Summary
Nous présentons ici un protocole raffiné pour révéler efficacement amine de dextran biotinylé (BDA) marquage avec une fluorescence coloration méthode via une voie neurale réciproque. Il est adapté pour l’analyse de la structure fine des BDA étiquetage et qui le différencient des autres éléments neurones sous un confocal laser scanning microscope.
Abstract
Amine de haut poids moléculaire biotinylé dextran (BDA) a été utilisé comme traceur neuroanatomique très sensible pendant de nombreuses décennies. Étant donné que la qualité de son étiquetage a été affectée par divers facteurs, ici, nous fournissons un protocole raffiné pour l’application de poids moléculaire élevé BDA pour l’étude de marquage neuronal optimal dans le système nerveux central. Après injection stéréotaxique du BDA dans le noyau de la périostite ventrale (VPM) du thalamus chez le rat par une pipette de verre délicat, BDA a été souillé avec fluorescent streptavidine-Alexa (AF) 594 et Eosine avec coloration de Nissl fluorescente AF500/525. Sur le fond de coloration de Nissl vert, le rouge BDA étiquetage, y compris des corps cellulaires neurones et terminaux d’axonal, a été démontrée plus distinctement dans le cortex somatosensoriel. En outre, double coloration fluorescente pour BDA et la parvalbumine de protéine liant le calcium (PV) a été réalisée pour observer la corrélation du BDA étiquetage et interneurones PV positif dans la cible corticale, fournissant l’occasion d’étudier le local neural circuits et leurs caractéristiques chimiques. Ainsi, cette méthode raffinée est non seulement appropriée pour la visualisation de neurones marquage avec la masse moléculaire élevée BDA à travers les voies nerveuses réciproques entre le thalamus et le cortex cérébral de haute qualité, mais permettra également à la manifestation simultanée de autres marqueurs neurones avec histochimie fluorescent ou immunochimie.
Introduction
Poids moléculaire élevé BDA (poids moléculaire de 10 000), un traceur très sensible, a été utilisé pour tracer des voies nerveuses dans le système nerveux central pour plus de 20 ans1. Bien que l’utilisation de la BDA est une commune étendue neurale suivi technique, la qualité de l’étiquetage de la BDA peut être affectée chez les animaux par divers facteurs1,2,3. Notre étude récente révèle que la structure optimale de l’étiquetage de la BDA est non seulement associée à un moment approprié de survie après l’injection, mais aussi en corrélation avec la coloration méthode4. Jusqu'à présent, classique complexe avidine-biotine-peroxydase (ABC), streptavidine-fluorescéine isothiocyanate et streptavidine-AF594 méthodes de coloration ont été utilisées pour révéler l’étiquetage BDA dans précédentes études2,3, 4,5. En comparaison, une coloration fluorescente pour BDA peut être facilement effectuée.
Afin d’étendre l’application de poids moléculaire élevé BDA, un protocole raffiné a été introduit dans la présente étude. Suite à l’injection de BDA dans le VPM du thalamus dans le cerveau de rat, BDA d’étiquetage a été révélée par la méthode habituelle de souillure d’ABC standard ainsi que par la double coloration fluorescente, qui a été réalisée pour l’observation de la corrélation de l’étiquetage de la BDA et base les éléments neurones ou interneurones dans la corticale cible avec la Streptavidine-AF594 et fluorescent Nissl histochimie ou PV-immunochimie, respectivement. Par le biais de voies neurales réciproques entre le VPM et le cortex somatosensoriel primaire (S1)6,7,8, nous avons concentré notre observation sur BDA étiquetage dans les axones thalamocortical projeté et corticothalamiques somas cellule projetée dans le S1. Par ce processus, nous nous attendions à fournir non seulement un protocole détaillé pour l’obtention de la qualité de marquage neuronal à haut poids moléculaire BDA, mais aussi un protocole raffiné sur la combinaison de marquage fluorescent de BDA et d’autres marqueurs neurones fluorescents avec histochimie ou immunochimie. Cette approche est préférable d’étudier les circuits neurones locaux et leurs caractéristiques chimiques sous un laser confocal, microscopie à balayage.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique à l’Académie chinoise des chinois Medical Sciences (numéro de référence 20160014). Toutes les procédures ont été menées conformément au instituts nationaux de santé Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Quatre rats mâles adultes (poids 250-280 g) ont été utilisées dans cette étude. Tous les animaux étaient logés dans un cycle lumière/obscurité de 12 h avec une température contrôlée et l’humidité et autorisés le libre accès à la nourriture et l’eau. Les instruments et les matériaux utilisés dans la présente étude ont été montrés à la Figure 1. Avant la chirurgie, tous les instruments, tels que le cadre stéréotaxique et pipette en verre, ont été nettoyés à l’aide d’éthanol à 70 %.
1. interventions chirurgicales
- Déterminer la zone de coordination d’intérêt dans VPM à l’aide d’un atlas stéréotaxiques9 (Figure 2 a).
- Préparer une 1 µL micro-seringue équipée d’une micropipette de verre (avec un diamètre d’environ 10 à 20 µm) (Figure 1) et de le tester avec de la paraffine liquide.
- Anesthésier les rats avec 7 % d’hydrate de chloral (0,7 mL/100 g) par injection intrapéritonéale.
- Une fois confirmée une anesthésie profonde avec queue pincez pédale réflexe de retrait, raser le dessus de la tête de l’animal avec un rasoir électrique et frotter le site chirurgical 3 fois avec 10 % polyvidone iodée, suivie de l’éthanol à 70 % respectivement.
- Placez le rat dans l’appareil stéréotaxique en plaçant des barres d’oreilles émoussé dans les oreilles et placez des incisives supérieures de rat dans le support de la bouche (Figure 1E) puis appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux.
- Nettoyer la peau en tête du site chirurgical à l’aide de l’éthanol à 70 %. Utiliser des gants chirurgicaux stériles et serviettes pour maintenir la chirurgie dans des conditions stériles.
- Faire une incision sagittale dans la peau avec un scalpel le long de la suture sagittale (Figure 1F).
- Grattez les muscles et le périoste loin du crâne à l’aide de cotons-tiges stériles tout au long de la chirurgie pour contrôler le saignement (Figure 1F).
- À l’aide de coordonnées prédéfinies d’un atlas (Figure 2 a), déterminer l’emplacement (point de Bregma mm-3,30, droit de 2,6 mm de la ligne médiane) de craniotomie (Figure 1).
- Effectuer une craniotomie avec un foret de bavures avec un peu de pointe ronde (#106) (Figure 1 H) et continuer le forage à sur une profondeur de 1 mm en quelques minutes jusqu'à atteindre les méninges (Figure 1I).
- L’accise la dure-mère utilisant des Micropinces pour exposer le cortex cérébral sur le site d’injection (Figure 1I).
- Changer de paraffine liquide dans la seringue à injection avec solution 10 % BDA (10 000 poids moléculaire, dans l’eau distillée) (Figure 1J).
- Monter la seringue dans l’appareil de la microinjection et se connecter avec une micro pompe (Figure 1 K).
Remarque : Le volume injecté est dépendant de la vitesse de la micro pompe. Ici, il était réglé à 30 nL/min (Figure 1 L). - Sous un stéréomicroscope, insérez une micropipette verre manuellement avec l’appareil de microinjection dans le VPM à travers la surface corticale du cerveau à la profondeur de 5,8 mm (Figure 1 M).
- Pression-injecter un 100 nL 10 % BDA dans le VPM sur une période de 3 min (35 nL/min) avec une micro pompe (Figure 1 L, M).
- Après l’injection, tenir la pipette en place pour une supplémentaire de 5 min et retirer ensuite lentement.
- Suture de la plaie avec fil stérile (Figure 1N). Suivre vos directives du Comité local de soins aux animaux pour l’analgésie pré- et post-opératoire.
- Placez le rat dans une zone de restauration chaude jusqu'à ce qu’il reprend conscience et est complètement rétabli.
- Remettez le rat récupéré sa cage.
2. les perfusions et Sections
- Après un temps de survie de 10 jours en général, injecter l’animal avec un surdosage de 10 % uréthane (2 mL/100 g) par injection intrapéritonéale d’induire l’euthanasie.
- Perfuse les rats expérimentaux dans la hotte (Figure 1O).
- Une fois que la respiration s’arrête, à l’aide de ciseaux et pinces, ouvrir la cavité thoracique du rat pour accéder au cœur. Insérer un cathéter intraveineux dans le ventricule gauche vers l’aorte et ouvrez l’oreillette droite.
- Tout d’abord perfuse avec 0,9 % saline tamponnée au phosphate (PBS) à température physiologique (37 ° C) environ 1-2 min jusqu'à ce que le sang sortant du cœur est clair et puis continuer avec 250-300 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon phosphate 0,1 M (PB, pH 7,4).
- Après la perfusion, inciser la peau de la tête et ouvrir le crâne et ensuite disséquer sur le cerveau du rat. Fixer le cerveau disséqué en paraformaldéhyde à 4 % pendant 2 h à température ambiante (26 ° C), puis cryoprotect à 30 % de saccharose à 0,1 M PBS (pH 7,4) pendant 3 jours à 4 ° C jusqu'à ce que le cerveau est immergé dans la solution (Figure 1 P).
- Une fois que le cerveau est immergé dans la solution, diviser le cerveau en trois blocs en direction coronaire sur les matrices de cerveau (Figure 1 q). Le bloc central contient le VPM et S1.
- Couper le bloc central du cerveau à 40 µm sur une étape de congélation coulissant système microtome en direction coronaire. Recueillir ces sections ordonnées dans un plat de 6 puits avec PBS à 0,1 M (pH 7,4) (Figures 1R, S).
3. norme ABC coloration
NOTE : Sections flottantes libres de chaque troisième section coronale du cerveau ont été utilisées pour la visualisation de la BDA marquage à la norme ABC procédure10.
- Rincer les sections dans du PBS de 0,1 M pendant environ 1 min.
- Incuber les sections en solution à 1 % ABC en PB de 0,1 M (pH 7,4) contenant 0,3 % Triton X-100 pendant 1 h à température ambiante.
- Laver les sections trois fois dans un tampon Tris 50 mM (pH 7,4).
- Tacher les sections dans une solution contenant 0,02 % 3, tétrahydrochlorure 3'-diaminobenzidine (DAB) et 0,01 % H2O2 dans un tampon Tris 50 mM pour environ 2 à 5 min à température ambiante.
- Laver les sections trois fois dans un tampon Tris 50 mM (pH 7,4).
- Monter les sections sur les lames de microscope à l’aide des techniques histochimiques standards (Figure 1 t; voir III de fichier vidéo supplémentaire, perfusion et sections).
- Sécher les sections dans l’air du jour au lendemain à la température ambiante.
- Déshydrater les sections brièvement dans une série de solutions d’alcool (50 %, 70 %, 95 %, 100 %). Submerger les diapositives de chaque solution pour environ 15 s. Ne laissez pas les diapositives à sécher entre chaque étape.
- Désactivez les sections dans le xylène trois fois, environ 20 min.
- Mettre 2 ou 3 gouttes de baume sur les tranches puis posez les lamelles sur les sections.
4. double coloration fluorescente pour BDA et les éléments fondamentaux de neurones dans le Cortex cérébral
Remarque : en revanche, une coloration fluorescente double a été réalisée pour l’observation de la corrélation de l’étiquetage de la BDA et éléments neurones de base sur les sections adjacentes à ce qui précède utilisant avec la Streptavidine-AF594 et Eosine avec coloration de Nissl fluorescente AF500/525.
- Rincer les sections dans du PBS de 0,1 M pendant environ 1 min.
- Incuber les sections dans une mélange de la solution de streptavidine-AF594 (1/500) et AF500/525 vert fluorescent Nissl teinture (1:1, 000) dans du PBS de 0,1 M (pH 7,4) contenant 0,3 % Triton X-100 pendant 2 h à température ambiante.
- Laver les sections trois fois en PB de 0,1 M (pH 7,4).
- Monter les sections sur les lames de microscope à l’aide des techniques histochimiques standards. Sécher les sections dans l’air pendant environ 1 h.
- S’applique à lamelles couvre-objet pour les sections fluorescentes avec 50 % de glycérine dans l’eau distillée avant l’observation.
5. double coloration fluorescente pour BDA et interneurones dans le Cortex cérébral
Remarque : Une coloration fluorescente Double a été réalisée pour l’observation de la corrélation de l’étiquetage de la BDA et d’interneurones sur les sections représentatives dans la corticale cible avec la Streptavidine-AF594 et PV-immunochimie.
- Rincer les sections représentatives dans du PBS de 0,1 M (pH 7,4) pendant environ 1 min.
- Incuber les sections dans une solution de blocage contenant 3 % de sérum de chèvre normal et 0,3 % Triton X-100 dans du PBS de 0,1 M pendant 30 min.
- Transférer les sections dans une solution de souris monoclonal anti-PV IgG (1:1, 000) dans le sérum de chèvre normal 1 % contenant 0,1 M PBS (pH 7,4) et 0,3 % Triton X-100 pour la nuit à 4 ° C.
- Le lendemain, laver les sections trois fois dans du PBS de 0,1 M (pH 7,4).
- Exposer les sections d’un mélange de solution d’anticorps secondaire de chèvre anti-mouse-AF488 (1/500), streptavidine-AF594 (1/500) et 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI, 01:40, 000) dans le sérum de chèvre normal 0,1 M PBS (pH 7,4) contenant 1 % et 0,3 % Triton X-100 pendant 1 h.
- Répétez les étapes de 4,3 à 4,5.
6. observation
- Prendre des photos du VPM, thalamocortical les axones et les neurones corticothalamiques.
- Observer les échantillons fluorescents avec un système d’imagerie confocal équipé de lentilles objectifs (4 x, NA : 0,13 ; 10 x, NA : 0,40 ; et 40 x, NA : 0,95). Utiliser des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 405 488 (bleu), (vert) et 559 nm (rouge).
NOTE : Ici, le trou d’épingle confocal est 152 µm (4 x, 10 x) et 105 µm (40 x). La résolution spatiale de capture d’image est 1024 × 1024 pixels (4 x, 10 x) et 640 × 640 pixels (40 x). - Prendre vingt images en images successives de 2 µm de chaque section à l’épaisseur de 40 µm (série Z).
- Intégrer les images dans une seule image de mise au point avec l’image confocale traitement logiciel pour l’analyse en trois dimensions comme suit : définition du premier plan focal → fin jeu plan focal → étape set taille → choisir profondeur modèle → image capture → Z series.
- Observer les échantillons fluorescents avec un système d’imagerie confocal équipé de lentilles objectifs (4 x, NA : 0,13 ; 10 x, NA : 0,40 ; et 40 x, NA : 0,95). Utiliser des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 405 488 (bleu), (vert) et 559 nm (rouge).
- Prendre des images de fond clair par un microscope optique équipé d’un appareil photo numérique (4 x, NA : 0,13 ; 10 x, NA : 0,40 ; et 40 x, NA : 0,95 lentilles). Utilisez un temps de pose de logiciel de retouche de photo utilisation de 500 m pour ajuster la luminosité et le contraste des images et ajouter des étiquettes.
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Representative Results
Survie des 10 jours post injection de BDA dans le VPM est suffisante pour la production intense neural étiquettes apposées sur les aires corticales correspondantes ipsilatérale à la face d’injection (Figure 2). Classiques ABC et fluorescentes procédures de coloration pour BDA a révélé le modèle similaire de marquage neuronal sur le S1, y compris axonales intitulée thalamocortical axones et marqués intitulée corticothalamiques neurones (Figure 2, D ).
Pour l’axonales marquées des axones, ils ont été observés de couche 2 à couche 6 avec une densité plus élevée sur la couche 4, et le type typique des axones thalamocortical a été observé dans la région de baril (Figure 2, D). De l’avis de grossissement plus élevé, BDA étiquetage présentées clairement sur le tronc axonale, branches, collatéraux et petites varicosités (Figure 3 a). Sous les axones thalamocortical étiquetées à afficher, les neurones pyramidaux corticales marqués marqués ont été affichés et leurs corps cellulaires réparties sur les couches 5/6, mais leurs dendrites apicales étendue à la couche 2 (Figure 2, D). L’étiquetage de la BDA présenté non seulement dans le corps des cellules neuronales et les dendrites, mais aussi dans les épines dendritiques, apparaissant comme résolution de Golgi-like (Figure 3 b).
En outre, une coloration fluorescente double a également été effectuée pour l’observation de la corrélation de l’étiquetage de la BDA et d’interneurones dans la corticale cible avec la Streptavidine-AF594 et PV-immunochimie. Autour de la BDA étiquetage dans la cible corticale, neurones PV-positives ont été distribuées de couche 2 à couche 6 avec une concentration élevée en couche 4 (Figure 4 a). Il n’y a aucun neurones PV positifs doivent être étiquetées avec BDA, cependant, marqués au BDA axonale terminaux ont été retrouvés autour de la surface du corps des cellules PV positif et terminaux axonale PV positif autour de BDA-étiqueté corticales neurones pyramidaux (Figure 4 b, C ).
La figure 1. Photos des principales étapes chirurgicales et des principaux instruments pour être utilisé dans cette expérience.
A: l’appareil stéréotaxique. B: la fraise dentaire. C: instruments chirurgicaux (bistouri, micropinces et etc.) D: seringue à injection équipé d’une micropipette de verre. E: Placez la tête de rat dans l’appareil stéréotaxique. F: nettoyer le champ opératoire. G: confirmer le point de Bregma. H: percer le crâne. J’ai: exposer le cortex cérébral. J: 10 % de charge BDA dans la seringue à injection. K: monter la seringue dans l’appareil pour la micro-injection. L: ajuster la vitesse de la micro pompe. M: Insérez la micropipette de verre dans le VPM. N: Suture de la plaie avec fil stérile. O: Perfuse le rat dans la hotte. P: disséquer sur le cerveau. Q: diviser le cerveau en trois blocs avec les matrices de cerveau. R: couper le cerveau sur une étape de congélation coulissant système microtome. S: recueillir des sections de cerveau ordonnées dans un plat de 6 puits. T: monter les sections sur lames de microscope. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 2. Site d’injection et marquage neuronal typique à haut poids moléculaire BDA dans le cortex somatosensoriel.
A: site d’Injection a été déterminée sur un atlas stéréotaxique. B: photomicrographie représentative montrant le site de l’injection du BDA (rouge) dans le noyau ventral périostite du thalamus (VPM) sur le fond de coloration de Nissl vert. C: Photomicrographie de BDA marquage fluorescent, y compris les axones thalamocortical dans couche 4 et corticothalamiques neurones en couches 5/6. D: Photomicrographie de classiques BDA marquage avec une procédure normalisée d’avidine-biotine-peroxydase montrant le modèle similaire de marquage neuronal à marquage fluorescent de BDA. VPL, noyau ventral postéro-latérales du thalamus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 3. Qualité de marquage neuronal à haut poids moléculaire BDA sur le fond de coloration de Nissl vert.
A: supérieure vue de grossissement de l’axonales étiqueté tonnelles axonales (rouge) en détail. B: les photographies haute résolution montrant le corps de cellule neuronale marqués étiquetées, dendrites et épines dendritiques (rouge) en détail. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 4. La corrélation de BDA étiquetage et des interneurones de la protéine liant le calcium PV positif dans la cible corticale.
A: la distribution de BDA étiquetage (rouge) et les interneurones PV positif (vert) dans le cortex somatosensoriel. B: vue de grossissement plus élevé de la distribution des axones BDA-étiquetés et interneurones PV positif en couche 4. C: photo haute résolution marqué BDA pyramidale des cellules corticales (rouge) et interneurones PV positif (verts) en couches 5/6. Tous les échantillons ont été Eosine au DAPI (bleu). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Les fichiers vidéo supplémentaires : Les vidéos supplémentaires apparaissent brièvement l’intervention chirurgicale, l’injection de BDA dans VPM, perfusion et sectionnant les résultats. Dans le fichier vidéo nommé « IV. Résultat représentant », le laser confocal tridimensionnel balayage de microscopie et analyse système résultats s’affichent. Animation de haute résolution montre le corps marqués étiquetées de cellulaire neuronale, dendrites et épines dendritiques (rouge) en détail. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Sélection d’un bon traceur est une étape essentielle pour une expérience réussie de traçage neuronal. Dans la famille de BDA, poids moléculaire élevé BDA (poids moléculaire de 10 000) a été recommandé à transporter préférentiellement par le biais de la voie neuronale antérograde contrairement à faible poids moléculaire BDA (3 000 poids moléculaire)2,3 , 11 , 12 , 13. Cependant, beaucoup d’études a également suggéré que haut poids moléculaire BDA pourrait également être potentiellement utilisé pour le traçage de la voie rétrograde en parallèle avec antérograde traçage1,2,3. Par le biais de voies neurales réciproques entre VPM et S1, nous avons fourni une preuve supplémentaire pour soutenir l’idée que des poids moléculaires élevés BDA est adapté aux bidirectionnel de traçage des voies4. De façon similaire dans ce domaine, haut poids moléculaire BDA a été également utilisé dans le système visuel et auditif pour examiner les liens réciproques entre le corps géniculé latéral dorsal et cortex visuel ainsi que le corps géniculé médial et le cortex auditif 3 , 14.
Dans l’expérience de traçage neuronal, l’autre facteur important est le choix de la méthode d’étiquetage neural de coloration. Dans la plupart des études précédentes, le classique protocole ABC et fluorescente streptavidine méthode de coloration ont été utilisés pour l’examen de l’étiquetage BDA et a révélé le même modèle morphologique1,2,3 , 4 , 5. ici, nous avons constaté que la Streptavidine-AF594 n’était pas seulement un bon choix pour l’étiquetage de BDA, mais convient également pour combiner avec les autres marqueurs neuronaux, comme fluorescent Nissl et PV-antigène, fournissant une nouvelle opportunité pour observer la corrélation du BDA étiquetage et autres éléments neuraux. Bien que la méthode de la double coloration classique pour BDA et d’autres marqueurs neurones étaient également fréquemment réalisées avec les deux couleurs DAB procédure14,15, il n’est pas adapté pour l’utilisation d’un système d’analyse en trois dimensions sous une microscopie à balayage confocal laser. D’un point de vue technique, notre étude fournit une référence précieuse distinctement comparer entre BDA étiquetage et autres étiquetage.
La technique de traçage du tube neural a été initialement utilisée pour révéler des connexions neuronales entre le site d’injection et sa cible dans le système nerveux ; Toutefois, les chercheurs ont toujours dans la poursuite de la structure idéale de marquage neuronal avec un bon traceur16,17. Contrairement à d’autres traceurs, telles que la peroxydase de raifort et de la sous-unité B de la toxine cholérique, poids moléculaire élevé BDA a produit la meilleure qualité de marquage neuronal pour quantifier le nombre de tonnelles axones et dendrites neuronale16,17 . Même si l’analyse quantitative de l’étiquetage de la BDA a été effectué pas dans la présente étude, la qualité supérieure de marquage neuronal avec BDA fournit davantage d’occasions de comprendre étroitement les caractéristiques morphologiques sur tonnelles axonales étiquetées et neuronale dendrites.
Similaire à l’application des nombreuses autres traceurs, une série de questions importantes devrait être envisagée pour cette procédure expérimentale, y compris : la concentration et le volume du BDA pour injection, bon site d’injection, le diamètre de l’embout de la pipette en verre, procédé chirurgical, durée de survie optimale, perfusion, section et observation au microscope. Il est directement associé à la qualité du marquage ce que nous attendions de BDA. Outre les étapes critiques mentionnées ci-dessus, il y a des limitations techniques qui requièrent l’attention, tels que la distance entre le site injecté et étiquetés de la cible, qui dépend de l’espèce animale de modèle utilisé dans l’expérience3, 5 , 18. en un mot, une étude de suivi réussie dépend de chaque étape dans l’ensemble de la procédure expérimentale.
Dans la présente étude, nous avons fourni un protocole raffiné pour démontrer que la BDA fluorescent méthode de coloration est un moyen efficace pour l’obtention de la qualité de marquage neuronal, qui peut être combiné simultanément avec les autres marqueurs neurones à l’aide de histochimie fluorescent ou immunochimie. Comparer la coloration de BDA conventionnelle avec la procédure DAB, nous pouvons plus facilement analyser la structure fine de l’étiquetage de la BDA et de les distinguer des autres éléments neuraux dans la cible de traçage sous un laser confocale microscopie par la fluorescence présente approche.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (projet Code n° 81373557, n° 81403327).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
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