Summary
Acid postkonditionering beskytter mod cerebral iskæmi. Her præsenterer vi to modeller til at udføre APC. De opnås henholdsvis ved at overføre kortikostriatale skiver til sur buffer efter oxygen-glucose-deprivation in vitro og ved at inhalere 20% CO 2 efter midter cerebral arterieeklusion i vivo .
Abstract
Stroke er en af de førende årsager til dødelighed og handicap verden over, med begrænsede terapeutiske tilgange. Som en endogen strategi for neuroprotektion har postkonditionerende behandlinger vist sig at være lovende terapier mod cerebral iskæmi. Imidlertid begrænser komplicerede procedurer og potentielle sikkerhedsproblemer deres kliniske anvendelse. For at overvinde disse ulemper har vi udviklet sur postconditioning (APC) som en terapi til eksperimentel fokal cerebral iskæmi. APC refererer til mild acidosebehandling ved inhalation af CO 2 under reperfusion efter iskæmi. Her præsenterer vi to modeller til henholdsvis APC in vitro og in vivo . Oxygen-glucose deprivation (OGD) behandling af mus og corticostriatal okklusion og midter cerebral arterie okklusion (MCAO) af mus blev anvendt til at efterligne cerebral iskæmi. APC kan simpelthen opnås ved at overføre hjerneskiver til sur puffer boblet med 20% CO 2 , oR ved mus inhalering 20% CO 2 . APC viste signifikante beskyttende virkninger mod cerebral iskæmi, som afspejlet af vævsevnen og hjerneinfarktvolumen.
Introduction
Slag er en af de førende årsager til dødelighed og handicap verden over. Der er gjort en stor indsats for at finde effektive behandlinger for slagtilfælde i de sidste årtier, men præstationen er ret utilfredsstillende. Postkonditionering er en proces manipuleret af subtoksiske belastninger efter en iskæmisk episode. Postkonditionering, herunder iskæmisk, hypoxisk, lavglucose og fjern iskemisk efterkonditionering, udløser endogene adaptive mekanismer og har vist sig at være lovende behandlinger mod cerebral iskæmi 1 , 2 , 3 , 4 . Imidlertid kan iskæmisk postkonditionering indføre yderligere skade. Limben fjern iskemisk postkonditionering har normalt brug for flere cykler med 5-20 min okklusion og reperfusion på de ipsilaterale eller bilaterale bagben 5 , 6 , 7 . thDerfor er disse efterbehandlingsmanipulationer farlige eller upraktiske i klinisk praksis. For at overvinde disse ulemper har vi udviklet APC som en terapi for fokal cerebral iskæmi hos mus 8 . Induceret simpelthen ved at indånde 20% CO 2 , reducerer APC signifikant iskæmisk hjerneskade på en mere gennemførlig og sikrere måde. For nylig har vi bevist, at APC udvider reperfusionsvinduet og fremhæver APC's betydning for strokebehandling 9 .
Her præsenterer vi to eksperimentelle modeller for at studere neuroprotektion af APC mod cerebral iskæmi. Den første er oxygen-glucose deprivation (OGD) model i mus kortikostriatale skiver. Hurtig forberedelse og overførsel af hjerneskiver til et kunstigt miljø, som regel kunstig cerebrospinalvæske (ASCF), kan bevare cellelevedygtighed og neuronalkredsløb, hvilket gør det muligt at studere hjernefunktion in vitro 10 <Sup> 11 . OGD i ASCF efterligner cerebral iskæmi og inducerer iskæmisk skade 12 , 13 , 14 . Efter OGD bliver hjerneskiverne opdateret i almindelig ASCF (r-ASCF) for at give reperfusion og derefter behandlet med APC ved anvendelse af sur ASCF boblet med 20% CO 2 . Den kortikostriatale skive opretholder den intakte histologiske karakterisering sammenlignet med primære dyrkede celler.
For at studere hjernefunktion in vivo anvendes musen mellem cerebral arterieeklusion (MCAO) -modellen. Den midterste cerebrale arterie er blokeret ved at indsætte et flammeformet monofilament via den fælles halspulsårer. Som en af de mest anvendte stroke-modeller viser MCAO-modellen klinisk relevans, og anvendelsen af et monofilament gør det lettere at opnå reperfusion. Blot ved at indånde normoxisk blandet gas indeholdende 20% CO 2 efter indtræden af reperfusioN viste APC signifikante beskyttende virkninger mod cerebral iskæmi indikeret ved reducerede hjerneinfarktvolumener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev godkendt af og udført i overensstemmelse med de etiske retningslinjer fra Zhejiang University Animal Experimentation Committee og var i fuld overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til pleje og brug af laboratoriedyr. Der blev gjort en indsats for at minimere smerte eller ubehag, og det mindste antal dyr blev brugt.
1. OGD af Corticostriatal Skiver
- Opløsning forberedelse:
- Forbered 1.000 ml r-ACSF (124 mmol / l, NaCl, 5 mmol / l KCI, 1,25 mmol / l KH 2PO 4, 2 mmol / l MgSO4, 26 mmol / l NaHCO3, 2 mmol / l CaCl2, 10 mmol / l glucose, endelige pH 7,4). Boble med 5% CO 2 og 95% O 2 i hele eksperimentet.
- Forbered 200 ml glucosefri ACSF (gf-ACSF) som ovenfor, undtagen glucose, boblet med 5% CO 2 og 95% N 2 . Boble gasserne i 30 minutter, før de påføres brAin skiver for at reducere iltindholdet i opløsningen. Fortsæt bobler, indtil OGD-proceduren er færdig.
- Forbered sur ACSF (a-ACSF) ved at ækibrere 200 ml r-ACSF med 20% CO 2 og 80% O 2 . Boble gassen i 30 minutter før påføring på hjerneskiver for at reducere opløsningens pH til pH 6,8 og fortsæt bobler, indtil APC-proceduren er afsluttet.
- Placer tre vævsholdere i henholdsvis r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF.
- Hjerneskive forberedelse:
Bemærk: 8 uger gamle han C57Bl / 6J mus blev anvendt i denne undersøgelse. Dyrene blev anbragt under kontrolleret temperatur (22 ± 2 ° C) med en 12 timers mørk cyklusperiode og adgang til pelleteret mad og vand.- Sacrifice en mus med en isofluran overdosis i et induktionskammer. Dekapiter musen. Dissect ud hjernen ved hjælp af små saks og tang. Fjern hjernen med en tynd spatel og slip den omhyggeligt ind i en glasbæger conTaining iskold r-ACSF ækvilibreret med 5% CO2 og 95% O2.
BEMÆRK: Disse trin skal udføres så hurtigt men omhyggeligt som muligt. - Hold hjernen i iskold r-ACSF i 5 minutter. Juster gastrykket for at undgå bevægelser i hjernen.
- Placer cryoprecipitate lim på vibratomepladen i to strimler. Sæt et stykke 3% agarose på limstrimlen væk fra bladet for at understøtte hjernen.
- Inverter en 10 cm petriskål på is og læg derefter et filterpapir på fadet. Fugt filterpapiret med dråber iskold r-ACSF.
- Overfør hjernen til filterpapiret med tang. Afskær frontpolen og hjernebenet med kniv og pincet.
BEMÆRK: De tværgående sektioner skal være så glatte som muligt og lodret til sagittalplan. - Anbring det resterende hjernevæv lodret på den anden limstrimmel og hold hjernen lænende mod agarosen. Tilsæt iskold r-ACSF til skærebeholderen tilNedsænke hjernen og tilsæt is til isholderen. Hold r-ACSF i reservoiret boblet med 5% CO 2 og 95% O 2 .
- Hæv reservoiret og juster barbermaskinens position for at placere barbermaskinen så tæt på hjernen som muligt og lige over hjernen.
- Vælg "CONT" -tilstand for at skære hjerneafsnittene kontinuerligt. Indstil skære tykkelsen til 400 μm, vibrerende frekvens til 6 - 8 og hastighed til 3 - 4. Tryk på "start / stop" knappen for at starte automatisk skæring.
- Skær spidsen af en 3 ml Pasteur pipette for at lave en åbning, der matcher størrelsen af hjerneskiverne.
BEMÆRK: Åbningen skal være stor nok til at undgå yderligere skader på hjerneskiverne. - Tegn fem hjerne skiver en efter en med tip-cutPasteur pipetten og læg dem i vævsholderen i iskold r-ACSF boblet med 5% CO 2 og 95% O 2 . Saml ikke den første skive produceret. Juster gastrykket til avoiD bevægelser af hjerneskiverne.
BEMÆRK: Hjerneskiverne bør ikke dække hinanden. - Placer hjerneskiver med r-ACSF ved stuetemperatur i 30 minutter og derefter ved 37 ° C i et vandbad i yderligere 10 minutter for at genvinde synaptiske funktioner.
- Sacrifice en mus med en isofluran overdosis i et induktionskammer. Dekapiter musen. Dissect ud hjernen ved hjælp af små saks og tang. Fjern hjernen med en tynd spatel og slip den omhyggeligt ind i en glasbæger conTaining iskold r-ACSF ækvilibreret med 5% CO2 og 95% O2.
- OGD og APC:
- Anbring gf-ACSF og a-ACSF i et 37 ° C vandbad og boble bufferne med de tilsvarende gasser som nævnt ovenfor i 1.1.2 og 1.1.3 i 30 minutter.
- Efterlad en skive i r-ACSF som kontrol. Overfør de fire andre hjerneskiver ind i vævsholderen med forvarmet gf-ACSF omhyggeligt og inkuber i 15 minutter. Overfør skiverne tilbage i vævsholderen i r-ACSF for at opnå reperfusion.
- For at studere tidsvinduet for APC skal du overføre et skive direkte fra gf-ACSF til a-ACSF. Overfør de øvrige tre skiver til r-ACSF i første omgang og overfør derefter to af dem til vævsholderen i henholdsvis a-ACSF 5 og 15 min efter reperfusion.
- IncubatE de to skiver i a-ACSF i 3 minutter og overfør dem derefter tilbage til r-ACSF. Inkuber de tre skiver i r-ACSF i yderligere 1 time. Indstil de resterende skiver i r-ACSF som OGD-gruppen.
- For et dosisresponsstudie skal alle fire skiver overføres til vævsholderen i r-ACSF først efter OGD og inkuberes i 5 minutter. Læg derefter et skive i r-ACSF som OGD-gruppen og overfør de øvrige tre skiver til a-ACSF. Inkuber skiverne i a-ACSF i henholdsvis 1, 3 og 5 minutter og overfør dem derefter tilbage til r-ACSF. Inkuber de tre skiver i r-ACSF i yderligere 1 time.
- Slice levedygtighed bestemmelse:
- Forbered 0,25% 2,3,5-triphenyltetrazoliumhydrochlorid (TTC) normal saltopløsning. Tilsæt 1,25 g TTC pulver til 500 ml normal saltopløsning.
BEMÆRK: Efter at pulveret er helt opløst, overfør opløsningen til en brønd på 24 brønde (500 μL pr. Brønd), der er dækket af folie og opbevar den ved 4 ° C. TTC og væv farvet med TTC er lys sensitiv. - Overfør skiverne i en 24-brønds plade (en skive pr. Brønd), der indeholder TTC-opløsning og strække skiven i opløsningen. Inkuber skiverne i TTC-opløsning ved 37 ° C i et lavt vandbad i 30 minutter.
- Overfør skiverne i rene 1,5 ml centrifugerør, der er dækket af folie, og måler skivernes tørvægt.
- Tilsæt ethanol / dimethylsulfoxid (1: 1) i centrifugerørene (v: w = 10: 1) for at ekstrahere formazan. Inkuber skiverne i ethanol / dimethylsulfoxid ved stuetemperatur væk fra lys i 24 timer.
- Tilsæt alt ethanol / dimethylsulfoxid i rørene i en 96-brønds plade og måle absorbansen ved 490 nm ved hjælp af en pladelæser.
- Normaliser absorbansen til den tørre vægt af skiven og udtrykkelig levedygtighed som procentdelen af kontrolskive.
- Forbered 0,25% 2,3,5-triphenyltetrazoliumhydrochlorid (TTC) normal saltopløsning. Tilsæt 1,25 g TTC pulver til 500 ml normal saltopløsning.
2. MCAO
- Forberedelse:
- Desinficere arbejdsbordet, overfladen af Laser Doppler FlowmetrY (LDF) instrument og dets tilbehør med 70% ethylalkohol.
- Forbered autoklaverede instrumenter: to saks, 10 cm; To tang, 10 cm; En oftalmisk pincet, 11 cm; En mikro oftalmisk saks, 9 cm; En microvessel klemme, 1,8 cm; Oneneedle-drev, r 12,5 cm; Flere kirurgiske suturer (△ 1/2 4 × 10); vatpinde.
- Klargør en sprøjte (uden nål) med saltopløsning for at opretholde et hydratiseret betjeningsområde.
- Forbered bedøvelsesgasen (100% O 2 + isofluran).
- Påvisning af hjernens blodgennemstrømning:
- Indstil LDF instrumentet.
- Injicer analgetika intraperitonealt i musen: Metamizol 200 mg / kg, carprofen 4 mg / kg og buprenorphin 0,1 mg / kg.
- Anbring musen i et induktionskammer med 4% isofluran i ilt for at bedøve det, indtil spontan bevægelse af krop og vibrationer stopper.
- Placer musen i en udsat position med næsen monteret i thE næsekegle og opretholde isofluran ved 1,5% til den efterfølgende procedure.
- Påfør dexpanthenol øjensalve på begge øjne.
- Desinficere hovedet med 70% ethylalkohol.
- Lav en ret paramedian hud snit mellem øjne og ører ved hjælp af en skalpel for at afsløre bregma.
- Gnid kraniet med steril bomuld.
- Påfør en til to dråber kirurgisk lim til overfladen af kraniet.
- Placer spidsen af fiberoptisk sonde 5 mm caudal til bregma og 6 mm lateral til midterlinien.
- Start med at optage blodgennemstrømningen på computersoftwaren. Vent, indtil der er en stabil blodgennemstrømningsgrundlinje, og anbring derefter en 20 μl katalysator på limen for at fastgøre proben.
BEMÆRK: En ideel baseline bør være mere end 500 flux. - Hvis baseline er mindre end 200 flux, skal du justere positionen fint for at få en passende basislinje. Hold sonden fastgjort til kraniet for eksperimentets varighed.
- Desinficere hovedet med iodophor afTil den fiberoptiske sonde fastgjort.
- MCAO:
- Placer og fix den bedøvede mus (med LDF sonde fastgjort til kraniet) i en liggende stilling og opretholde sin kropstemperatur ved hjælp af en varmelampe igennem operationen. Desinficer halsen med 70% ethylalkohol.
- Lav en paramedian hud snit i nakken ved hjælp af en skalpel; Blunt dissekere det bløde væv med pincet for at udsætte skibe. Tilsæt en dråbe saltvand til de udsatte væv for at holde dem dehydreret.
- Dissect den fælles halspulsårer fra omgivende væv og vagusnerven ved hjælp af oftalmiske pincet. Pas på ikke at skade vagusnerven. Desinficer huden af halsen igen med iodophor efter at den fælles halspulsår er udsat.
- Placér en mikroklemsklemme ved den distale ende af den fælles halspulsårer, og bind derefter en død knude med 6-0 silkesuturer i den proximale ende. Placér klemmen så proksimalt som muligt for efterfølgende operationer. Sørg for, at længden afSkibet mellem klemmen og den døde knude er så lang som muligt for efterfølgende operationer.
- Lav en midlertidig sutur proximal i klemmen ved at binde en løs knude. Sørg for, at der er plads nok mellem to knuder til monofilamentindsættelse.
- Lav et lille længdesnit mellem de to knuder med mikro-oftalmiske saks. Sørg for, at snittet er så tæt på den døde knude som muligt for efterfølgende operationer. Pas på ikke at skære fartøjet.
- Indsæt en 12 mm spidsstumpet monofilament gennem snittet for at komme ind i lårets lumen og forskyde det et par mm. Stram den løse knude rundt om monofilamentets spids og fjern derefter klemmen.
- Forlæng filamentet i den indre halspulsårer (10 mm for at lukke den midterste hjernearterie) med oftalmiske pincet, indtil LDF-softwaren viser en kraftig tilbagegang (> 80% reduktion fra blodlinjen i blodet) i blodgennemstrømningen. Optag starttidspunktet for okklusion.
BEMÆRK: LDF instrument setup erBeskrevet i afsnit 2.2. - Undgå den midterste cerebrale arterie i 1 time. Afskær LDF-sonden og sæt musene i en 30 ° C inkubator under okklusionsvarigheden.
- Reperfusion og APC:
- Nyt dyrene igen med isofluran som beskrevet ovenfor 55 minutter efter begyndelsen af okklusionen. Placer og fix mus i liggende stilling. Åbn nakkeindsnittet og genudsæt den fælles halspulsårer.
- Træk forsigtigt filamentet ud med oftalmiske tang efter okklusionsperioden for at opnå reperfusion og drej den midlertidige sutur i en permanent ved at stramme knuden.
- For acidose behandling, ændre gas inhaleret af næsekeglen til mix gasser, der indeholder 20% CO2, 20% O2 og 60% N2 i 5 minutter ved 5, 50 eller 100 min efter reperfusion. Luk snittet med en afbrudt kirurgisk sutur.
- Placer mus i en 30 ° C varmekur, indtil mus genvinder bevidsthedenOg returner derefter musene til at rengøre, individuelle bur. Giv mus med en petriskål med vand og fugtet mad. Overvåg musene tæt efter operationen for overdreven smerte og død.
- Hjerneinfarkt volumenmåling:
- Mål hjerneinfarktvolumen ved anvendelse af TTC-farvning 24 timer efter reperfusion.
- Forbered 0,25% TTC-opløsning som nævnt i trin 1.4.1 forud for den angivne tid for ofringen. Overfør opløsningen til en 24-brønds plade (1 ml pr. Brønd), der er dækket af folie og opbevar den ved 4 ° C.
BEMÆRK: TTC og væv farvet med TTC er lysfølsomme. - Efter 24 timer efter reperfusion ofre dyret med en isofluran-overdosis i et induktionskammer. Dekapiter musene. Dissect hjernerne ved hjælp af små saks og tang. Undersøg blodingspunkter på hjernen for at udelukke de mus, der undergik subarachnoid blødning ved Cirkel af Willis.
- Placér hjernen på en ren glasskinne på -20 ° C ice pack. Placer hjernen og glasskinnen i en -20 ° C køleskab i 5 minutter for at gøre hjernen nemmere at skære.
- Tag hjernen og glasskiven ud fra -20 ° C og sæt dem tilbage på -20 ° C ispakningen. Dissect frontpolen og cerebellum med kniv og pincet.
- Skær hjernesektionerne vandret til en 1 mm tykkelse med et blad til at producere 5 skiver. Overfør skiverne i 24-brøndspladen med TTC-opløsning (1 skive pr. Brønd) med tang og stræk skiverne i opløsningen. Inkuber skiverne i TTC-opløsning ved 37 ° C i et lavt vandbad i 30 minutter.
- Aspirer TTC-opløsningen. Tilsæt 10% formaldehyd (1 ml pr. Brønd) og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter. Placer skiverne i den rækkefølge, hvor de blev skåret på et cellofanark og scann segmenterne ind i fotografisk pladebilleder.
- Analyser infarktstørrelsen som en procentdel af hele hjerneskiven ved hjælp af ImageJ analyse softwareLass = "xref"> 8 baseret på visuel identifikation; Se figur 2 (til venstre).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den ovenfor beskrevne kortikostriatale skivemodel blev corticostriatal skive-levedygtighed kvantificeret ved TTC-analyse efter 1 h efter reperfusion. TTC-omdannelse blev beregnet ved normalisering af absorptionen ved 490 nm til kontrolstykket. Ifølge TTC-omdannelse beskyttes APC mod OGD-induceret reperfusionsskade i en starttid og varighedsafhængig måde. I detaljer blev både 1 og 3 min. Acidosisbehandling signifikant forbedret levedygtighed ved 5 minutter efter 15 min OGD, mens 5 minutter ikke (OGD: 0,609 ± 0,029, 5/1: 0,758 ± 0,034, 5/3: 0,821 ± 0,041, 5/5: 0,672 ± 0,053, data rapporteret som gennemsnit ± SEM) ( Figur 1 A ). Neuroprotektionen ved acidosebehandling forblev beskyttende inden for 5 minutter efter reperfusion, mens 15 minutter ikke (OGD: 0,584 ± 0,044, 0/3: 0,762 ± 0,036, 5/3: 0,833 ± 0,062, 15/3: 0,627 ± 0,038) ( figur 1 B ).
I MCAO-modellen indledtes 5 minutter af acidosebehandling efter 5 minutter efter indtræden af reperfusion reddet celledød forårsaget af iskæmisk fornærmelse, afspejlet af mindre infarktvolumener (MCAO: 33,4 ± 4,4%, 5/5: 16,6 ± 2,7%, 50 / 5: 19,5 ± 2,1%, 100/5: 37 ± 2,1%). Neuroprotektionen var stadig robust, selv når starttidspunktet blev forsinket til 50 minutter efter reperfusion. Imidlertid blokerede ikke acidosebehandling på 100 minutter de iskæmiske skader ( figur 2 ).
Alle data blev indsamlet og analyseret på blindet måde. Data præsenteres som middelværdi ± SEM. I den kortikostriatale skivemodel har hver gruppe 6-8 prøver. I MCAO-modellen har hver gruppe 9-10 prøver. Envejsanalyse af varians med mindst signifikant forskel blev anvendt til flere sammenligninger.
Figur 1 . APC beskytter mod OGD-induceret reperfusionsskader i kortikostriatale skiver. Kortikostriatale skiver blev behandlet med acidose (pH 6,8) for indikerede varigheder (A) og indikerede opsvingperioder (B) efter OGD. Celle-levedygtigheden blev bedømt ved hjælp af 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazoliumbromidassayet efter 24 timer efter reperfusion, og corticostriatal skive-levedygtighed blev kvantificeret ved TTC-analyse efter 1 h efter reperfusion. Værdier viser middel ± SEM. N = 6-8 for hver gruppe; * P <0,05 og ** p <0,01 ved envejsanalyse af varians; R, reperfusion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 . APC beskytter mod MCAO-induceret skade i mus. Dyr blev udsat for 60 min MCAO og behandlet ved inhalering af 20% C02 i 5 minutter ved 5, 50 eller 100 minutter efter reperfusion. Infarct volumen blev kvantificeret ved 2,3,5-triphenyltetrazoliumhydrochloridfarvning efter 24 h efter reperfusion (angivet med sort prikket linie på venstre panel). Værdier viser middel ± SEM. N = 8 - 10 for hver gruppe; * P <0,05 og ** p <0,01 ved envejsanalyse af varians; R, reperfusion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi to eksperimentelle modeller for at studere neuroprotektion af APC mod cerebral iskæmi. I hjerneskiver opnås APC ved at inkubere mus kortikostriatale skiver i sur puffer boblet med 20% CO 2 efter reperfusionsstart, mens APC opnås ved at inhalere 20% CO 2 til mus efter reperfusion. Begge modeller afspejler neuroprotektion af APC mod cerebral iskæmi. Beskyttelsen var sammenlignelig med den, der blev opnået ved iskæmisk efterkonditionering, men med et bredere tidsvindue. I MCAO-modellen kunne tidsvinduet være så længe som 50 min efter reperfusion sammenlignet med 10 min for iskæmisk efterkonditionering 15 . Desuden er proceduren for APC lettere og sikrere.
I den kortikostriatale skivermodel er blide og hurtige operationer afgørende for at garantere levedygtigheden af hjerneskiver i den maksimale grad. Til MCAO-ydeevnen er den cerebrale blodgennemstrømningsovervågningKræves, og det skarpe fald i blodgennemstrømningen skal observeres for at sikre okklusion af den midterste cerebrale arterie. Efter at hjernerne blev dissekeret for TTC-farvning, er nøje undersøgelse af hjernerne nødvendig for udelukkelse af subarachnoid blødning.
Forlængelsen og varigheden af acidose er kritiske for at opnå neuroprotektion af APC. Forlænget varighed af acidosebehandling er ikke gavnlig i kortikostriatalskiver model ( Figur 1 A ). Desuden er vores tidligere undersøgelse viste, at både 10% og 20% CO2 inhalation, snarere end 30% CO2 inhalation bibringe neurobeskyttelse på mus 8. Disse antyder mild acidose er afgørende for neuroprotektionen af APC, og derfor er koncentrationen af CO 2 og varigheden af APC uundværlig for acidose-neuroprotektion.
Ud over TTC-farvning kan mange teknikker kombineres til sAt opfylde forskelligartede forskningsbehov. For eksempel kan ekstracellulær elektrisk optagelse tilføjes til det sidste trin for at observere, hvordan iskæmi og acidose påvirker neuralt potentiale 16 . Perfusionsopløsningen af hjerneskive kan også opsamles for at måle koncentrationsændringen af aminosyre-neurotransmittere efter APC ved HPLC 17 . Skiver af bestemte hjerneområder kan være parat til at studere svarene fra et bestemt område til iskæmi og APC. Alt i alt kan mange alternativer indføres for at belyse virkningerne af iskæmi og acidose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 og 81402907), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (LR15H310001) og Programmet for Zhejiang Leading Team af S & T Innovation Team (2011R50014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C5080 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride | Sigma | T8877 | |
| Absolute Ethanol | Aladdin Industrial Corporation | E111993 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Laser Doppler Flowmetry | Moor Instruments Ltd | Model Moor VMS-LDF2 | |
| Diethyl ether anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 80059618 | |
| Trichloroacetaldehycle hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 30037517 | |
| 10% Formalin | Aladdin Industrial Corporation | F111936 | |
| 24-well plates | Jet Biofil | TCP-010-024 |
References
- Zhao, H., Sapolsky, R. M., Steinberg, G. K. Interrupting reperfusion as a stroke therapy: ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (9), 1114-1121 (2006).
- Leconte, C., et al. Delayed hypoxic postconditioning protects against cerebral ischemia in the mouse. Stroke. 40 (10), 3349-3355 (2009).
- Fan, Y. Y., et al. Transient lack of glucose but not O2 is involved in ischemic postconditioning-induced neuroprotection. CNS Neurosci Ther. 19 (1), 30-37 (2013).
- Hess, D. C., Hoda, M. N., Bhatia, K. Remote limb perconditioning [corrected] and postconditioning: will it translate into a promising treatment for acute stroke. Stroke. 44 (4), 1191-1197 (2013).
- Ren, C., Yan, Z., Wei, D., Gao, X., Chen, X., Zhao, H. Limb remote ischemic postconditioning protects against focal ischemia in rats. Brain Res. 1288, 88-94 (2009).
- Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K(ATP) channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (5), 851-859 (2012).
- Li, P., et al. Remote limb ischemic postconditioning protects mouse brain against cerebral ischemia/reperfusion injury via upregulating expression of Nrf2, HO-1 and NQO-1 in mice. Int J Neurosci. , 1-8 (2015).
- Fan, Y. Y., et al. A novel neuroprotective strategy for ischemic stroke: transient mild acidosis treatment by CO2 inhalation at reperfusion. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 275-283 (2014).
- Shen, Z., et al. PARK2-dependent mitophagy induced by acidic postconditioning protects against focal cerebral ischemia and extends the reperfusion window. Autophagy. 0, (2017).
- Skolnik, J., Takacs, L., Szende, E. In vitro oxygen consumption of slices from kidney, brain, cortex and liver in hypoxia. Nature. 209 (5020), 305 (1966).
- Lynch, G., Schubert, P. The use of in vitro. brain slices for multidisciplinary studies of synaptic function. Annu Rev Neurosci. 3, 1-22 (1980).
- Zheng, S., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces purkinje cell death in an in vitro model of rat cerebellar ischemia. Neuroscience. 118 (1), 99-106 (2003).
- Yin, B., Barrionuevo, G., Weber, S. G. Optimized real-time monitoring of glutathione redox status in single pyramidal neurons in organotypic hippocampal slices during oxygen-glucose deprivation and reperfusion. ACS Chem Neurosci. 6 (11), 1838-1848 (2015).
- Medvedeva, Y. V., Ji, S., Yin, H. Z., Weiss, J. H. Differential vulnerability of CA1 vs CA3 pyramidal neurons after ischemia: possible relationship to sources of Zn2+ accumulation and its entry into and prolonged effects on mitochondria. J Neurosci. , (2016).
- Pignataro, G., et al. In vivo and in vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke: ischemic postconditioning. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (2), 232-241 (2008).
- Zhang, X., Ding, H. Z., Jiang, S., Zeng, Y. M., Tang, Q. F. An in vitro study of the neuroprotective effect of propofol on hypoxic hippocampal slice. Brain Inj. 28 (13-14), 1758-1765 (2014).
- Niu, Y., et al. Chemical profiling with HPLC-FTMS of exogenous and endogenous chemicals susceptible to the administration of chotosan in an animal model of type 2 diabetes-induced dementia. J Pharm Biomed Anal. 104, 21-30 (2015).
