Combinazione di Raman Imaging e analisi multivariata per la visualizzazione di lignina, cellulosa e emicellulosa nella parete cellulare delle piante
10 giugno 2017
Questo protocollo mira a presentare un metodo generale per la visualizzazione della lignina, della cellulosa e dell'emicellulosa nelle pareti delle cellule vegetali utilizzando l'analisi Raman e l'analisi multivariata.
L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di presentare un metodo generale per la visualizzazione della lignina, della cellulosa e dell'emicellulosa nella parete cellulare delle piante mediante imaging Raman e analisi multivariata. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biomassa vegetale, come ad esempio come si distribuiscono i principali componenti chimici nella parete cellulare delle piante. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile ottenere informazioni non distruttive e prive di manodopera sul campione con una preparazione minima del campione.
Per iniziare, taglia un piccolo blocco di tessuto dal campione di pianta. Immergere il fazzoletto in acqua deionizzata bollente per 30 minuti. Quindi, trasferirlo immediatamente in acqua deionizzata a temperatura ambiente per 30 minuti.
Ripetere questo passaggio fino a quando il fazzoletto non affonda sul fondo del contenitore, indicando che l'aria nel fazzoletto è stata rimossa e che il fazzoletto si è ammorbidito. Preparare aliquote 20%, 50%, 70% e 90% di PEG e acqua deionizzata, oltre a PEG puro. Mantieni le soluzioni a 65 gradi Celsius.
Incubare il tessuto in una serie di bagni PEG graduati per spostare l'acqua e consentire al PEG di infiltrarsi. Asciugare in 20% PEG per un'ora, 50% PEG per un'ora e mezza, 70% PEG per due ore, 90% PEG per due ore e 100% PEG per 10 ore. Quindi, preriscalda una cassetta a 65 gradi Celsius in un forno.
Versare il blocco di tessuto contenente PEG nella cassetta, quindi posizionare il blocco di tessuto nella posizione desiderata utilizzando una pinzetta o aghi preriscaldati. Raffreddare lentamente la cassetta e conservare il fazzoletto a temperatura ambiente fino al momento dell'uso. Sezionare il blocco PEG contenente il tessuto bersaglio in un piccolo blocco usando una lama di rasoio affilata.
Montare il blocco PEG piccolo sul microtomo e tagliare sezioni sottili dal blocco PEG. Quindi, sciacquare le sezioni con acqua deionizzata in una classe di orologio 10 volte per rimuovere il PEG dal tessuto. Successivamente, immergere le sezioni con toluene ed etanolo per sei ore per rimuovere gli estrattivi.
Preparare il liquido di reazione mescolando 65 ml di acqua deionizzata, 0,5 ml di acido acetico e 0,6 g di cloruro di sodio in un becher. Aggiungere una sezione e 3 mL di liquido di reazione a un flaconcino da 5 mL. Avvitare sulla parte superiore del flaconcino.
Quindi, scaldare la fiala a bagnomaria a 75 gradi Celsius per due ore per rimuovere la lignina dal tessuto. Sciacquare la sezione con acqua deionizzata in un vetro dell'orologio 10 volte. Quindi, trasferire la sezione non trattata e de-lignificata su un vetrino da microscopio.
Aprire la sezione con cura utilizzando pennelli o aghi. Rimuovere l'acqua deionizzata in eccesso con carta velina. Quindi, immergere la sezione nell'ossido di deuterio.
Coprire il campione con un vetrino coprioggetti. Sigillare il vetrino coprioggetto con smalto per unghie per evitare l'evaporazione dell'ossido di deuterio. Aprire il software operativo dello strumento del microscopio Raman confocale.
Accendi il laser e concentrati sul servizio del cristallo e del silicio con un obiettivo per microscopio 100x. Fare clic sul pulsante di calibrazione per calibrare lo strumento. Portare lo strumento in modalità microscopio ottico e accendere la lampada del microscopio.
Montare il vetrino del microscopio sul tavolino, con il vetrino coprioggetto rivolto verso l'obiettivo. Visualizzare il campione con l'obiettivo del microscopio 20x e individuare l'area di interesse. Passare all'obiettivo del microscopio a immersione.
Applicare l'olio da immersione sul vetrino coprioggetti, quindi concentrarsi sulla superficie del campione. Quindi, passare lo strumento alla modalità di test Raman e spegnere la lampada del microscopio. Scegliere un'area di mappatura utilizzando uno strumento rettangolare.
Modificare la dimensione del passo per determinare il numero di spettri ottenuti. Tenere presente che la dimensione del passo deve essere maggiore del diametro dello spot, calcolato dall'apertura numerica dell'obiettivo. Dimensioni inferiori a questo comporteranno un sovracampionamento.
Impostare i parametri spettrali ottimali per ottenere il miglior rapporto segnale/rumore e la migliore qualità spettrale e un tempo di acquisizione appropriato a seconda dell'idoneità del campione. In genere, inserire i parametri di imaging nel software dello strumento utilizzando una lunghezza d'onda laser di 532 nanometri, un filtro del 100%, un foro di 300, una fessura di 100, uno spettrometro di 1840 centimetri inversi, scanalature di 1200T, un obiettivo a olio 60x e un tempo di acquisizione di due secondi. Salvare i dati spettrali prima dell'elaborazione dei dati e convertirli in un formato universale prima di procedere all'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo.
Gli spettri Raman originali della parete cellulare del pioppo sono mostrati qui. Due principali segnali di rumore, tra cui le derive della linea di base e i picchi cosmici, si riversano nei canali insieme ai segnali effettivi. Questi dovrebbero essere rimossi prima dell'analisi dei dati.
Per eliminare questi segnali di rumore è possibile applicare una tecnica di riduzione del rumore come l'algoritmo Savitzky-Golay o l'algoritmo wavelet. Per l'imaging della lignina, si consideri il picco spettrale intorno ai 1600 centimetri inversi a causa della vibrazione di allungamento simmetrico dell'anello aromatico. Per l'imaging dei polisaccaridi, utilizzare il picco spettrale intorno a 2889 centimetri inversi a causa degli allungamenti CH e CH2.
Tuttavia, le immagini Raman di cellulosa ed emicellulosa non possono essere generate direttamente. La delignificazione è una procedura necessaria per esporre le loro caratteristiche spettrali. In generale, siamo nuovi a questo metodo.
Abbiamo difficoltà, perché richiede una formazione nella gestione e nell'aspetto del sezionamento dei campioni e nell'analisi dei dati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come acquisire informazioni chimiche sulla parete cellulare vegetale utilizzando metodi in situ. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il pretrattamento chimico per rispondere a ulteriori domande, come la recalcitranza della parete cellulare vegetale.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla natura strutturale interna e sulla topochimica all'interno della parete cellulare delle piante, può essere applicato anche ad altri campioni biologici.
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Panoramica
Questo protocollo presenta un metodo per visualizzare la lignina, la cellulosa e l'emiceullulosa nelle pareti cellulari vegetali mediante imaging Raman e analisi multivariata. Questa tecnica fornisce informazioni non distruttive sulla composizione chimica della biomassa vegetale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia vegetale
- Ricerca sulla biomassa
- Chimica analitica
Sfondo
- Comprendere la composizione della parete cellulare vegetale è fondamentale per l'utilizzo della biomassa.
- L'imaging Raman consente una mappatura chimica dettagliata dei tessuti vegetali.
- L'analisi multivariata facilita l'interpretazione dei dati complessi ottenuti dall'imaging.
- Questo metodo minimizza la preparazione del campione ed è non distruttivo.
Scopo dello studio
- Visualizzare la distribuzione dei principali componenti chimici nelle pareti cellulari vegetali.
- Fornire un metodo senza intervento manuale per analizzare la biomassa vegetale.
- Migliorare la comprensione della struttura e composizione della parete cellulare vegetale.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento di piccoli blocchi di tessuto da campioni vegetali.
- Immersione del tessuto in acqua deionizzata bollente per 30 minuti.
- Trasferimento del tessuto in acqua deionizzata a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Utilizzo dell'imaging Raman per la visualizzazione e di analisi multivariata per l'interpretazione dei dati.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita di lignina, cellulosa ed emicellulosa.
- Dimostrazione dei modelli di distribuzione dei componenti chimici nelle pareti cellulari.
- Fornito un metodo non distruttivo per l'analisi dei tessuti vegetali.
- Agevolato ulteriori ricerche nelle applicazioni della biomassa vegetale.
Conclusioni
- Il metodo è efficace per lo studio della composizione della parete cellulare vegetale.
- L'imaging Raman combinato con l'analisi multivariata offre informazioni preziose.
- Questo approccio può far progredire la ricerca in biologia vegetale e nell'utilizzo della biomassa.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente una visualizzazione non distruttiva e senza etichette della lignina, della cellulosa e dell'emiceullulosa nelle pareti cellulari vegetali, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella conversione della biomassa e nello sviluppo di materiali di origine biologica. Fornendo dati sulla composizione chimica con risoluzione spaziale, facilita la validazione degli obiettivi nell'ingegnerizzazione enzimatica e nell'ottimizzazione dei pretrattamenti. L'approccio riduce la dipendenza da saggi distruttivi e migliora la fiducia predittiva nei flussi di lavoro di screening della biomassa nelle fasi iniziali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'architettura della parete cellulare vegetale per formulare ipotesi sulla recalcitranza della biomassa e sull'accessibilità degli enzimi.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale degli obiettivi correlando la distribuzione chimica con i risultati della digeribilità enzimatica.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera output spettrali quantitativi che possono essere standardizzati per lo screening ad alto rendimento di varianti di biomassa.
- Valore operativo: Favorisce la prontezza del saggio attraverso una preparazione campionaria riproducibile e una variabilità minima dipendente dall'operatore dopo un adeguato addestramento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce informazioni rilevanti sul sistema della malattia collegando la composizione della parete cellulare a caratteristiche fenotipiche nella resa della biomassa e nell'efficienza di lavorazione.
- Valore operativo: Consente la continuità dalla scoperta alla scala preclinica fornendo dati compositivi coerenti e privi di marcatori attraverso diversi set di campioni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica, supportando la caratterizzazione precoce della biomassa e consentendo decisioni basate sui dati nello sviluppo di enzimi e nei processi di pretrattamento.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui barriere strutturali alla degradazione della biomassa attraverso la visualizzazione diretta delle reti lignina-polisaccaridi.
- Screening: Fornisce mappe chimiche pronte per il saggio e risolte spazialmente, che permettono di confrontare le variazioni indotte da modifiche genetiche o trattamenti nella composizione della parete cellulare.
- Analisi: Genera output multivariati che quantificano la distribuzione e la co-localizzazione dei componenti, consentendo confronti oggettivi tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica fornendo parametri compositivi per valutare l'idoneità della biomassa nei percorsi di produzione di biocarburanti o bioprodotti.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging e analisi riutilizzabile, applicabile a diverse matrici di biomassa e fasi progettuali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella selezione delle biomasse riducendo l'ambiguità meccanicistica della ricalcitranza della biomassa.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la scalabilità attraverso protocolli definiti per l'acquisizione spettrale e l'elaborazione dei dati.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo di ceppi di biomassa o di trattamenti preeliminarie fornendo una valutazione precoce dei rischi compositivi.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei target di biomassa aggiustata rispetto al rischio, basata su profili strutturali e compositivi validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in spettroscopia Raman, analisi multivariata dei dati e manipolazione dei tessuti vegetali.
- È subordinato all'accesso a microscopi Raman confocali dotati di lunghezze d'onda laser e obiettivi appropriati.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione dei campioni, la sezionatura e l'interpretazione dei dati, al fine di garantire la riproducibilità.
- Richiede opportune adattamenti quando il metodo viene applicato a diverse specie vegetali o tipi di tessuto con diversa complessità della parete cellulare.
- È limitato dalla necessità di delignificazione per risolvere i segnali di cellulosa ed emicellulosa, con conseguente aggiunta di passaggi procedurali e potenziale variabilità.
