Combinazione di Raman Imaging e analisi multivariata per la visualizzazione di lignina, cellulosa e emicellulosa nella parete cellulare delle piante
June 10th, 2017
Questo protocollo mira a presentare un metodo generale per la visualizzazione della lignina, della cellulosa e dell'emicellulosa nelle pareti delle cellule vegetali utilizzando l'analisi Raman e l'analisi multivariata.
L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di presentare un metodo generale per la visualizzazione della lignina, della cellulosa e dell'emicellulosa nella parete cellulare delle piante mediante imaging Raman e analisi multivariata. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biomassa vegetale, come ad esempio come si distribuiscono i principali componenti chimici nella parete cellulare delle piante. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile ottenere informazioni non distruttive e prive di manodopera sul campione con una preparazione minima del campione.
Per iniziare, taglia un piccolo blocco di tessuto dal campione di pianta. Immergere il fazzoletto in acqua deionizzata bollente per 30 minuti. Quindi, trasferirlo immediatamente in acqua deionizzata a temperatura ambiente per 30 minuti.
Ripetere questo passaggio fino a quando il fazzoletto non affonda sul fondo del contenitore, indicando che l'aria nel fazzoletto è stata rimossa e che il fazzoletto si è ammorbidito. Preparare aliquote 20%, 50%, 70% e 90% di PEG e acqua deionizzata, oltre a PEG puro. Mantieni le soluzioni a 65 gradi Celsius.
Incubare il tessuto in una serie di bagni PEG graduati per spostare l'acqua e consentire al PEG di infiltrarsi. Asciugare in 20% PEG per un'ora, 50% PEG per un'ora e mezza, 70% PEG per due ore, 90% PEG per due ore e 100% PEG per 10 ore. Quindi, preriscalda una cassetta a 65 gradi Celsius in un forno.
Versare il blocco di tessuto contenente PEG nella cassetta, quindi posizionare il blocco di tessuto nella posizione desiderata utilizzando una pinzetta o aghi preriscaldati. Raffreddare lentamente la cassetta e conservare il fazzoletto a temperatura ambiente fino al momento dell'uso. Sezionare il blocco PEG contenente il tessuto bersaglio in un piccolo blocco usando una lama di rasoio affilata.
Montare il blocco PEG piccolo sul microtomo e tagliare sezioni sottili dal blocco PEG. Quindi, sciacquare le sezioni con acqua deionizzata in una classe di orologio 10 volte per rimuovere il PEG dal tessuto. Successivamente, immergere le sezioni con toluene ed etanolo per sei ore per rimuovere gli estrattivi.
Preparare il liquido di reazione mescolando 65 ml di acqua deionizzata, 0,5 ml di acido acetico e 0,6 g di cloruro di sodio in un becher. Aggiungere una sezione e 3 mL di liquido di reazione a un flaconcino da 5 mL. Avvitare sulla parte superiore del flaconcino.
Quindi, scaldare la fiala a bagnomaria a 75 gradi Celsius per due ore per rimuovere la lignina dal tessuto. Sciacquare la sezione con acqua deionizzata in un vetro dell'orologio 10 volte. Quindi, trasferire la sezione non trattata e de-lignificata su un vetrino da microscopio.
Aprire la sezione con cura utilizzando pennelli o aghi. Rimuovere l'acqua deionizzata in eccesso con carta velina. Quindi, immergere la sezione nell'ossido di deuterio.
Coprire il campione con un vetrino coprioggetti. Sigillare il vetrino coprioggetto con smalto per unghie per evitare l'evaporazione dell'ossido di deuterio. Aprire il software operativo dello strumento del microscopio Raman confocale.
Accendi il laser e concentrati sul servizio del cristallo e del silicio con un obiettivo per microscopio 100x. Fare clic sul pulsante di calibrazione per calibrare lo strumento. Portare lo strumento in modalità microscopio ottico e accendere la lampada del microscopio.
Montare il vetrino del microscopio sul tavolino, con il vetrino coprioggetto rivolto verso l'obiettivo. Visualizzare il campione con l'obiettivo del microscopio 20x e individuare l'area di interesse. Passare all'obiettivo del microscopio a immersione.
Applicare l'olio da immersione sul vetrino coprioggetti, quindi concentrarsi sulla superficie del campione. Quindi, passare lo strumento alla modalità di test Raman e spegnere la lampada del microscopio. Scegliere un'area di mappatura utilizzando uno strumento rettangolare.
Modificare la dimensione del passo per determinare il numero di spettri ottenuti. Tenere presente che la dimensione del passo deve essere maggiore del diametro dello spot, calcolato dall'apertura numerica dell'obiettivo. Dimensioni inferiori a questo comporteranno un sovracampionamento.
Impostare i parametri spettrali ottimali per ottenere il miglior rapporto segnale/rumore e la migliore qualità spettrale e un tempo di acquisizione appropriato a seconda dell'idoneità del campione. In genere, inserire i parametri di imaging nel software dello strumento utilizzando una lunghezza d'onda laser di 532 nanometri, un filtro del 100%, un foro di 300, una fessura di 100, uno spettrometro di 1840 centimetri inversi, scanalature di 1200T, un obiettivo a olio 60x e un tempo di acquisizione di due secondi. Salvare i dati spettrali prima dell'elaborazione dei dati e convertirli in un formato universale prima di procedere all'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo.
Gli spettri Raman originali della parete cellulare del pioppo sono mostrati qui. Due principali segnali di rumore, tra cui le derive della linea di base e i picchi cosmici, si riversano nei canali insieme ai segnali effettivi. Questi dovrebbero essere rimossi prima dell'analisi dei dati.
Per eliminare questi segnali di rumore è possibile applicare una tecnica di riduzione del rumore come l'algoritmo Savitzky-Golay o l'algoritmo wavelet. Per l'imaging della lignina, si consideri il picco spettrale intorno ai 1600 centimetri inversi a causa della vibrazione di allungamento simmetrico dell'anello aromatico. Per l'imaging dei polisaccaridi, utilizzare il picco spettrale intorno a 2889 centimetri inversi a causa degli allungamenti CH e CH2.
Tuttavia, le immagini Raman di cellulosa ed emicellulosa non possono essere generate direttamente. La delignificazione è una procedura necessaria per esporre le loro caratteristiche spettrali. In generale, siamo nuovi a questo metodo.
Abbiamo difficoltà, perché richiede una formazione nella gestione e nell'aspetto del sezionamento dei campioni e nell'analisi dei dati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come acquisire informazioni chimiche sulla parete cellulare vegetale utilizzando metodi in situ. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il pretrattamento chimico per rispondere a ulteriori domande, come la recalcitranza della parete cellulare vegetale.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla natura strutturale interna e sulla topochimica all'interno della parete cellulare delle piante, può essere applicato anche ad altri campioni biologici.
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Panoramica
Questo protocollo presenta un metodo per visualizzare lignina, cellulosa ed emicellulosa nelle pareti cellulari delle piante utilizzando l'imaging Raman e l'analisi multivariata. Questa tecnica fornisce informazioni non distruttive sulla composizione chimica della biomassa vegetale.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia vegetale
- Ricerca sulla biomassa
- Chimica analitica
Sfondo
- Comprendere la composizione delle pareti cellulari delle piante è cruciale per l'utilizzo della biomassa.
- L'imaging Raman permette una mappatura chimica dettagliata dei tessuti vegetali.
- L'analisi multivariata aiuta a interpretare dati complessi dall'imaging.
- Questo metodo minimizza la preparazione del campione ed è non distruttivo.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare la distribuzione dei principali componenti chimici nelle pareti cellulari delle piante.
- Fornire un metodo senza lavoro per analizzare la biomassa vegetale.
- Migliorare la comprensione della struttura e della composizione delle pareti cellulari delle piante.
Metodi utilizzati
- Tagliare piccoli blocchi di tessuto dai campioni di piante.
- Immergere il tessuto in acqua deionizzata bollente per 30 minuti.
- Trasferire il tessuto in acqua deionizzata a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Utilizzare l'imaging Raman per la visualizzazione e l'analisi multivariata per l'interpretazione dei dati.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita di lignina, cellulosa ed emicellulosa.
- Distribuzione dimostrata dei componenti chimici nelle pareti cellulari.
- Fornito un metodo non distruttivo per analizzare i tessuti vegetali.
- Facilitato ulteriori ricerche nelle applicazioni della biomassa vegetale.
Conclusioni
- Il metodo è efficace per studiare la composizione delle pareti cellulari delle piante.
- L'imaging Raman combinato con l'analisi multivariata offre preziose informazioni.
- Questo approccio può far progredire la ricerca in biologia vegetale e utilizzo della biomassa.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables non-destructive, label-free visualization of lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls, supporting mechanistic de-risking in biomass conversion and bio-based material development. By providing spatially resolved chemical composition data, it aids in target validation for enzyme engineering and pretreatment optimization. The approach reduces reliance on destructive assays and enhances predictive confidence in early-stage biomass screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of plant cell wall architecture to inform hypotheses about biomass recalcitrance and enzyme accessibility.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating chemical distribution with enzymatic digestibility outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative spectral outputs that can be standardized for high-throughput screening of biomass variants.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through reproducible sample preparation and minimal operator-dependent variability after training.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by linking cell wall composition to phenotypic traits in biomass yield and processing efficiency.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical scaling by delivering consistent, label-free compositional data across sample sets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early biomass characterization and enabling data-driven decisions in enzyme and pretreatment development pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on structural barriers to biomass deconstruction through direct visualization of lignin-polysaccharide networks.
- Screening: Delivers assay-ready, spatially resolved chemical maps that allow comparison of genetic or treatment-induced changes in cell wall composition.
- Analytics: Generates multivariate outputs that quantify component distribution and co-localization, enabling objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by providing compositional benchmarks for assessing biomass suitability in biofuel or bioproduct pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform applicable across multiple biomass feedstocks and project stages.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity in biomass recalcitrance.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through defined spectral acquisition and data processing protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in biomass strain or pretreatment development by providing early compositional risk assessment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of biomass targets based on validated structural and compositional profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Raman spectroscopy, multivariate data analysis, and plant tissue handling.
- Dependent on access to confocal Raman microscopes with appropriate laser wavelengths and objectives.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation, sectioning, and data interpretation to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse plant species or tissue types with varying cell wall complexity.
- Limited by the need for delignification to resolve cellulose and hemicellulose signals, adding procedural steps and potential variability.
