Modelli sperimentali per studiare la neuroprotezione del post-condizionamento acido contro l'ischemia cerebrale

La postcondizionazione acida protegge contro l'ischemia cerebrale. Qui presentiamo due modelli per eseguire APC. Esse vengono ottenute rispettivamente trasferendo fette corticostriatali in tampone acico dopo la privazione di ossigeno-glucosio in vitro e inalando 20% di CO ₂ dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media in vivo .

L'obiettivo generale del trattamento dell'acidosi in un modello di fetta striatale corticale in un modello di occlusione dell'arteria cerebrale media è studiare l'effetto neuroprotettivo del postcondizionamento acido contro l'ischemia cerebrale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come il postcondizionamento dell'acidosi può proteggere il danno cerebrale ischemico e a sviluppare una nuova strategia per la terapia dell'ictus. Il vantaggio principale di questa tecnica è la possibilità di utilizzare modelli sperimentali ampiamente disponibili per studiare la neuroprotezione del postcondizionamento dell'acidosi.

A dimostrare la procedura sarà Yarong Zheng, uno studente laureato del mio laboratorio. Inizia rimuovendo il cervello dal cranio di un topo decapitato con una spatola sottile e lasciandolo cadere con cura in un becher contenente ACSF regolare ghiacciato bilanciato con il cinque percento di anidride carbonica e il 95 percento di ossigeno. Applicare la colla crioprecipitata sulla piastra vibratone in due strisce.

Metti un pezzo di agarosio al tre percento sulla striscia di colla più lontana dalla lama per sostenere il cervello. Quindi usa una pinza per trasferire il cervello su carta da filtro. Taglia il palo frontale e il cervelletto con una lama.

Posizionare il tessuto cerebrale verticalmente sulla striscia libera di colla con il cervello appoggiato all'agarosio. Aggiungere ACSF ghiacciato al serbatoio di taglio per immergere il cervello e aggiungere ghiaccio all'area del portaghiaccio. Mantieni l'ACSF nel serbatoio gorgogliato con il cinque percento di anidride carbonica e il 95% di ossigeno.

Dopo aver impostato il vibratone per tagliare sezioni da 400 micron e aver posizionato correttamente il cervello rispetto alla lama di taglio, premere il pulsante start-stop per avviare il taglio automatico. Usa una pipetta Pasteur con una punta tagliata per trasferire cinque fette di cervello una per una e mettile nel supporto del fazzoletto in ACSF normale ghiacciato con il cinque percento di anidride carbonica e il 95% di ossigeno. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, mettere le fette di cervello in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per dieci minuti per recuperare la funzione sinaptica.

Mettere l'ACSF senza glucosio e l'ACSF acido nel bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e far bollire le soluzioni rispettivamente con il cinque percento di anidride carbonica e il 95% di azoto e il 20 percento di anidride carbonica e l'80% di ossigeno per 30 minuti. Trasferire con cura quattro delle cinque fette di cervello in un ACSF preriscaldato a 37 gradi Celsius, privo di glucosio, e incubare per 15 minuti. Per studiare la finestra temporale per il precondizionamento acido, trasferire una fetta direttamente da ACSF senza glucosio a ACSF acido e trasferire le altre tre fette a ACSF normale per la riperfusione.

Dopo tre minuti trasferire la fetta in ACSF acido a ACSF normale. Quindi, dopo cinque minuti in ACSF regolare, trasferire una delle fette dall'ACSF normale al supporto del tessuto in ACSF acido per tre minuti. Trasferire un'altra fetta nello stesso modo 15 minuti dopo la riperfusione.

La fetta rimanente che è stata inserita in ACSF libera da glucosio ma non acida viene impostata come gruppo di privazione di glucosio di ossigeno. Trasferire le fette dall'ACSF nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente una soluzione TTC. Allungare la fetta nella soluzione.

E poi incubare a 37 gradi Celsius in un bagno di acqua poco profonda per 30 minuti. Quindi trasferisci le fette in provette da centrifuga pulite, pesate e ricoperte di carta stagnola e misura il peso secco delle fette. Dopo la pesatura, estrarre Formazan aggiungendo una soluzione uno a uno di etanolo e dimetilsolfossido alle provette con un rapporto volume/peso di 10 a uno.

Incubare al riparo dalla luce per 24 ore. Il giorno successivo trasferire la soluzione di etanolo dimetilsolfossido dalle provette a una piastra a 96 pozzetti e misurare l'assorbanza a 490 nanometri utilizzando un lettore di piastre. Innanzitutto, confermare la corretta anestesia in assenza di un riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.

Quindi posizionare il topo anestetizzato con la sonda LDF attaccata al cranio in posizione supina e fissarlo utilizzando fili di cotone sterili. Disinfettare la pelle rasata del collo con alcool etilico al 75%. Quindi, dopo aver praticato un'incisione cutanea peri mediana nel collo, sezionare i tessuti molli con una pinza per esporre i vasi sanguigni.

Aggiungi una goccia di soluzione salina ai tessuti esposti per mantenerli idratati. Successivamente, usa una pinza oftalmica per sezionare l'arteria carotide comune dal tessuto circostante e dal nervo vago. Fare attenzione a non danneggiare il nervo vago.

Posizionare un morsetto per microvasi all'estremità distale dell'arteria carotide comune. E fai un nodo morto con suture di seta 6-0 all'estremità prossimale. Quindi legare un nodo sciolto prossimalmente al morsetto come sutura temporanea.

Successivamente, usa le micro forbici oftalmiche per praticare una piccola incisione longitudinale tra i due nodi il più vicino possibile al nodo morto. Ora inserisci un monofilamento smussato con punta da 12 millimetri attraverso l'incisione nel lume dell'arteria e fallo avanzare di alcuni millimetri. Stringere il nodo sciolto attorno alla punta del monofilamento e poi rimuovere il morsetto.

Quindi utilizzare una pinza oftalmica per far avanzare il filamento nell'arteria carotide interna fino a quando il software LDF non mostra un forte calo del flusso sanguigno. Registrare l'ora di inizio dell'occlusione. Quindi tagliare la sonda LDF e mettere il topo in un'incubatrice a 30 gradi Celsius per la durata di un'ora dell'occlusione.

55 minuti dopo l'inizio dell'occlusione, anestetizzare l'animale con isoflurano e posizionare l'animale come prima. Quindi aprire l'incisione del collo e riesporre l'arteria carotide comune. Dopo il periodo di occlusione, utilizzare una pinza oftalmica per estrarre delicatamente il filamento per ottenere la riperfusione.

Quindi trasforma la sutura temporanea in una permanente stringendo il nodo. Per il trattamento dell'acidosi, cambiare il gas inalato dal cono anteriore al 20% di anidride carbonica, al 20% di ossigeno e al 60% di azoto per cinque minuti. Dopo aver chiuso l'incisione con una sutura chirurgica interrotta, posizionare il topo in una gabbia riscaldata a 30 gradi Celsius fino a quando il topo non riprende conoscenza.

Questo istogramma mostra i risultati del test TTC eseguito su fette corticali dopo privazione di ossigeno e postcondizionamento acido, come dimostrato in questo video. Tre minuti di trattamento con acidosi erano neuroprotettivi se il trattamento veniva iniziato immediatamente o cinque minuti dopo la privazione di ossigeno e glucosio, ma non se le fette venivano riperfuse per 15 minuti. I topi sono stati sottoposti a 60 minuti di occlusione dell'arteria cerebrale media e trattati inalando il 20% di anidride carbonica per cinque minuti a cinque, 50 o 100 minuti dopo la riperfusione.

Il volume dell'infarto è stato quantificato mediante colorazione con due, tre, cinque trifeniltetrazolio cloridrato 24 ore dopo la riperfusione, come indicato dalle linee tratteggiate nere. Questo istogramma mostra la percentuale di volume dell'infarto per ciascuna condizione. La neuroprotezione dal postcondizionamento acido è risultata robusta anche quando il tempo di insorgenza è stato ritardato a 50 minuti dopo la riperfusione.

Tuttavia, il trattamento dell'acidosi iniziato a 100 minuti non ha bloccato la lesione ischemica. Dopo aver visto il video dovresti avere una buona comprensione di come studiare la neuroprotezione del postcondizionamento dell'acidosi sul modello OGD di fette di cervello e sul modello MSO di topi. Durante l'esecuzione delle procedure è importante ricordare che l'estensione e la durata dell'acidosi è molto importante per riprodurre gli effetti protettivi.