Combinazione di Raman Imaging e analisi multivariata per la visualizzazione di lignina, cellulosa e emicellulosa nella parete cellulare delle piante

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di presentare un metodo generale per la visualizzazione della lignina, della cellulosa e dell'emicellulosa nella parete cellulare delle piante mediante imaging Raman e analisi multivariata. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biomassa vegetale, come ad esempio come si distribuiscono i principali componenti chimici nella parete cellulare delle piante. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile ottenere informazioni non distruttive e prive di manodopera sul campione con una preparazione minima del campione.

Per iniziare, taglia un piccolo blocco di tessuto dal campione di pianta. Immergere il fazzoletto in acqua deionizzata bollente per 30 minuti. Quindi, trasferirlo immediatamente in acqua deionizzata a temperatura ambiente per 30 minuti.

Ripetere questo passaggio fino a quando il fazzoletto non affonda sul fondo del contenitore, indicando che l'aria nel fazzoletto è stata rimossa e che il fazzoletto si è ammorbidito. Preparare aliquote 20%, 50%, 70% e 90% di PEG e acqua deionizzata, oltre a PEG puro. Mantieni le soluzioni a 65 gradi Celsius.

Incubare il tessuto in una serie di bagni PEG graduati per spostare l'acqua e consentire al PEG di infiltrarsi. Asciugare in 20% PEG per un'ora, 50% PEG per un'ora e mezza, 70% PEG per due ore, 90% PEG per due ore e 100% PEG per 10 ore. Quindi, preriscalda una cassetta a 65 gradi Celsius in un forno.

Versare il blocco di tessuto contenente PEG nella cassetta, quindi posizionare il blocco di tessuto nella posizione desiderata utilizzando una pinzetta o aghi preriscaldati. Raffreddare lentamente la cassetta e conservare il fazzoletto a temperatura ambiente fino al momento dell'uso. Sezionare il blocco PEG contenente il tessuto bersaglio in un piccolo blocco usando una lama di rasoio affilata.

Montare il blocco PEG piccolo sul microtomo e tagliare sezioni sottili dal blocco PEG. Quindi, sciacquare le sezioni con acqua deionizzata in una classe di orologio 10 volte per rimuovere il PEG dal tessuto. Successivamente, immergere le sezioni con toluene ed etanolo per sei ore per rimuovere gli estrattivi.

Preparare il liquido di reazione mescolando 65 ml di acqua deionizzata, 0,5 ml di acido acetico e 0,6 g di cloruro di sodio in un becher. Aggiungere una sezione e 3 mL di liquido di reazione a un flaconcino da 5 mL. Avvitare sulla parte superiore del flaconcino.

Quindi, scaldare la fiala a bagnomaria a 75 gradi Celsius per due ore per rimuovere la lignina dal tessuto. Sciacquare la sezione con acqua deionizzata in un vetro dell'orologio 10 volte. Quindi, trasferire la sezione non trattata e de-lignificata su un vetrino da microscopio.

Aprire la sezione con cura utilizzando pennelli o aghi. Rimuovere l'acqua deionizzata in eccesso con carta velina. Quindi, immergere la sezione nell'ossido di deuterio.

Coprire il campione con un vetrino coprioggetti. Sigillare il vetrino coprioggetto con smalto per unghie per evitare l'evaporazione dell'ossido di deuterio. Aprire il software operativo dello strumento del microscopio Raman confocale.

Accendi il laser e concentrati sul servizio del cristallo e del silicio con un obiettivo per microscopio 100x. Fare clic sul pulsante di calibrazione per calibrare lo strumento. Portare lo strumento in modalità microscopio ottico e accendere la lampada del microscopio.

Montare il vetrino del microscopio sul tavolino, con il vetrino coprioggetto rivolto verso l'obiettivo. Visualizzare il campione con l'obiettivo del microscopio 20x e individuare l'area di interesse. Passare all'obiettivo del microscopio a immersione.

Applicare l'olio da immersione sul vetrino coprioggetti, quindi concentrarsi sulla superficie del campione. Quindi, passare lo strumento alla modalità di test Raman e spegnere la lampada del microscopio. Scegliere un'area di mappatura utilizzando uno strumento rettangolare.

Modificare la dimensione del passo per determinare il numero di spettri ottenuti. Tenere presente che la dimensione del passo deve essere maggiore del diametro dello spot, calcolato dall'apertura numerica dell'obiettivo. Dimensioni inferiori a questo comporteranno un sovracampionamento.

Impostare i parametri spettrali ottimali per ottenere il miglior rapporto segnale/rumore e la migliore qualità spettrale e un tempo di acquisizione appropriato a seconda dell'idoneità del campione. In genere, inserire i parametri di imaging nel software dello strumento utilizzando una lunghezza d'onda laser di 532 nanometri, un filtro del 100%, un foro di 300, una fessura di 100, uno spettrometro di 1840 centimetri inversi, scanalature di 1200T, un obiettivo a olio 60x e un tempo di acquisizione di due secondi. Salvare i dati spettrali prima dell'elaborazione dei dati e convertirli in un formato universale prima di procedere all'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo.

Gli spettri Raman originali della parete cellulare del pioppo sono mostrati qui. Due principali segnali di rumore, tra cui le derive della linea di base e i picchi cosmici, si riversano nei canali insieme ai segnali effettivi. Questi dovrebbero essere rimossi prima dell'analisi dei dati.

Per eliminare questi segnali di rumore è possibile applicare una tecnica di riduzione del rumore come l'algoritmo Savitzky-Golay o l'algoritmo wavelet. Per l'imaging della lignina, si consideri il picco spettrale intorno ai 1600 centimetri inversi a causa della vibrazione di allungamento simmetrico dell'anello aromatico. Per l'imaging dei polisaccaridi, utilizzare il picco spettrale intorno a 2889 centimetri inversi a causa degli allungamenti CH e CH2.

Tuttavia, le immagini Raman di cellulosa ed emicellulosa non possono essere generate direttamente. La delignificazione è una procedura necessaria per esporre le loro caratteristiche spettrali. In generale, siamo nuovi a questo metodo.

Abbiamo difficoltà, perché richiede una formazione nella gestione e nell'aspetto del sezionamento dei campioni e nell'analisi dei dati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come acquisire informazioni chimiche sulla parete cellulare vegetale utilizzando metodi in situ. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il pretrattamento chimico per rispondere a ulteriori domande, come la recalcitranza della parete cellulare vegetale.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla natura strutturale interna e sulla topochimica all'interno della parete cellulare delle piante, può essere applicato anche ad altri campioni biologici.