Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים

Published: July 6, 2018 doi: 10.3791/56110
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מציגים מיקרו droplet למיעון-מערכים (עיוותים), שיטה מערך מבוסס droplet מסוגל לקבוע חלבון מוחלטת שפע תאים בודדים. נדגים את היכולת של ארכיון דיגיטלי כדי לאפיין את הטרוגניות בביטוי של p53 חלבון משתיק קול גידול בקו תאים סרטניים אנושיים.

Abstract

לעיתים קרובות הסלולר התנהגות ותגובות הסלולר מנותחים ברמת האוכלוסייה שם התגובות של תאים רבים הם איחדו יחד בתור תוצאה הממוצע מטשטשים את אופן הפעולה של תא בודד עשיר בתוך אוכלוסיה מורכבת. טכנולוגיות זיהוי, כימות של חלבון תא בודד הפכו את השפעה מדהימה בשנים האחרונות. כאן נתאר פלטפורמה ניתוח תא בודד פרקטי ומודולרי המבוסס על מיקרו-מערכים למיעון droplet. מחקר זה מתאר כיצד ניתן למדוד את המספרים העתקה מוחלטת של חלבונים היעד ברזולוציה של תא בודד. P53 משתיק קול גידול הוא גן שעבר מוטציה הנפוצות ב סרטן אנושי, עם יותר מ- 50% של מקרי סרטן הכולל מפגין דפוס ביטוי p53 שאינם בריאים. הפרוטוקול מתאר את השלבים ליצירת 10 טיפות nL שבתוכו תאים סרטניים אנושיים יחיד מבודדים, המספר עותק של החלבון p53 נמדדת ברזולוציה של מולקולה בודדת כדי לקבוע במדויק ההשתנות בביטוי. ניתן להחיל את השיטה לכל סוג התא כולל חומר ראשוני כדי לקבוע את המספר המוחלט עותק של חלבונים היעד בכל עניין.

Introduction

המטרה של שיטה זו היא לקבוע את הווריאציה בשפע של חלבון המטרה באוכלוסיה תא ברזולוציה של תא בודד. ניתוח תא בודד מספק מספר יתרונות שאינם זמינים עם שיטות ביוכימיות הרכב המסורתי. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . ראשית, עבודה ברמה תא בודד יכול ללכוד את הטרוגניות עשיר של אוכלוסיית תאים אחרת אהיה אבודה על ידי חישוב ממוצע המתרחשת עם טכניקות הביוכימי הרכב המסורתי. רוב שיטות ביוכימיות סוס עבודה לעבוד עם הנפח, המחייב, כמו שעושים בדרך כלל, מיליוני תאים כדי לקבל תוצאה. כמובן, ההשלכות של הערכת אוכלוסיות התא כולו תלוי במספר גורמים, לדוגמה, את הטרוגניות בביטוי חלבונים בו כמה תכונות חשובות של ההתפלגות של חלבון שפע עשויים לפספס. מנקודת מבט מעשית, הרגישות הדרושה של תא בודד טכניקות להפוך אותם מסוגלים לעבוד עם כמויות של חומר ביולוגי אינו מספיק אפילו טכניקות בכמות גדולה יותר רגיש לתפקד. דוגמה מפתח היא המחקר של סוגי תאים נדירים כגון מחזורי תאים סרטניים (CTCs) שבו גם עבור חולים עם השקפה prognostic מסכן פחות מ 10 CTCs עשוי להיות נוכח דם בודדת 7.5 mL לצייר. 6 . נציג המתודולוגיה הדרושים לביצוע מדידות חלבון תא בודד באמצעות אמצעי אחסון מופחת נוגדן מבוססי assay העסקת טיפות שמן הכתיר מודפס על microarray נוגדן.

Microfluidic droplet פלטפורמות הם תפוקה גבוהה, מסוגל לייצר אלפי טיפות לכל השנייה, יכולת אנליטית, אפילו culturing, תאים בודדים טיפות בודדות כדי לבצע מגוון רחב של מבחני הביוכימי. טכניקות מבוססות droplet מתאימים היטב לניתוח תא בודד,7,8,,9 , עם דוגמאות הבולטים האחרונים כולל DropSeq10 ו- inDrop11, אשר יש בגילויים באופן משמעותי בכוח טכניקות הגברה. את כמות מוגבלת של חומר ושיטות אין של הגברה חלבונים להפוך לתא בודד פרוטאומיקס מאתגר במיוחד.

טיפות עשוי להיות מנותח על ידי מספר שיטות, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות כבר בשימוש נרחב. מולקולה בודדת טכניקות כגון מיקרוסקופ גמורה קרינה פלואורסצנטית (TIRF) מאפשר מולקולות פלורסנט, ניתן לאבחן עם יחס אות לרעש ללא תחרות. 12 עקב דעיכה מעריכית השדה evanescent, רק fluorophores בסמיכות גבוהה על פני השטח (סדר 100nm) נרגשים ביצוע TIRF אסטרטגיה טובה מזהה כמויות קטנות של מולקולה היעד תערובת מורכבת. החוזק הפנימי אופטים אופטי של TIRF גם מסייעת להימנע שטיפת מדרגות, וזמינותו מגבלות הזמן והמורכבות. עם זאת, TIRF דורש משטחים מישוריים, דוגמאות של מיקרוסקופ TIRF חלה על טיפות בזרימת לערב היווצרות של משטח מישורי אשר לתמונה. 13 למטרה זו, תא בודד פרוטיאומיה מבנית טכניקות לעיתים קרובות עיצוב microfluidic צ'יפס סביב סוכני השטח. מרותק למיטה לכידה בפורמט microarray. 4 , 14

טיפות, עצמם, עשוי להיווצר מערכים על משטחים מישוריים, מיקרו-מערכים droplet כביכול. 15 , 16 , 17 במרחב ארגון טיפות לתוך מערכי מאפשר להם להיות נוח ליצור אינדקס, בקלות במעקב לאורך זמן, באופן אינדיבידואלי התייחס ולאחזר, במידת הצורך. מיקרו-מערכים droplet ניתן להשיג צפיפות גבוהה של מיקרו-כורים עם אלפי רכיבים לכל שבב שעמד חופשי או נתמך על-ידי microwell מבנים. 18 , 19 , 20 . הם עשויים להיווצר על ידי התצהיר רציפים ע י טיפול בנוזלים רובוטים, הזרקת דיו יבחינו פנה microarrayers21,22,23,24,25, 26 , או שהם יכולים להרכיב עצמית על משטחים כגון superhydrophillic כתמים בדוגמת על משטח superhydrophobic. 27 , 28 , 29

עם שיקולים אלה בחשבון, Droplet למיעון מיקרו-מערכים (עיוותים) תוכננו כדי לשלב את צדדיות, מיעון המרחבי ואמצעי אחסון מופחת של מיקרו-מערכים droplet עם הרגישות של מולקולה בודדת מיקרוסקופ TIRF כדי באופן כמותי למדוד חלבון שפע. 5 ארכיון דיגיטלי מאפשרים ניתוח תא בודד ויוצרים microarray droplet המכיל תאים בודדים מעל microarray נוגדנים, אשר הוא אז הכתיר בשמן כדי למנוע אידוי. נפחי טיפות הם נפרדים כדי למנוע הפסד דגימה אחרת תושג ע י על שבב valving ב מיקרופלואידיקה זרימה רציפה. 30 כמות חלבון המטרה של תא בודד המוחלט הוא קטן מאוד; עם זאת, נפח מופחת טיפות מאפשר ריכוז מקומי גבוה יחסית כדי בכך שהם מזוהים באמצעות assay נוגדן של כריך - נוגדן הוא משותק באזור ברורים, או נקודה, על משטח אשר לוכדת חלבון אשר בתורו מאגד כדי fluorescently עם תוויות ברורות זיהוי נוגדנים נוכח האחסון droplet. כמו ללא תווית בגישה (כלומר חלבון מטרות לא צריך להיות מתויג ישירות), ארכיון דיגיטלי הם חלים באופן כללי על ניתוח תאים ממקורות ראשוניים, כגון דם מעובד, בסדר צריך aspirates הפומבית הגידול ביופסיות, כמו גם תאים מתרבות, lysates שלהם.

מדידת וריאציית בשפע חלבון לרוחב אוכלוסיה תא חשוב בקביעת את הטרוגניות בתגובה, לדוגמה, את הסם, יסייעו במתן תובנה תאיים מסלולים, הערכת subpopulations שלהם התנהגות כמו גם לזהות אירועים נדירים אחרת להיות רעולי פנים על ידי שיטות בצובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להפיק ולהשתמש מיקרו-מערכים למיעון droplet כדי לקבוע באופן כמותי של השפע p53 פקטור שעתוק בתאים סרטניים אנושיים, עשוי לשמש כדי לחקור את התפקיד של p53 בתגובה תרופות כימותרפיות. חלבון המטרה נקבעת על-ידי הבחירה של נוגדנים לכידת וזיהוי, עשוי להיות שונה כדי לכלול יעדים שונים או יותר. ההוראות מסופקות כדי לבנות מנגנון פשוט שילוב זרבובית קונצנטריים מ ציוד מעבדה כללי כדי באופן ידני מערך 10 טיפות nL כתרים עם שמן. התהליך הניסויי מלא מתואר לפיה לכל droplet ואז נטען עם תא בודד, אשר לאחר מכן lysed, הביטוי של חלבונים נקבע עם רזולוציה מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ TIRF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה

  1. להפוך את שבבי מיקרו-מערכים נוגדן הדפסה
    1. לצרף של דבק סיליקון/אקריליק isolator coverslip functionalized כדי לתמוך microarray של נוגדן. זה נקרא את השבב.
      הערה: בדיקות משטח שונים, הביוכימיה נבדקו להתאמתם עם טיפות למיעון. 5 בדיקות משטח, הביוכימיה ייתכן שתצטרך להיות אופטימיזציה עבור לכידת חלופי סוכנים. ADM קתודית זמינים מסחרית או יכול להיות מיוצר על ידי חיתוך לייזר אקריליק (CAD קובץ עבור isolator נעשה שימוש בעבודה זו ניתנת להורדה; ראה קובץ קוד משלים).
    2. . הפעילי את microarrayer ולהגדיר את הלחות 75%.
      הערה: לחות יחסית מצמצמת אידוי של פתרון הדפסה מ מהמוט microarray והקטנת וריאציה אינטרה - ולא בין - spot.
    3. לנקות את הסיכה microarray ב- pin ניקוי פתרון עבור 5 דקות על-ידי ultrasonication. לשטוף את ה-pin עם מים אולטרא טהורים באמצעות בקבוק לשטוף, לייבש בעזרת חנקן.
      הערה: להשעות את ה-pin באשר רק לטבול את הטיפ pin. שקופית מיקרוסקופ עם קבוצה כראוי קדיחת חורים יעזור אם אין אפשרות להשיג בעל פין.
    4. להפוך 5 מ של מאגר ההדפסה הכוללת 3 × תמיסת מלח-נתרן ציטראט (האס) מאגר, betaine 1.5 M בתוספת 0.01% נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות). לאחסן ב 4 ° C ללא הגבלת זמן.
    5. כדי להכין פתרון ההדפסה, להפשיר נוגדן anti-p53 (p53/Mdm2 אליסה קיט; לראות את הטבלה של החומרים) aliquots המאוחסן ב- 80 ° C מערבבים את זה 1:1 עם מאגר ההדפסה כדי ריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל. לטעון µL 5-10 של פתרון הדפסה בצלחת 384 טוב-שימוש micropipette ולמקם microarrayer.
    6. לטעון צ'יפס בשלב 1.1.1 לצרפן את microarrayer. לתכנת את microarrayer כדי להדפיס כתמים בנקודות הציון שהוגדרו על-ידי המרכז של כל טוב של isolator.
      הערה: Microarrayers להעסיק מגוון, בעיקר, תוכנה קניינית הקורא הוא מומלץ להתייעץ עם הספרות הרלוונטית. Microarray הדרושות את isolator ADM נבחרים בקובץ CAD הנלווה בשלב 1.1.1 כוללת של אלמנטים מלבניים; המרחקים הרלוונטיים הינם מסופקים.
    7. לאחסן את האסימונים במיכלים אטום, לעטוף בנייר כסף. לאחסן ב 4 ° C עד 6 שבועות.
      הערה: רדיד האלומיניום היא כדי למנוע נזק צילום. אחסון ב 4 ° C מגביל את קצב השפלה של מולקולות ותגובות ברישול כלשהו כי רשאית לפעול כדי לצמצם את פעילות microarray. אטום לאוויר מאפשר השבבים equilibrate לטמפרטורת החדר לפני השימוש ללא עיבוי ויוצרים על פני שבב. צור קשר עם מתח הפנים של תוכנות המנצלות לרעה את ההדפסה microarray והצמדות בין הפתרון הדפסה מצע ההדפסה כדי לייצר נקודות. טרום הדפסה או סופג נדרש בדרך כלל כדי להסיר עודפי פתרון ה-pin microarray להניב מקומות ושקעים בגודל. אל תמחק את coverslip מראש ההדפסה ההקרבה מאז זה יכול לשמש כדי להעריך את איכות אצווה.
  2. הכנת מזרקים, tubing ו קונצנטריים זרבובית עבור dispensing למיעון טיפות
    1. לפרק µL 100 (עבור ה-droplet מימית) ו 1 מ"ל (עבור הנפט הגבלת התכיפות) זכוכית המילטון מזרקים ולשטוף חלקים עם מזוקקים H2O.
    2. להאכיל 100 מ מ אורך 150 מיקרומטר מזהה/360 מיקרומטר OD התמזגו סיליקה אבובים דרך באורך 40 מ מ של 1.0 מ מ ID/1/16 "OD מחברים לצנרת עד זה בולט על ידי 2 מ מ. זה יהוו הזרבובית קונצנטריים.
    3. למרוח שכבה דקה של דבק מגע דבק לסוף טיפ פיפטה 10 µL ולהוסיף לתוך פיסת 40 מ מ 1.0 מ מ ID/1/16 "OD מחברים לצנרת. אם נדרש, למקם מחדש את הצנרור fused סיליקה כדי לשמור על בליטה 2 מ מ- הצינור לפני הצילומים דבק.
    4. להכניס את הקצה השני של סיליקה fused נימי בסוף באורך 200 מ מ של 0.014" מזהה/0.062" כמנת PTFE אבובים, להתחבר זה µL 100 המילטון מזרק מלא עם 4% אלבומין בסרום שור (BSA) בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS) (PBSA).
      הערה: חלבונים ו מינים אחרים הביוכימי עלול להיקשר הלא ספציפית משטחים, יכול להיות אבד או שפגע בסימני. BSA משמש "לחסום" את משטחי כדי למזער מחייב שאינם ספציפיים על-ידי איגוד sacrificially שמשטחים אלה.
    5. הכנס אורך 400 מ 1.0 מ מ ID/2.0 מ מ OD FEP אבובים טיפ פיפטה 200 µL עד להיווצרות גושפנקה. למרוח שכבה דקה של דבק מגע דבק עוד 200 µL קצה פיפטה, לדחוף את זה לתוך הטיפ הראשון לתקן את הצנרת במקום. חבר את הקצה הפתוח של הצנרת OD FEP 1.0 מ מ מ מ ID/2.0 1 מ"ל המילטון מזרק מלא שמן מינרלי.
    6. הכנס את מכלול עצה פיפטה µL 200 10 µL פיפטה קצה הזרבובית קונצנטריים. מקום של המזרקים משאבות מזרק נפרד כפי שהם יצטרכו להיות מופעל באופן עצמאי.
    7. למלא את המזרק 100 µL PBSA 4% פתרון חסימה. לצרף ותורידי את הצנרור 'מימית' עם הפתרון חסימה. חזור על פעמיים עבור סכום כולל של ריקונים 3.
    8. למלא את המזרק 100 µL 0.125 µg מ ל-1 זיהוי נוגדנים (anti-p53 נוגדנים (דו-1) עם אלקסה 488) ב 4% PBSA, אבובים לצרף מחדש. החלפת פתרון חסימה באבובים על-ידי 25 שחולק µL זיהוי נוגדנים פתרון.
    9. לרוקן את הצנרור 'שמן' עם שמן מינרלי עד אבובים כל הצינור ממלא עם שמן. למלא את המזרק 1 מ"ל עם שמן מינרלי וצרף מחדש אבובים. המאבטחים את מכלול אבובים ו זרבובית מניפולטור XYZ.
  3. להכין microinjector micromanipulator
    הערה: השלבים להלן התייחסות ספציפית רכיבים של microinjector ו- micromanipulator מכשיר המצוין בטבלה של החומרים, אך הם חלים באופן כללי על כל מכשיר כזה.
    1. להרכיב את microinjector על-ידי הצמדת לאורך צינור לחץ, בעל נימי.
    2. לאט סובב את החוגה בוכנה עד שמן מינרלי לחלוטין ממלא את הקו.
    3. הר בעל נימי לתוך הר הראש התרגום.
    4. לתקן את נימי בעל נימי עם ראש אחיזה.
    5. Pipette פתרון של 4% PBSA באחת הבארות של isolator.
    6. לתרגם באמצעות את micromanipulator, לטבול את קצה נים אל הפתרון.
    7. לאט לאט למלא את נימי 4% PBSA ולהשאיר לחסום למשך 10 דקות.
    8. הוצא את microcapillary, המסתובב המודול תרגום כך ההרכבה היא ברורה של השבב.

2. יוצרים טיפות למיעון ו'טען עם תאים בודדים

  1. טיפות למיעון טופס
    1. אבטח את השבב על הבמה מיקרוסקופ.
      הערה: המיקרוסקופ הנו זריחה הפוך אוטומטית מיקרוסקופ המסוגל מולקולה בודדת TIRF מצויד שלב XY מקודד של אלקטרון הכפלת תשלום מצמידים מכשיר המצלמה (EM-CCD).
    2. להקליט את נקודות הציון של מיקרוסקופ הבמה של כל מקום במערך באמצעות התוכנה שליטה אוטומטית מיקרוסקופ.
    3. הגדר XYZ manipulator על הבמה מיקרוסקופ. המקום הזרבובית בזווית של 50-60 מעלות. ודא כי הצינור יש אורך מספיק אישור כדי להגיע את השבב. הגדר 'מימית' ואת 'שמן' מזרק משאבות כדי לוותר על 10 nL-µL 100/min ו- µL 5 ב 100 µL/דקה, בהתאמה.
      הערה: במהלך ההכנה, הפתרון מימית בראש הצינור עשוי יבש.
    4. לוותר על תמיסה מימית עד חרוז של נוזל יהיה גלוי על ראש הזרבובית. Dab עם אבק חינם לנגב כדי להסיר אותו.
      הערה: בהתאם למספר תנאים תחת חקירה, שומרים במספר בארות כדי לשמש מאגרים עבור תאים. קו/סוג של תא בודד מאגר יחיד יהיה מספיק.
    5. באמצעות תוכנת שליטה במיקרוסקופ אוטומטי, הגדר הקואורדינטות הבמה מיקרוסקופ נקודת נוגדנים ב- array ופוקוס על פני השטח coverslip.
    6. תיזהר שלא להפריע במקום, באמצעות XYZ manipulator, יישר את זכוכית נימי קצה הזרבובית קונצנטריים לצד של המקום נוגדן, לוותר על 10 nL של תמיסה מימית. מבלי להזיז את השלבים, לוותר על 5 µL של שמן וחוץ של תמיסה מימית. לאט לאט להעלות את הזרבובית ברורה של ה-droplet, מעבר לשני טוב.
    7. חזור על צעד 2.1.6 כל המקומות הנוגדן במערך.
    8. לאחר 30 דקות, תמונה כל נקודות במערך באמצעות התוכנה שליטה אוטומטית מיקרוסקופ כדי לקבוע את הרקע של מולקולות יחיד חייב כל נוגדן ספוט לפני טעינת תאים.
  2. לטעון למיעון טיפות עם תאים
    1. להסיר את המבחנות תרבות תא החממה ולנתק תאים באמצעות פתרון טריפסין/EDTA.
      הערה: במחקר זה, להיות האדם הגס קרצינומה של תא הקו שימש ותרבותית באמצעות של Dulbecco ששינה נשרים בינוני (DMEM) בתוספת 10% (v/v) בהריונות שור סרום (FBS) בחממה2 CO.
    2. אם נדרש, fluorescently כתם תאים.
      1. Resuspend התאים בפתרון של 0.125 μg/mL זיהוי נוגדנים (anti-p53 נוגדנים (דו-1) עם אלקסה 488) ב 10% FBS בתקשורת L-15. כדי להבטיח השעיה תא בודד, לסנן את הפתרון הסלולרי דרך מסננת תא גובה 40 µm.
    3. לספור תאים באמצעות hemocytometer לדלל או להתרכז הפתרון תא ריכוז של 25-400 × 103 תאים/mL.... דבר זה מבטיח את המשקע תאים עם מרווח מספיק כדי לתפעל בנוחות את microcapillary.
    4. לטעון תאים בודדים לתוך טיפות למיעון מן המאגר תא שימוש micromanipulator ו- microcapillary.
      הערה: התאים שאינם מחסידי עשוי להיות טעון בכמויות לתוך micropipette, בגליל אחד אחד לתוך טיפות למיעון. למרות הטיפול בחסימת משטח, נוטים שורות תאים חסיד הלא ספציפית להיצמד לקיר פנימי של microcapillary זכוכית. ולהיות אבוד.
    5. באמצעות מטרה × 10 כדי להתבונן, להשתמש microinjector את האחות תא בודד לתוך microcapillary מן המאגר התא.
    6. לאחסן את הקואורדינטות הבמה micromanipulator אם משתמש שלב מניפולטור אלקטרונית או לציין באופן ידני את z-מיקום.
    7. משכי את micropipette על ידי מתרגם את זה כלפי מעלה כדי לנקות את גובה 1 מ"מ של השבב. לבצע זאת באופן ידני עם ג'ויסטיק או באופן אוטומטי באמצעות התכונה 'הוצאה' של שלב מניפולטור אלקטרונית.
    8. מערכת שהבמה מרכזת כדי כי של droplet למיעון באמצעות אוטומטית תוכנות שליטה מיקרוסקופ. 'להחדיר' את micropipette על ידי להחזירו למצב מאוחסנות (או ציין) z. לבצע פעולה זו באופן ידני עם ג'ויסטיק או באופן אוטומטי אם משתמש שלב מניפולטור אלקטרונית.
      הערה: microcapillary לנקב את השמן הגבלת התכיפות, להיות ממוקם בתוך החלק מימית של ה-droplet למיעון.
    9. לוותר על התא ה-droplet למיעון באמצעות את microinjector. הנפח של droplet למיעון nL 10 יגדל ב- פחות מ 1%.
    10. חזור על 2.2.5-2.2.9 טיפות למיעון הנותר עוזב חלק בחינם עבור הפקד ניסיוני כאשר טיפות למיעון אינה מכילה תא.
      הערה: אלטרנטיבה פשוטה loading תאים בודדים טיפות למיעון באמצעות microcapillary micromanipulator היא להחליף את הפתרון בשלב 1.2.8 עם פתרון של זיהוי נוגדנים ב 4% PBSA תאים המכילים על ריכוז גודל 10 5 תאים למ"ל, שווה ערך ל תא 1/10 nL. תפוסה של תא בודד יהיה Poissonian, הריכוז התא יהיה צורך ניתן למטב.
  3. Lyse תאים ומערך תמונה
    1. התמונה בתאים טיפות באמצעות מיקרוסקופ brightfield, כולל כל הדמיה זריחה.
      הערה: הדמיה לוקח כ 3 דקות לשיקוף ~ 100 טיפות שימוש במיקרוסקופ אוטומטי. לבצע הדמיה עם נה 60 = 1.49 שמן-טבילה אובייקטיבי. אין מסננים נדרשים עבור brightfield imaging ואילו מערכות סינון סטנדרטי משמשים עבור קרינה פלואורסצנטית הדמיה.
    2. תמונה כל נקודות במערך באמצעות מיקרוסקופ TIRF מולקולה בודדת.
      הערה: ההגדרות משמשים כמו בשלב 2.3.1 עם TIRF מיוחדים לסנן סט. תמונות אלה ינותחו בהמשך בסעיף 3 כדי לקבוע את הרקע של מולקולות יחיד חייב בכל מקום נוגדנים לפני פירוק. מולקולה בודדת הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) גמורה לוקח כ 5 דקות לשיקוף ~ 100 נקודות.
    3. מתמקדים תא droplet למיעון. להשיג פירוק אופטי מלא על ידי התמקדות 6 יחיד ns בלייזר דופק (באורך גל 1064 ננומטר, הדופק אנרגיות 14.1 ± 0.3 µJ לפי הדופק) סמוך למקום של התא.
      הערה: הדופק לייזר מגדיר בועת קוויטציה ולהרחיב את המזמרה התא, משחררת הסלולר המרכיבים לתוך האחסון droplet. 4 , 31 התהליכים מכני עקב פירוק לייזר המושרה לא להפריע הממשק שמן מים-דופק נמוך אנרגיות. פירוק אופטי בדרך כלל לוקח כ- 20-30 דקות כדי lyse תאים 100. כפי שפורט בסעיף הדיון, ישנן מספר שיטות אלטרנטיביות למניעת lyse תאים בודדים אם פירוק אופטי ההתקנה אינה אפשרית.
    4. חזור על כל התאים המכילים למיעון טיפות עוזב 5 חינם עבור הפקד ניסיוני כאשר טיפות למיעון מכילה תא lysed האו ם.
    5. הערה בפעם שבו כל תא הוא lysed.
      הערה: בזמנים אלה ישמש כדי לתקן מחייב בודדים עיקולים על כל מקום בשלב 3.1.9. לעתים קרובות זה מספיק לציין את הזמנים כאשר התאים הראשונים והאחרונים הם lysed, מעריכים את השאר בהנחה תקופה מספקת עקביות בין אירועי פירוק.
    6. לרכוש תמונות מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ TIRF של כל נקודות בכל 10 דקות עבור הראשון 30 דקות ואז כל 20 דקות במשך 60 דקות נוספות. אם רק מעוניינים בכמות החלבון מאוגדים ב שיווי משקל, תמונה כל נקודות לאחר המקננת השבב במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: הזמן להגיע שיווי משקל תלוי droplet ונפח את הזיקות של הנוגדנים בשימוש וזמינותו. מיקרוסקופ TIRF מתבצעת באמצעות מקור עירור לייזר ב = 488 ננומטר ו 1.5 mW הספק כפי שנמדד על הפתח האחורי באמצעות מד הכוח האופטי של. מולקולה בודדת תמונות נרכשים על-ידי הגדרת ההגדרות רכישת המצלמה EM-CCD 900 ms רכישת זמן, 16-bit דיגיטציה בקצב readout 1 מגה-הרץ ולהשיג EM פקטור של 10. Isolator ניתן להשתמש מחדש על-ידי הסרת בקפידה את coverslip.

3. ניתוח נתונים

  1. מולקולה בודדת סופר (משטר שאינו דחוס/דיגיטליים)
    1. באמצעות פיג'י (או Matlab), מכל מקום שאינו דחוס נוגדן, לטעון את התמונה רכשה לפני פירוק (רקע, BKD).
      הערה: הפעולות בשלבים הבאים אבר המין הגברי מתבצעות באמצעות תוכנת ניתוח התמונה פיג'י. מדריך למשתמש יכול להימצא ב https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html הבא הקישור.
    2. ב פיג'י, בחר את התמונה BKD. תחת תפריט "תמונה" בחר "כפולים" כדי BKD כפולים. בחר את התמונה כפולים, תחת 'תהליך > המסננים', בחר 'טשטוש לפי עקומת גאוס' וציין ברדיוס של 50 פיקסלים.
    3. לשטח את התמונה BKD, שהוא הפצה יעילה בעוצמה אחידה של מקור האור עירור חלוקת התמונה BKD לפי תמונה מטושטשת BKD, הפקת BKD_FLAT.
      1. תחת "תהליך" בחר "תמונת מחשבון...", המציין את הפעולה "לחלק", הדימויים נדרש, ולאחר בחירת תיבות "יצירת חלון חדש" ו- "32-bit (float) תוצאת."
    4. לחסר כל פיקסל בתמונה 1 ("תהליך > מתמטיקה", בחר "לחסר...", ציין ערך של 1). עוצמת הפיקסלים הממוצע צריך להיות 0.
      הערה: שדה שיטוח, תמונות רקע שעברו שיטוח ניתנים לבדיקה בקלות מאז הסכום של כל הפיקסלים צריך להיות 0 ואת כל היסט הנותרים עשויים להיות מתוגמלים יותר אבר המין הגברי בגין.
    5. בחר אזור פיקסל פיקסל 50 × 50 בכל אחד 4 הפינות של תמונת BKD_FLAT. למדוד את סטיית תקן עוצמת פיקסל (σ) על-ידי בחירת 'נתח' ו "מדידה".
      הערה: נתוני סיכום סטטיסטיים של הבחירה יוצגו בחלון תוצאות. אפשרות זו קובעת את נקודת הרקע שבו יש סביר צפיפות גבוהה של מולקולות יחיד. האזור שברצונך למדוד ייתכן באופן ידני נבחרה באמצעות כלי הבחירה תפריט ברירת המחדל או על-ידי הפעלת המאקרו קוד "makeRectangle (x, y, רוחב, גובה)"; זה יוצר בחירה מלבנית, שבו x ו- y הם הקואורדינטות (בפיקסלים) של הפינה השמאלית העליונה.
    6. להגדיר את הסף תמונה 3σ וליצור תמונה בינארית SM_MASK.
      1. תחת "תמונה > להתאים", בחר "הסף..." ולהגדיר את רמת הסף התחתון 3σ.
        הערה: פיקסלים שערכו הם מתחת לסף מוגדרים לאפס ומוגדרים 1 פיקסלים העולה על הסף. הסף יקבע את הביטחון שבה פיקסלים thresholded שייכים מולקולה בודדת.
    7. בתמונה מקוטע SM_MASK, פיקסל להגדיר ערכי העוצמה לאפס של כל האובייקטים שאינם בעלי גודל של 4-9 פיקסל2 ו של מעגליות של 0.5 - 1 על-ידי בחירה "לנתח" ואחריו 'חלקיקים לנתח' וציון מעגליות וגודל.
      הערה: גודל פיקסל ייתכן שתצטרך להיות אופטימיזציה עבור אחרים fluorophores ו מיקרוסקופ סט ups. בשל הסוג של רעש המצלמה פיקסלים בודדים עשוי להיות מעל לגודל הסף הזה, לא להיות מושלך למרות שאינו מולקולות יחיד. הקריטריון גודל פיקסל ימחק כראוי כזה פיקסלים. מולקולות יחיד הם בדרך כלל מעגלית בכושר. הערך מעגליות 1 מציין עיגול מושלם בעוד ערך מתקרב 0 מציין צורה מוארכת יותר ויותר. האובייקטים שנותרו מולקולות יחיד, אולי אפשר לסמוך. ניתן להגדיר מסיכת לתיחום האזור של הנקודה להפלות עמדות וסופרת את נקודת לכל מסגרת. זה קל עבור מסגרות רכשה ובזמנים מאוחרים כאשר יש אות מספיק עמדות אשר יכול להיות מיושם על מסגרות קודמות.
    8. על אותו מקום שאינו דחוס נוגדן, לטעון וחזור על שלבים 3.1.1 - 3.1.7 עבור כל תמונה מסגרות שנלכדו כפי סדרה זמן לפתור שנרכשה פוסט פירוק. השתמש את הזמנים פירוק שרשמת בשלב 2.3.5. כדי לתקן כל עקומות מחייב.
  2. מולקולה בודדת סופר (המשטר דחוס/אנלוגי)
    1. על מנת לחשב את העוצמה הממוצעת של מולקולה בודדת, לפני שתמשיך, חזור על שלבים 3.1.1 - 3.1.8.
    2. הכפל את התמונות BKD_FLAT ו- SM_MASK להפקת תמונה לפיה ערכי אפס פיקסלים משויכים מולקולות יחיד.
      1. כדי לבצע זאת, תחת תפריט "תהליך", בחר תמונת מחשבון...", ציין את הפעולה"להכפיל"ואת התמונות הנדרשות, בחר את תיבות"יצירת חלון חדש"ואת"32-bit (float) תוצאת."
    3. סכום כל ערכי הפיקסלים בעוצמה על-ידי בחירת 'נתח', ולאחר מכן "מידה"; נתוני סיכום סטטיסטיים של הבחירה יוצגו בחלון תוצאות. מחלקים את מספר מולקולות יחיד שנספרו לפי שלב 3.1.8 כדי לחשב את העוצמה הממוצעת לכל מולקולה בודדת.
    4. עבור כל נוגדן גדוש ספוט, לטעון את התמונה רכשה שלאחר פירוק ולשטח עם תמונת רקע מטושטש לפי שלבים 3.1.2 ו- 3.1.3.
    5. לחסר כל פיקסל בתמונה שעברו שיטוח ב- 1 ("תהליך > מתמטיקה", בחר "לחסר...", ציין ערך של 1)
    6. בחר אזור פיקסל פיקסל 50 × 50 בכל אחד 4 הפינות של התמונה ולמדוד את סטיית תקן עוצמת פיקסל (σ). ראה שלב 3.1.5 לפרטים.
    7. ליצירת מסיכה ותמונה בינארית על-ידי הגדרת סף התמונה 3σ, ערכי העוצמה פיקסל מוגדר כאפס של אובייקטי עם גודל פיקסל פחות מ 42. כדי לבצע זאת, תחת התפריט 'נתח', בחר 'חלקיקים לנתח' וציין את גודל ואת מעגליות.
    8. הכפל את התמונה ספוט נוגדן גדוש שעברו שיטוח על-ידי המסכה תמונה בינארי.
      1. כדי לבצע זאת, תחת תפריט "תהליך", בחר תמונת מחשבון...", ציין את הפעולה"להכפיל"ואת התמונות הנדרשות, בחר את תיבות"יצירת חלון חדש"ואת"32-bit (float) תוצאת."
    9. סכום של עוצמות פיקסל הנותרים על-ידי בחירה "לנתח" ואחריו "מידה"; נתוני סיכום סטטיסטיים של הבחירה יוצגו בחלון תוצאות.
    10. לחלק את הסכום של פיקסל עוצמות מאת העוצמה הממוצעת מולקולה בודדת כדי לחשב את מספר מולקולות יחיד חייב המקום גדוש.
  3. עקומת כיול על כימות מוחלטת
    1. חזור על סעיפים 1 ו- 2 כדי ליצור 10 טיפות למיעון nL עם הנוגדן זיהוי בפתרון PBSA 4% עם חלבון רקומביננטי הריכוז הידוע.
    2. לבצע סדרה ריכוז של 102- 107 חומרים לכל droplet על ידי שינוי הריכוז הידוע של חלבון רקומביננטי הוסיף את הפתרון. מומלץ לעבוד מבחינת מספר חלבונים לכל droplet כדי להפוך את הנתונים תא בודד וכיול פשוטה.
    3. השתמש הסדרה ריכוז הנתונים בשלב 3.3.2 לכיול לכל מולקולה בודדת נחשב לכל מקום לשפע חלבון לכל droplet ועל -ידי סיומת שפע חלבון לכל תא ותא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המספר עותק חלבון הבזליים מוחלטת של p53 נקבע עם רזולוציה תא בודד בקו תא סרטן המעי הגס האנושי, להיות תאים. נדגים כיצד הביטוי p53 יכול המשתנים במספר סדרי גודל ולהראות מתאם חיובי חלש בין תא גודל וחלבון עותק מספר בתוך האוכלוסייה התא להיות מנוחתו.

מיקרו-מערכים Droplet למיעון נוצרות כאשר טיפות מימית הם ויתרו במיקומים ספוט נוגדן, כתרים עם שמן. . כאן, טיפות תומכים וזמינותו חלבון p53 רגיש. Coverslips נערכים עם לכידת נוגדן כתמים באמצעות microarrayer קשר עם סיכה. הנוגדן לכידת האנטי-p53 נלקח ערכת בדיקת ELISA מסחרי. תנאי ההדפסה היו כאלה כתמים לכידת היו כ- 100 מיקרומטר בקוטר עם קיבולת מקסימלית לכידת של חלבונים5 ± 0.5 x 10 6.2 לכל מקום. 32

השימוש isolator מלטשים את coverslip מאפשר צפיפות גבוהה יותר של טיפות כדי להיווצר מאז שהוא מגביל את התפשטות השמן למקומות לכידת נוגדן הסמוך. ב כל טוב של isolator טיפות נוצרות על ידי מחלק של תמיסה מימית, אשר הוא אז הכתיר בשמן כדי למנוע אידוי (איור 1 א'). כמות מינימלית של שמן עשוי ובשמפו וחוץ ה-droplet; עם זאת, שימושי כדי לוותר על סכום אשר מילויים isolator כל טוב בדיוק כזה פני שמן הוא שטוח עבור הדמיה. אספקה הם או ממקור מסחרית-שנעשו על ידי חיתוך לייזר גליונות אקרילי. נייר תרמי סיליקון הינם זמינים בארות חתוכות מראש במערך 4 x 6 (n = 24) אבל ניתן לשנות למערך עונה 4 פרק 11 (n = 44) באמצעות אגרוף עור ביופסיה או חור מרובה. הלייזר חותכים isolator איור 1B מציג מערך של 100 בארות משושה כל בעל קוטר מקסימלי של מ"מ-2.89, פרידה מרכז למרכז של 3.9 מ מ, בגובה של 0.5 מ מ. טיפות ניתן לאחסן ולהישאר יציבים לתקופות ממושכות של זמן (נצפו עד 3 חודשים).

טיפות נוצרים באופן ידני באמצעות מנגנון מתוצרת הבית, המתרגמת זרבובית אבובים קונצנטריים (איור 1C), המחובר אל שני מזרקים-אוטומטיים (איור 1 א'). הצינור אבובים קונצנטריים מורכבת נימי, סיליקה fused אשר dispenses שלב מימית, מוזן דרך באורך קצר של הצצה אבובים, אשר dispenses לשלב שמן. באמצעות מיקרוסקופ, הזרבובית מיושר נקודת נוגדן, המשאבות קודם לוותר על הפתרון מימית ומיד אחריו את השמן (איור 1E, שלבים 1-4). לאחר כל טיפות ב ADM נוצרים, microinjector, micromanipulator (ראה טבלה של החומרים) משמשים לטעינת לכל droplet עם תא בודד (איור 1D). Micropipette שילכוד תא מתוך מאגר של תאים, ויתרו באחת הבארות על השבב, יש לתרגם את droplet. ובכן, ואז לחדור את המכסה שמן כדי לספק את התא לתוך ה-droplet מימית (איור 1D, שלבים 5-8).

כל נקודות בתוך טיפות הם צילמו לפני פירוק וישמש כדי לקבוע את מידת שאינם ספציפיים מחייב הנקודות (איור 2 א). תאים בודדים הם לחלוטין lysed (כולל גרעין) בשיטות אופטי. 31 אופטי פירוק מסתמך על הכוח ההטיה של בועת המתרחב של הדופק-induced קוויטציה לייזר לשבש את התאים. יש לבצע טיפול כי הממשק שמן מים לא להיות מופרע ע י תהליכים אלה על-ידי הגבלת האנרגיות הדופק והפקדת תאים מן הממשק בשמן/מים. ברגע תאים הם lysed, המערך הוא עם תמונה על ידי מיקרוסקופ TIRF שימוש במיקרוסקופ אוטומטי; מסגרות נרכשים כל 10 דקות במשך 30 דקות, ואז כל 20 דקות במשך 60 דקות נוספות. התנאים, כגון נוגדנים זיקה, חלבון דיפוזיה droplet נפח, הן כאלה מחייב שיווי משקל הינו נגיש בתוך 90 דקות הרכישה. תא בודד אופייני הנפתח מוצג באיור 2A.

התהליך של ניתוח תמונה כדי לקבוע שהמולקולה יחיד נחשב סכמטי מצטיירת דמות 2B. תמונות של מקומות גם נחשבים ללא-דחוס, שבו ריכוז חלבון המטרה היא כזאת מולקולות יחיד הם מופרדים היטב להבחין בקלות, או דחוס, איפה היעד ריכוז חלבון גבוה יותר ויותר יחיד מולקולה תמונות חפיפה, הם כבר לא ניתן להבחנה בנפרד. מאז TIRF עירור הפרופיל אינו אחיד, זה הכרחי כי כל רכשה תמונות להיות שטוח-שדה מתוקן. טשטוש לפי עקומת גאוס מוחל על מסגרת שאינו דחוס, אשר פועל כמסנן החלקת להסיר פרטים ורעש ולייצר תמונה עם פרופיל ממוצע של הפרופיל עירור TIRF. ניתן להשתמש בתמונה זו מעובד "לשטח" את התמונה המקורית. עבור תמונות שאינו דחוס, שבו, אפילו על שיווי משקל, ישנם כמה מולקולות יחיד, מסגרת עשויה ניתן לעבד כדי לתקן את עצמו. גישה זו אינה ישימה למקום גדוש, שבה מולקולות יחיד בצפיפות לכבוש את המקום ודורש תמונת רקע כדי לרכוש עבור שיטוח. שעברו שיטוח מסגרות הן ואז thresholded עבור פיקסלים עם עוצמות לפחות 3 פעמים סטיית התקן של רקע בתוספת הערך הממוצע שלה. מולקולות יחיד זוהה לאחר מכן באופן אוטומטי על-ידי זיהוי הפיקסלים באשכולות 4-9 עם מעגליות גדול מ- 0.5 באמצעות תכונות החלקיקים ניתוח של פיג'י. את התוצאות, אולי ניתן לחשב את העוצמה הממוצעת של מולקולה בודדת. הוא משמש כדי לקבוע את מספר מולקולות יחיד על מקום גדוש על-ידי חלוקת העוצמה ספוט נוגדן הכולל מעוצמת הממוצע הידוע מולקולה בודדת. שלבים אלה עשויים להיות אוטומטי באמצעות עורך התסריטים של פיג'י.

סדרה ריכוז מתבצע כדי לקבוע את ספירת מולקולה בודדת ב שיווי משקל ב טיפות עם ריכוזים ידועים של החלבון p53 רקומביננטי (איור 3 א). התנאים הן כאלה המקומות הנוגדן לכידה לכידת שבריר של החלבון היעד הכולל, כ-1% באזור ליניאריות (10 חלבונים8 5-10 לכל droplet R2 = 0.99). הרמה של איגוד שאינם ספציפיים ב- טיפות הוא 187 ± 60 מולקולות. ניתן להמיר את התוצאות של pulldowns תא בודד ואז להשיג הפצות של חלבון מוחלטת מספר עותק לכל תא. איור 3B מציג את ההתפלגות של ביטוי חלבון p53 מוחלט תאים להיות בודדים באמצעות ארכיון דיגיטלי. ביטוי חלבון P53 בתאים להיות, אשר יש להניח יהיו זהים גנטית או דומה מאוד, הוא תהליך סטוכסטי. ההתפלגות היא כמו גמא - אסימטרית, unimodal עם זנב ארוך. כתוצאה מכך, הממוצע (1.82 גיגה × 106 חלבונים) יכול מגזים שפע חלבונים מודאלי (bin 0 - 5.0 × 105 חלבונים), סטיית התקן (1.88 × 106 חלבונים) לא לגמרי ללכוד את התכונות של ההתפלגות. חלוקה זו היא דוגמה על החשיבות של תא בודד מדידות כדי ללכוד את הטרוגניות של ביטוי חלבון באוכלוסייה התא, אשר אחרת יאבד בעת חישוב ממוצע עם מדידות בצובר. אולי ניתן למדוד פרמטרים נוספים עבור כל תא. . הנה, נפח התאים מוערך על ידי מדידת בכל קוטר תא לפני פירוק ה-droplet ובהנחה שהתא נמצא כ כדורית. איור 3C מציגה השוואה של p53 חלבון מוחלטת עותק מספר תאים להיות בודדים כפונקציה של גודל התא. יש נטייה תאים גדולים יותר יש מספר גבוה יותר של עותק p53 הכולל. מעניין, זה אפשרי מהתפלגות שיש תיאום בין ביטוי p53 וגודל תא מאז נראה שיש מספר עותק p53 מינימלי לכל תא; לעומת זאת, המנגנון שבאמצעותו למקרה כזה דורש חקירה.

Figure 1
איור 1: המנגנון Microarray Droplet למיעון ו- Chip. טיפות () הם ויתרו באופן ידני באמצעות תחמן 3-ציר לתרגם זרבובית אבובים קונצנטריים. ה-droplet מימית בגליל-במיקומים מסוימים microarray נוגדן ואחריו מיצוי שמן. (b) isolator מאפשר צפיפות גבוהה יותר של טיפות למיעון על המצע על-ידי הגבלת את התפשטות השמן. נייר תרמי עשוי להיות מיוצר על ידי חיתוך לייזר 0.5 מ מ גליונות אקרילי. כדי לסייע ויזואליזציה של טיפות, כחול צבע מאכל מועבר באמצעות המנגנון ב). קנה המידה של בר 10 מ"מ, שיבוץ סולם בר 1 מ מ. (ג) הזרבובית אבובים קונצנטריים מאפשר טיפות למיעון להתעצב, מורכבים כמו שלב 1.2 של הפרוטוקול. (ד) microinjector, micromanipulator משמשים כדי לבודד תאים droplets למיעון בודדים, מוכן כמו שלב 1.3 של הפרוטוקול. (e) שלבים עיקריים בתהליך יצירה וטעינה טיפות למיעון מוצג. נקודת נוגדן ממוקם באמצעות שלב התרגום מקודד (1) מקום מיושר לקצה לאורך צינור קפילר (2) ו מימית (3) ואז שמן (4) הרכיבים הם ויתרו. ניתן לטעון תאים בודדים באמצעות microcapillary זכוכית (5-8) אשר ניתן שוב ושוב כתובת ה-droplet מימית (7), להפקיד תא (8). גודל ברים 100 מיקרומטר. החץ האדום (5) ו- (8) מדגיש התא הבודד מבודד ומציג שיבוץ של (8) התא הבודד מבודד בהגדלה (סולם בר 10 מיקרומטר). חלקים של דמות זו שונתה הפניה12, לשכפל לאחר אישור של החברה המלכותית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תמונה צעדים analysis. כל מקום במערך צילמו מעת לעת על ידי מיקרוסקופ TIRF עד שיווי משקל (tEq) (90 דקות של p53 assay). הזמן שיווי משקל תלוי t פתרון, כמו גם את הזיקות של הזוג של הנוגדנים עבור החלבון יישוב. a) דוגמה מולקולה בודדת TIRF מיקרוסקופ תמונות של הרקע, כמו גם הנפתח תא בודד לדוגמה (סולם ברים 20 μm). שיבוץ תמונת מראה חלק מוגדל של תמונת הרקע עם מולקולות יחיד מודגשת על ידי חצים אדומים (סולם בר 5 μm). b) המתאר של ניתוח תמונות מפורטות בשלב 3 של הפרוטוקול. בקצרה, ישנם שני המשטרים רחבה איפה המקומות עשויים להיחשב מולקולות שאינו דחוס, יחיד הינם דליל, גדוש, שבו הצפיפות של מולקולות יחיד הוא כזה יש חפיפה משמעותית ועלולה כבר לא ניתן לזיהוי ביחידים. צעד מכריע בניתוח תמונת הוא שדה שיטוח כדי להסיר את האפקט של הפרופיל לא אחידה בעוצמה של הלייזר עירור. המשטר ספירה דיגיטלי, מולקולות יחיד מזוהים באופן ישיר, בהתבסס על הפרמטרים בעוצמה והצורה שלהם. באנלוגי ספירת המשטר, מספר מולקולות בודד מחושב על ידי מדידת עוצמת ספוט מוחלט על שיווי משקל ועל חלוקת מעוצמת הממוצע מולקולה בודדת, אשר ידוע מן המשטר ספירה דיגיטלי. צעדים אבר המין הגברי יהיה אוטומטי ב- ImageJ כדי לנתח את הנתונים. החלונית התחתונה רצף תמונות מראה הצטברות של חלבון המטרה על התפיסה נוגדן ספוט; בתחילה, שהנקודות לא דחוס (t1) ואילו כמו חלבון המטרה מצטבר על המקום נוגדן, מולקולות יחיד יכול להפוך יותר ויותר דחוס (tn) עד שיווי משקל (teq). שים לב כי אם נקודת נשאר שאינו דחוס או הופך להיות דחוס תלויה במספר גורמים, בפרט השפע של חלבון המטרה באמצעי האחסון ניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: יחיד נתוני התא. כימות מוחלטת מושגת באמצעות עקומת כיול. ספירות () יחיד מולקולה נעשים באמצעות ריכוז ידוע של חלבון רקומביננטי. זה הוא עקומת כיול, משמשת להמרת מולקולה בודדת לסמוך עליו בכל מקום בו מספר חלבונים היעד באמצעי האחסון ניתוח, ומכאן תא עותק מספר יחיד. קו מקווקו אופקי אדום מציין את רמת מחייב שאינם ספציפיים של 187 ± 60 מולקולות. קווי השגיאה הם אחד סטיית התקן של הממוצע של 3 ניסיוני פועל. הקו המקווקו מייצג 100% גילוי של חלבון. (b) התפלגות של p53 הבזליים תא בודד ביטוי חלבונים בתאי סרטן להיות מוצג מציג את התפלגות גמא דמוי ארוכת זנב בו ביטוי חלבון p53 בתאים מסוימים גבוה משמעותית מהערך מודאלי. (ג) פיזור מגרש של p53 חלבון מספר עותק לכל תא כפונקציה של נפח התאים מציג כמה חלבון ביטוי משתנה כפונקציה של גודל התא. יש חלקים של איור זה שונה מ- 12 , לשכפל בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מיקרו-מערכים Droplet למיעון הם שיטה רגישה וניתן להרחבה לקביעת באופן כמותי את המספר המוחלט עותק של חלבונים בתוך תא בודד.

הגבלת הרמה של איגוד שאינם ספציפיים (נאצית) חיוני בתוך הפרוטוקול להשגת כמו נמוך מגבלה של זיהוי ככל האפשר. חלבונים ו מינים אחרים הביוכימי הלא ספציפית עלול להיקשר אל מספר רב של ממשקים מתנה בתוך טיפות – פני השטח coverslip, הנוגדן ספוט וממשק בשמן/מים. חלבונים יכולים לאבד על-ידי חלוקה למחיצות של הממשק או השמן עצמו. אנחנו הראו כי 4% BSA נוכח ה-droplet מימית הוא מסוגל להגביל נאצית של חלבונים באמצעות נוגדנים שנקבעו בו. מטרות חלופיות חלבון ואת הנוגדנים להשתמש כדי לזהות אותם עשויים לדרוש גישות אלטרנטיביות חסימה, כגון דטרגנטים ללא יונית או פיתחה תואם. שמנים Fluorinated עשוי להיבדק גם על התאמתם בשירות כמו הנפט הגבלת התכיפות. במקרים כאלה, יש לבצע שיקולים נוספים כגון ריכוז קריטי מיצלה הצפיפות של הנפט הגבלת התכיפות.

רחוץ ההדפסה המאגר, אשר נשאר בכל מקום ספוט לאחר סידור במערך עזרי יישור. כאשר בתחילה מפקיד את טיפות, חייבים להקפיד לא לגרד או לגרום נזק במקום נוגדנים על ידי קצה הזרבובית אבובים קונצנטריים. בפיתוח השיטה עוד יותר, ייתכן מסטול של הפלורסנט לתוך המאגר ההדפסה נוגדנים אשר הופך משותק בנוסף הנוגדן הלכידה. יכולת זו תאפשר עבור שטיפת וחסימת הצעדים שיש לבצע לפני droplet סידור במערך; עם זאת, צעד כזה לא בהכרח יהיה צורך אם משתמש בשיטות אוטומטיות של droplet סידור במערך זה כגון שיטות הדפסה הזרקת דיו.

פני השטח של coverslips מסחרית מתוצרת שעליו נוצרות טיפות מצופה פולימר הידרופיליות, את טיפות מימית מצחק אותם עם אמצעי אחסון של 10 nL יש קוטר של 751 ± 42 מ מ. יש גבול עד כמה ה-droplet הופקדו צריך להרטיב את פני השטח או ממרחים עקב המשקל של הנפט הגבלת התכיפות מאחר מתחת עובי מינימלי גדל פיזור אופטי הלייזר עירור TIRF. הפיזור מגבירה את הרמה הממוצעת של רקע, יכול לטבוע את האות בעת זיהוי מולקולות יחיד. המקום נוגדנים גם להיות ממוקם מהקצה droplet מאז אור הלייזר עירור עשוי באופן חלקי או מלא להכות על שטח מחוץ ה-droplet מימית. התנאי זווית קריטית, כבר לא יזכה לאור בולט הממשק זכוכית-שמן לעומת הממשק זכוכית-מים.

כדי לקבוע באופן כמותי את השפע של חלבון מספר מולקולות יחיד חייב מקום צריכה להיקבע באמצעות ניתוח תמונות. כדי לקבוע את סך כמות החלבון בתמיסה של הרוזן מולקולה בודדת עקומת כיול נדרש ומאפשר את הטכניקה להיות כמותיים לחלוטין.

כדי למזער את photobleaching, כתמים הם לא עם תמונה באופן רציף, TIRF עירור לייזר מקור הכוח הוא ממוזער. הפרוטוקול כפי שהוצג שימש בהצלחה עבור photostable fluorophores כגון צובע אלקסה עבור חיל הים. Fluorophores אלטרנטיבית עשוי לשמש אבל photobleaching חייב להיות מוערך, פרוטוקול הדמיה הותאם במידת הצורך. אולי ניתן להתוות את המספר הכולל של מולקולות יחיד לכל מסגרת נגד הזמן כדי לשכפל את עקומת מחייב למרות שזה בהחלט לא הכרחי שאם הכריכה קינטיקה אינם המבוקש ואת ההדמיה מסגרת אחת ב"שיווי יספיק.

למרות שיש דרישה של שני נוגדנים זיקה גבוהה, התוצאה היא רגישה מאוד, מאוד מדויקת assay, חיונית עבור מדידות ברמת תא בודד. הנוגדנים p53 בשימוש פרוטוקול זה טוב אופטימיזציה באיתור p53 חינם של תאים בודדים. חלבון המטרה נקבעת על-ידי הבחירה של נוגדנים, עשוי להיות שונה במספר דרכים: 1, שני נוגדנים לכידת וזיהוי להחליף כדי לאגד מטרות חלופיות; 2, הנוגדן זיהוי. להחליף כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון או שינויים post-translational החלבון קשור הנוגדן לכידת, למשל לקבוע את מצב זירחון של p53 שנתפסו; 3, מבחני מרובבת יכול להיעשות על ידי הדפסה מרובים כתמים נוגדן לכידת בסמיכות — הדפסה של 3 × 3 מערך ספוט אפשרי בתוך טיפות 10nL. כמובן, עבור כל שינוי של חלבון היעד מספר מסכי נוגדן, פקדים, אופטימיזציות חייב להתבצע.

דווחו מספר שיטות lysing תאים בודדים. 33 אופטי פירוק היא גישה ללא כימיקלים כדי במהירות lyse תאים בודדים מבלי לשנות את התוכן של תאים ולשמירה על השלמות של חלבונים, מתחמי שלהם. פירוק כימי באמצעות חומרי ניקוי מהווה בעיה לשלמותו של טיפות בעת שימוש שמן מינרלי יכול להפריע אינטראקציות בין המולקולות. 34 עבור מבחני איפה פירוק כימי תואם זאת, הגישה אטרקטיבי שכן הוא לא מסתמך על ציוד כגון לייזרים או אלקטרודות micropatterned. 35

טיפות מראים ביצועים דומים עם שיטות חלופיות לתא בודד. הדור הנוכחי של טיפות באמצעות נוגדנים p53 המוצע, הוא שרמת NSB 187 ± מולקולות 60 לכל מקום. הסעיפים מולקולה בודדת התערוכה ליניאריות חזקה (R2 = 0.99) באזור המתפרסות על-פני 105 –108 p53 רקומביננטי חלבונים לכל droplet. זה מרמז כי בעוד רמות נמוכות של חלבון עלול להתגלות בתאים, יש מגבלה של כימות של חלבונים p535 10; זה מקביל ספירה מולקולה בודדת על המקומות של 901 ± 83. זה בעיקר מוגבל על ידי אמצעי האחסון של טיפות, ספיחה של ממשק. הביצועים של p53 וזמינותו היא כזאת כאשר הופיעה על 10 nL אמצעי האחסון רק 1.1 ± 0.2% של החלבון היעד הכולל נלכד מהפתרון; זה עולה ל- 85 ± 9%. כאשר הפחתת ניתוח אמצעי האחסון 0.2 nL. 36 על ידי הפחתת כמות טיפות כדי מתחת 1nL והפחתת ספיחה, יש פוטנציאל באמצעות נוגדנים שצוין כדי p53 בשיפור מהמגבלה של זיהוי כדי < חלבונים 50 בכל תא. לכן, טיפות למיעון יש פוטנציאל לשמש כדי למדוד חלבונים שפע נמוך מאוד של תאים בודדים.

מיעון של טיפות המוענקת על ידי הכיפה שמן בקלות נחדרת מאפשר נפח ניתוח התאים שמפקפקים ברצף. השימוש micropipette מאפשר ההזרקה של מספר הרצוי של תאים לתוך כל droplet פקק של 10-20 pL, אשר אינה מגדילה באופן משמעותי את עוצמת הקול. עבור השבב באיור איור 1B עם 100 וולס, בצורת טיפות ולטעון אותם עם תאים בודדים בדרך כלל לוקח 75-90 דקות טעינה תאים יכול להיעשות גם באמצעות טיפול באמצעות קונצנטריים אבובים זרבובית במקום micropipette או באמצעות ה-droplet פתרון המכיל תאים כאשר בתחילה ויוצרים את טיפות. האחרון יהיה שימושי בהגבלת מספר הצעדים בפרוטוקול אבל, בשני המקרים, והתפוסה לכל droplet יעקבו הפצה Poissonian. זה להגביל את הפרופורציה של תא בודד נתונים לכל שבב; עם זאת, טיפות עם אפס או מספר תאים תשמש פקדים. מגבלה נוספים באמצעות הצינור קונצנטריים אל כתובת טיפות הוא שאמצעי האחסון droplet יגדל בתוספות 10nL. עם השינויים המוצעים לעיל זה יכולים להשתפר. על שבב droplet מיקרופלואידיקה מסוגל לייצר טיפות בתדר גבוה, יש פוטנציאל להיות משולב באופן אוטומטי עם עיוותים לייצר מניפולציות טיפות, ברצף להפקיד אותם במערך מישוריים. זה בהחלט להתגבר על המגבלות של הייצור של ארכיון דיגיטלי תוך כדי גם הפיכת מולקולה בודדת readout טיפות.

היכולת להתייחס לכל droplet בודדים יש מגוון רחב של שימושים אפשריים. הראו את היכולת לטעון באופן רציף של תאים בודדים. הוא גם מאפשר הסרה של פוסט גשמי הסלולר לא מאוגד פירוק וניתוח פוסט מאת פיפטה עבור ניתוח שימוש בשיטות אחרות. דוגמאות חשפה יכלול PCR כמותי בזמן אמת או פלאנארית.

אחד צווארי בקבוק הנוכחי עבור מעבדות המבקשים לקחת גישה כמותית של אנליזת חלבונים תא בודד הוא המכשול הטכני גבוהה והצורך ציוד מיוחד. עם עיוותים, מיניאטורי, ניתוחי רגישות גבוהה עלולה להיות מושגת ללא צורך מתקני חדר נקי לפברק מכשירי מעבדה-על-שבב microfluidic. הניסויים אינן מוגבלות על ידי העיצוב של השבב, נפח והמיקום שלהם עשויים להשתנות ללא צורך בדיית האדונים החדשים. בהחלט, יש טווח עבור שיפור פישוט הטכניקה והורדת את מחסום הכניסה לניתוח תא בודד כדי רק microarrayer, כדי להדפיס נוגדן, מיקרו-מערכים droplet וגם קורא microplate פלורסצנטיות, התמונה.

מספר יישומים קליניים של תא בודד ניתוח מתגלים, במיוחד בטיפול בסרטן. הגידול הזה הוא אתגר גדול כימותרפיה יעילה. בהתפתחות הגידול, מתעוררות מוטציות בתדירות הולכת וגוברת, הטרוגניות עלולים לגרום מורפולוגי, גנטית, ולשינויים פרוטיאומיה מבנית. ניתוח תא בודד הוא מסוגל לפתור הטרוגניות סלולר בתוך הגידול ולספק פלטפורמה כדי לסייע טוב יותר להבין ולנבא טיפול תרופתי ההתנגדות ומדריך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ASR תוכנן ניסויים, פיתח פרוטוקולים, ניתחו נתונים. SC ו PS ביצע ניסויים גודל התא. ASR ו OC כתב היד. המחברים מאחלים לאשר בתודה את התמיכה של פרופסור דוד ר קלוג למתן גישה לציוד. המחברים רוצים להודות את אימפריאל קולג מתקדם Hackspace לגישה פבריקציה נוספת ומתקני טיפוס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Life Technologies 10010015
DMEM high glucose Sigma D6429
Foetal Bovine Serum (FBS) Biochrom S0115
cell culture flasks Corning SIAL0639
Trypsin/EDTA Biochrom L2153
Name Company Catalog Number Comments
Microarray
Microcontact Arrayer DigiLab, UK OmniGrid Micro
Microcontact pin ArrayIt, USA 946MP2
Coverslips (Nexterion) Schott, Europe 1098523 Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17
p53 capture antibody Enzo ADI-960-070
p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled Santa Cruz sc-126 stock concentration 200μg/mL
Saline-sodium citrate buffer Gibco 15557-044
Betaine Sigma 61962
Sodium dodecyl sulphate Sigma L3771
384 well plate (low volume) Sigma CLS4511
Nitrogen gas cylinder BOC Industrial grade, oxygen-free
Name Company Catalog Number Comments
Droplets
Micromanipulator Eppendorf Patchman NP2
Manual Microinjector Eppendorf CellTram Vario
Micropipette Origio, Denmark MBB-FP-L-0
Syringe pumps KD Scientific KDS-210
100 μL syringe Hamilton 81020 Gas tight, PTFE Luer lock
1 mL syringe Hamilton 81327 Gas tight, PTFE Luer lock
Silicone isolator Grace Bio-Labs JTR24R-A-0.5 6x4 well silicone isolator with adhesive
Laser cutter VersaLASE VLS2.30 CO2 Laser 3W for laser cutting of custom isolators
1mm thick acrylic sheet Weatherall-UK Clarex Precision Sheet 001 for laser cutting of custom isolators
Adhesive sheet 3M used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips
Super glue Loctite LOCPFG3T
150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing IDEX FS-115
1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing IDEX 1503
0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing Kinesis 008T16-100
1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing IDEX 1673
Bovine Serum Albumen (BSA) Fisher Scientific BP9700100
Mineral oil Sigma M5904
Ultra-pure water Millipore, Germany MilliQ
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy & Optics
TIRF microscope with encoded XY stage Nikon, Japan Nikon Ti-E
EM-CCD Andor Technologies, Ireland IXON DU-897E
Laser excitation source Vortran, USA Stradus 488-50
Optical lysis laser source Continuum, USA Surelite SLI-10
Microscope filter cube for TIRF Chroma, USA z488bp
Microscope filter cube for Optical Lysis Laser 2000, UK LPD01-532R-25
Name Company Catalog Number Comments
Software
Fiji Open Source Image analysis software
Matlab Mathworks version 7.14 or higher Image analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
  2. Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
  3. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
  4. Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
  5. Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
  6. Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
  7. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
  8. Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
  9. He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
  13. Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
  14. Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
  15. Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
  16. Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
  17. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  18. Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
  19. Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
  20. Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
  21. Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
  22. Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
  23. Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
  24. Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
  25. Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
  26. Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
  27. Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
  28. Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
  29. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  30. Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
  31. Lai, H. -H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).
  32. Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
  33. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).
  34. Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
  35. Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
  36. Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).

Tags

חקר הסרטן גיליון 137 מיקרופלואידיקה Droplet אנליזת חלבונים תא בודד הטרוגניות מיקרופלואידיקה טיפות כימות מוחלטת p53 גודל תא
ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chatzimichail, S., Supramaniam, P.,… More

Chatzimichail, S., Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays. J. Vis. Exp. (137), e56110, doi:10.3791/56110 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter