (SW). Обычно рамановское изображение генерируется однопиковымИнтеграции или интенсивности. В исходных данных найдены два спектральных загрязнителя ( т. Е. Базовые дрейфы и космические пики). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Спектры комбинационного рассеяния до ( а ) и после ( б ) Предварительная обработка АПРИ. Два спектральных загрязнителя успешно удалены. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Типичный рамановский спектр стенки тополь-клещей. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Рамановские изображения лигнина ( а ) и полисахаридов ( б ) в стенке ячеек тополя. Изображение лигнина генерируется путем интегрирования пика около 1600 см -1 . Изображение полисахарида получается путем интегрирования пика около 2889 см -1 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Рамановские изображения целлюлозы ( а ) и гемицеллюлозы ( б ) внутри стеновой стенки тополя. SMCR выполняется по данным изображения Raman с делигнифицированным образцом. Делигнификация способствует экспонированию спектральных характеристик целлюлозы и гемицеллюлозы. Целлюлоза в основном сосредоточена в СВ, в то время как распределение гемицеллюлозы почти равномерно по всей клеточной стенке тополя. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Результаты анализа PCA и кластеризации для автоматического определения различных слоев клеточных стенок в стенке ячейки тополя. Используя PCA и кластеризации, спектры делятся на четыре части, соответствующие полости ячейки, CC, CML и SW. Ниже приведены средние спектры этих слоев. Результаты показали, что лигнин концентрируется вдоль ХМЛ и в СС, а полисахариды в основном сосредоточены в СВ. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Волновые числа (см -1 ) | Компоненты | Назначения |
| 1095 | Целлюлоза, гемицеллюлоза | Тяжелый атом CC и СО |
| 1123 | Целлюлоза, гемицеллюлоза | Тяжелый атом CC и СО |
| 1163 | Целлюлоза, гемицеллюлоза </ TD> | Тяжелый атом CC и СО-растяжение, а также вибрация HCC и HCO |
| 1275 | лигнин | Арил-O арильного OH и арил O-CH3; Гвайацильное кольцо с группой C = O |
| 1331 | Лигнин, целлюлоза, гемицеллюлоза | Гибкая вибрация HCC и HCO |
| 1378 | Целлюлоза, гемицеллюлоза | HCC, HCO и HOC изгибная вибрация |
| 1460 | Лигнин, целлюлоза, гемицеллюлоза | ГХГ и HOC изгибная вибрация |
| 1603 | лигнин | Вибрация растяжения арильного кольца, симметричная вибрация |
| 1656 | лигнин | Кольцевое сопряженное С = С, растягивающее вибрацию кониферилового спирта; C = O - растягивающая вибрация coniferaldehyde |
| 2889 | C, H | Сильная вибрация CH и CH 2 |
| L, C, H | Сильная вибрация CH в OCH 3 асимметричной вибрации |
Таблица 1: Позиции рамановского пика и назначение диапазонов
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Растительная клеточная стенка представляет собой композит, который состоит из нескольких слоев, включая угол ячейки (CC), вторичную стенку (SW, с слоями S1, S2 и S3) и составную среднюю пластинку (CML, средняя ламелла плюс смежная первичная Стенки), что затрудняет получение плоской поверхности во время подготовки образца. Таким образом, образцы растений, особенно травы, которые имеют более сложную структуру, чем древесина, часто необходимо затвердевать, чтобы обеспечить тонкое разделение. ПЭГ - идеальная твердая матрица для резки и рамановского исследования, так как она растворяется в воде. Его можно легко удалить, промыв деионизированной водой. ПЭГ, используемый для встраивания, имеет разную молекулярную массу, варьирующуюся от 1000 до 20 000. Чем выше молекулярная масса ПЭГ, тем ниже проникающая способность 10 . D 2 O поможет уменьшить флуоресценцию лигнина и имеет выраженный пик при 2490 см -1 , но не исключает флуоресцентную интерференцию. ДваОсновные шумовые сигналы перетекают в каналы вместе с фактическими сигналами: 1) флуоресценция образца и фона, а также тепловые флуктуации ПЗС, могут приводить к базовым дрейфам и 2) космические лучи могут заметно влиять на чувствительные детекторы, которые проявляются в Спектров как узкополосные шипы. Для решения этих проблем был разработан метод APRI 11 . APRI включает адаптивные итеративно редуцированные штрафные наименьшие квадраты (airPLS) и анализ основных компонентов (PCA) для устранения базовых дрейфов и космических всплесков с использованием самих спектральных признаков.
Чтобы получить изображения распределения, следует выбрать пиковую интенсивность / интеграцию и линейную подгонку целых спектров многомерными методами. Первый подходит для компонентов с конкретными комбинационными пиками ( например, лигнином), в то время как последний подходит для компонентов с сильным спектральным перекрытием ( например, целлюлоза и гемицеллюлоза). ДистрибьюторБутионные изображения лигнина и полисахаридов доступны путем интеграции конкретных пиков около 1600 см -1 и 2889 см -1 соответственно (рис. 4). Однако изображения целлюлозы и гемицеллюлозы трудно получить непосредственно путем пиковой интеграции из-за сильного спектрального перекрытия. Многомерный анализ позволяет сортировать свернутый информационный контент в соответствии с гипотезой о том, что исходные данные восстанавливаются из ограниченного числа существенных факторов 12 . Таким образом, его можно применять для различения их спектров и для получения соответствующих изображений комбинационного рассеяния. Для образцов растений присутствие экстрактивных веществ и лигнина препятствует восстановлению спектров целлюлозы и гемицеллюлозы. Необходимо удалить эти помехи до анализа SMCR данных изображения. SMCR был впервые представлен Лоутоном и Сильвестром в качестве многомерного метода, специально разработанного для решения чистого компонента fС помощью набора спектров без обращения к спектральной библиотеке для анализа данных изображения 13 . Спектральная классификация важна для дальнейшего понимания структурной и химической природы стенки клетки растения. Здесь данные визуализации были подвергнуты анализу основных компонентов (PCA) и анализу кластеризации для выделения спектров комбинационного рассеяния из разных слоев клеточной стенки 14 .
Однако этот метод имеет два ограничения. Во-первых, эффект Рамана слаб - типичное сечение полного комбинационного рассеяния составляет ~ 10 -29 см 2 на молекулу, что делает его уязвимым для интенсивной флуоресценции 15 . Возможным способом улучшения дефекта является подготовка секций как можно дольше и применение алгоритма коррекции базовой линии, но флуоресцентные сигналы трудно удалить. Во-вторых, химическая обработка является важной процедурой при достижении рамановских изображений клеткиУльзы и гемицеллюлозы, и это может увеличить риск изменения исходного химического состава. Поэтому лучше всего удалять экстракты и лигнин в максимально возможной степени, если структура клеточной стенки не будет выглядеть иначе, чем необработанная.
В заключение этот протокол подходит для изучения распределения лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы в клеточной стенке растения. Использование изображений Raman для получения желаемой информации в значительной степени зависит от навыков оператора при подготовке проб и анализе данных. Хорошая подготовка проб необходима для сбора высококачественных комбинационных спектров. Соответствующий анализ данных дает представление о крупномасштабных спектрах и извлекает скрытую информацию из изображения. В качестве фундаментального метода этот протокол можно использовать для отслеживания динамических изменений основных компонентов во время химической, физической или биологической обработки на микроуровне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Министерство науки и технологий Китая (2016YDF0600803) за финансовую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Thermo Scientific | Microm HM430 | |
| Confocal Raman microscope | Horiba Jobin Yvon | Xplora | |
| Oven | Shanghai ZHICHENG | ZXFD-A5040 |
References
- Gonzalo, G. D., et al.
- Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives. , Wiley. 38-64 (2016).
- Sun, L., et al. Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging. Bio. 108 (2), 286-295 (2009).
- Tolstik, T., et al. Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).
- Schrader, B. Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications. , John Wiley and Sons. (2008).
- Gierlinger, N., et al. Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy. Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).
- Luca, A. C. D., et al. Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy. Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).
- Schlücker, S., et al. Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies. Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).
- Cooper, J. B. Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).
- Cheng, H. J., Hsiau, S. S. The study of granular agglomeration mechanism. Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).
- Zhang, X., et al. Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data. Sci. Rep. 6, 39891 (2016).
- Shinzawa, H., et al. Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging. J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).
- Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. Self modeling curve resolution. Technometrics. 13, 617-633 (1971).
- Zhang, X., et al. Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set. Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).
- Kudelski, A. Analytical application of Raman spectroscopy. Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).
