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Cancer Research

पता करने वाली छोटी बूंद Microarrays के साथ एकल कोशिकाओं में प्रोटीन गिनती

Published: July 6, 2018 doi: 10.3791/56110
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम संबोधित करने योग्य छोटी बूंद microarrays (ADMs), एकल कोशिकाओं में पूर्ण प्रोटीन बहुतायत निर्धारित करने में सक्षम एक छोटी बूंद सरणी आधारित विधि मौजूद है । हम ADMs की क्षमता प्रदर्शित करने के लिए एक मानव कैंसर कोशिका लाइन में ट्यूमर शमनकर्ता प्रोटीन p53 की अभिव्यक्ति में विविधता विशेषताएं ।

Abstract

अक्सर सेलुलर व्यवहार और सेलुलर प्रतिक्रियाओं जनसंख्या स्तर पर विश्लेषण कर रहे हैं, जहां कई कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं एक औसत एक जटिल आबादी के भीतर अमीर एकल कोशिका व्यवहार मास्किंग परिणाम के रूप में एक साथ परित हैं । एकल सेल प्रोटीन का पता लगाने और ठहराव प्रौद्योगिकियों हाल के वर्षों में एक उल्लेखनीय प्रभाव बना दिया है । यहाँ हम एक व्यावहारिक और लचीला एकल सेल विश्लेषण पता करने योग्य छोटी बूंद microarrays पर आधारित मंच का वर्णन. इस अध्ययन का वर्णन कैसे लक्ष्य प्रोटीन की निरपेक्ष प्रतिलिपि संख्या एकल सेल संकल्प के साथ मापा जा सकता है । ट्यूमर शमन करनेवाला p53 मानव कैंसर में सबसे अधिक रूपांतरित जीन है, कुल कैंसर एक गैर स्वस्थ p53 अभिव्यक्ति पैटर्न का प्रदर्शन के मामलों के ५०% से अधिक के साथ । प्रोटोकॉल जो एकल मानव कैंसर की कोशिकाओं को अलग कर रहे है और p53 प्रोटीन की प्रतिलिपि संख्या में एक अणु संकल्प के साथ ठीक अभिव्यक्ति में परिवर्तनशीलता निर्धारित करने के लिए मापा जाता है 10 nL बूंदें बनाने के लिए कदम का वर्णन । विधि प्राथमिक सामग्री सहित किसी भी सेल प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है ब्याज की किसी भी लक्ष्य प्रोटीन की निरपेक्ष प्रतिलिपि संख्या का निर्धारण ।

Introduction

इस विधि का लक्ष्य एक सेल संकल्प के साथ एक सेल जनसंख्या में एक लक्ष्य प्रोटीन की बहुतायत में भिंनता निर्धारित करने के लिए है । एकल सेल विश्लेषण पारंपरिक पहनावा जैव रासायनिक तरीकों के साथ उपलब्ध नहीं हैं कि लाभ के एक नंबर प्रदान करता है. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 सबसे पहले, एक सेल स्तर पर काम कर रहे है कि अंयथा औसत है कि पारंपरिक पहनावा जैव रासायनिक तकनीक के साथ होता है द्वारा खो जाएगा एक सेल की आबादी के अमीर विविधता पर कब्जा कर सकते हैं । काम के बहुमत-घोड़ा जैव रासायनिक तरीकों थोक के साथ काम करते हैं, की आवश्यकता होती है, के रूप में वे अक्सर करते हैं, कोशिकाओं के लाखों एक परिणाम का उत्पादन करने के लिए. बेशक, पूरे सेल की आबादी का आकलन करने के परिणाम कारकों की एक संख्या पर निर्भर करता है, उदाहरण के लिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति में विविधता जहां प्रोटीन बहुतायत के वितरण की कुछ महत्वपूर्ण सुविधाओं को याद किया जा सकता है । एक व्यावहारिक परिप्रेक्ष्य से, एक सेल तकनीक की आवश्यकता संवेदनशीलता उंहें जैविक सामग्री की मात्रा के साथ काम करने में सक्षम है कि और भी अधिक संवेदनशील थोक तकनीकों के लिए कार्य करने के लिए अपर्याप्त है । इस का एक महत्वपूर्ण उदाहरण इस तरह के ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी (CTCs) जहां भी एक गरीब शकुन outlook से कम 10 CTCs के साथ रोगियों के लिए एक एकल ७.५ मिलीलीटर रक्त ड्रा में मौजूद हो सकता है के रूप में दुर्लभ कोशिका प्रकार का अध्ययन है । 6 यहां हम एक कम मात्रा एंटीबॉडी आधारित तेल-छाया हुआ एक एंटीबॉडी microarray पर छपी बूंदों को रोजगार परख का उपयोग कर एकल कोशिका प्रोटीन माप प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक कार्यप्रणाली प्रस्तुत करते हैं ।

Microfluidic छोटी बूंद प्लेटफार्मों उच्च प्रवाह कर रहे हैं, प्रति सेकंड बूंदों के हजारों उत्पंन करने में सक्षम है, और अलग करने में सक्षम है, और यहां तक कि संवर्धन, व्यक्तिगत बूंदों में एकल कोशिकाओं जैव रासायनिक परख की एक विस्तृत सरणी प्रदर्शन करने के लिए । छोटी बूंद-आधारित तकनीक अच्छी तरह से एकल सेल विश्लेषण,7,8,9 DropSeq10 और11ड्रॉप, जो बहुत की शक्ति से सहायता प्राप्त किया गया है सहित उल्लेखनीय हाल के उदाहरणों के साथ के लिए अनुकूल है प्रवर्धन तकनीक । सामग्री की सीमित मात्रा में और प्रोटीन के लिए प्रवर्धन का कोई तरीका नहीं एकल सेल प्रोटियोमिक् विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बना ।

बूंदों तरीकों की एक संख्या से विश्लेषण किया जा सकता है और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है । ऐसे कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी के रूप में एकल अणु तकनीक फ्लोरोसेंट अणुओं अद्वितीय संकेत के साथ visualized करने के लिए शोर अनुपात की अनुमति देता है । 12 evanescent क्षेत्र की घातीय क्षय के कारण, सतह (100nm के आदेश) के लिए उच्च निकटता में केवल fluorophores एक जटिल मिश्रण में एक लक्ष्य अणु की छोटी मात्रा का पता लगाने में एक अच्छी रणनीति TIRF बनाने उत्साहित हैं । TIRF की अंतर्निहित ऑप्टिकल सेक्शनिंग ताकत भी धोने कदम और सीमा परख समय और जटिलता से बचने में मदद करता है । हालांकि, TIRF की आवश्यकता है planar सतहों और TIRF माइक्रोस्कोपी के उदाहरण प्रवाह में बूंदों के लिए लागू की एक planar सतह के गठन शामिल है जो छवि के लिए । 13 यह अंत करने के लिए, एकल सेल proteomic तकनीक अक्सर सतह के आसपास microfluidic चिप्स डिजाइन-मैटीरियल कैप्चर एजेंटों एक microarray प्रारूप में । 4 , 14

बूंदों, खुद, planar सतहों पर arrays में गठन किया जा सकता है, तथाकथित छोटी बूंद microarrays । 15 , 16 , 17 स्थानिक arrays में बूंदों का आयोजन उंहें आसानी से अनुक्रमित किया जा करने की अनुमति देता है, आसान समय पर नजर रखी, व्यक्तिगत रूप से संबोधित और, यदि आवश्यक हो, प्राप्त की । छोटी बूंद microarrays चिप जो या तो मुक्त खड़े या microwell संरचनाओं द्वारा समर्थित है प्रति तत्वों के हजारों के साथ सूक्ष्म रिएक्टरों के एक उच्च घनत्व को प्राप्त कर सकते हैं । 18 , 19 , 20 वे तरल हैंडलिंग रोबोट द्वारा अनुक्रमिक जमाव द्वारा गठित किया जा सकता है, inkjet निशानदेही, संपर्क microarrayers21,22,23,24,25, 26 या वे ऐसे superhydrophillic एक superhydrophobic सतह पर नमूनों धब्बे के रूप में सतहों पर आत्म इकट्ठा कर सकते हैं । 27 , 28 , 29

मन में इन विचारों के साथ, पता छोटी बूंद Microarrays (ADMs) बहुमुखी प्रतिभा, स्थानिक पता और छोटी बूंद के कम मात्रा में एक अणु TIRF माइक्रोस्कोप की संवेदनशीलता के साथ मात्रात्मक करने के लिए गठबंधन डिजाइन किए गए थे उपाय प्रोटीन बहुतायत । 5 ADMs सक्षम एकल सेल विश्लेषण एक छोटी बूंद microarray एक एंटीबॉडी microarray है, जो तो तेल के साथ छाया हुआ है वाष्पीकरण को रोकने पर युक्त एकल कोशिकाओं के गठन । बूंदों का आयतन नमूना हानि को रोकने के लिए असतत है, जो अन्यथा सतत प्रवाह microfluidics में ऑन-चिप valving द्वारा प्राप्त किया जाएगा । 30 एक ही कोशिका से लक्ष्य प्रोटीन की निरपेक्ष राशि बहुत छोटा है; हालांकि, बूंदों की कम मात्रा के क्रम में अपेक्षाकृत उच्च स्थानीय एकाग्रता के लिए अनुमति देता है कि वे एक सैंडविच एंटीबॉडी परख का उपयोग कर पता लगाया जाता है-एंटीबॉडी एक अलग क्षेत्र में मैटीरियल है, या स्पॉट, एक सतह है जो प्रोटीन जो बदले में बांधता है पर कब्जा छोटी बूंद मात्रा में मौजूद एक फ्लोरोसेंट लेबल का पता लगाने एंटीबॉडी करने के लिए । एक लेबल मुक्त दृष्टिकोण के रूप में (यानी प्रोटीन लक्ष्य के लिए सीधे लेबल की जरूरत नहीं है), ADMs आम तौर पर प्राथमिक स्रोतों से कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए लागू कर रहे हैं, जैसे संसाधित रक्त, ठीक की जरूरत है aspirates और असंबद्ध ट्यूमर बायोप्सी, साथ ही कोशिकाओं से संस्कृति और उनके lysates.

एक सेल जनसंख्या भर में प्रोटीन बहुतायत में भिंनता मापने के जवाब में विविधता का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए, एक दवा के लिए और सेलुलर कार्यों और रास्ते में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में मदद करेगा, उपजनसंख्या का आकलन और उनके व्यवहार के साथ ही दुर्लभ घटनाओं है कि अंयथा थोक तरीकों से नकाबपोश किया जाएगा की पहचान । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे उत्पादन और पता करने के लिए छोटी बूंदें microarrays का उपयोग मात्रात्मक मानव कैंसर की कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारक p53 की बहुतायत निर्धारित करने के लिए और कीमोथेरेपी दवाओं के जवाब में p53 की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । लक्ष्य प्रोटीन कैप्चर और डिटेक्शन एंटीबॉडी के चयन के द्वारा निर्धारित किया जाता है और अधिक या विभिन्न लक्ष्यों को शामिल करने के लिए संशोधित हो सकता है । निर्देश के लिए एक सरल सामांय प्रयोगशाला उपभोग्य सामग्रियों से मैंयुअल रूप से 10 nL बूंदें तेल से ढकी एक गाढ़ा नोक शामिल तंत्र का निर्माण प्रदान की जाती हैं । पूर्ण प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है जिससे प्रत्येक छोटी बूंद फिर लीजड ड और प्रोटीन की अभिव्यक्ति TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एकल अणु संकल्प के साथ निर्धारित है, जो एक एकल कोशिका के साथ भरी हुई है ।

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Protocol

1. तैयारी

  1. चिप्स बनाएं और प्रिंट एंटीबॉडी microarrays
    1. एक चिपकने वाला सिलिकॉन/एक्रिलिक के लिए एक एंटीबॉडी microarray का समर्थन करने के लिए कार्यात्मक coverslip संलग्न । यह चिप के रूप में संदर्भित किया जाता है ।
      नोट: विभिन्न सतह chemistries पता करने वाली बूंदों के साथ उनकी उपयुक्तता के लिए परीक्षण किया गया है । 5 सतह chemistries वैकल्पिक कब्जा एजेंटों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है । ADM के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है या लेजर काटने एक्रिलिक द्वारा उत्पादित किया जा सकता है (इस काम में इस्तेमाल किया अलग करने के लिए सीएडी फ़ाइल एक डाउनलोड के रूप में प्रदान की जाती है; पूरक कोड फ़ाइलदेखें) ।
    2. microarrayer पर स्विच और ७५% करने के लिए आर्द्रता निर्धारित किया है ।
      नोट: सापेक्षिक आर्द्रता microarray पिन से मुद्रण समाधान के वाष्पीकरण को कम कर देती है और इंट्रा और अंतर-स्थान भिन्नता को कम कर देती है.
    3. साफ microarray पिन में पिन सफाई समाधान के लिए 5 मिनट अल्ट्रासोनिक द्वारा । एक धोने की बोतल का उपयोग कर अल्ट्रा शुद्ध पानी के साथ पिन कुल्ला और नाइट्रोजन का उपयोग कर सूखी ।
      नोट: पिन के रूप में केवल पिन टिप विसर्जित करने के लिए निलंबित. छेद का एक उचित सेट के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड अगर एक पिन धारक प्राप्त नहीं किया जा सकता मदद मिलेगी ।
    4. 3 × खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी) बफर, १.५ मीटर betaine ०.०१% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के साथ पूरक के शामिल प्रिंट बफर के 5 मिलीलीटर बनाओ । 4 ° c अनिश्चित काल में स्टोर ।
    5. मुद्रण समाधान तैयार करने के लिए, गल anti-p53 एंटीबॉडी (p53/Mdm2 एलिसा किट; सामग्री की तालिका देखें) aliquots पर संग्रहित-८० ° c । यह प्रिंट बफर के साथ ०.५ मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए 1:1 मिश्रण । एक ३८४ अच्छी तरह से एक micropipette और microarrayer में जगह का उपयोग कर प्लेट में मुद्रण समाधान के 5-10 µ एल लोड ।
    6. लोड चिप्स 1.1.1 microarrayer में कदम में इकट्ठे हुए । कार्यक्रम microarrayer के लिए अलग से एक कुआं के केंद्र द्वारा परिभाषित निर्देशांक पर धब्बे मुद्रित करने के लिए ।
      नोट: Microarrayers, मुख्य रूप से, मालिकाना सॉफ्टवेयर की एक सीमा को रोजगार और पाठक प्रासंगिक साहित्य से परामर्श करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है । microarray के लिए आवश्यक ADM के साथ CAD चरण में फ़ाइल में चित्रित किया-1.1.1 आयताकार तत्वों के शामिल; संबंधित दूरियां उपलब्ध कराई गई हैं ।
    7. चिप्स को वाटरप्रूफ कंटेनर में स्टोर करें और चमकी के साथ लपेट लें । 6 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      नोट: पन्ना किसी भी फोटो-नुकसान को रोकने के लिए है । 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण और microarray गतिविधि को कम करने के लिए कार्य कर सकते हैं कि किसी भी बचके प्रतिक्रियाओं, जो अपने अणुओं की गिरावट दर को सीमित करता है । एक वाटरप्रूफ कंटेनर चिप सतह पर बनाने के बिना उपयोग से पहले कमरे के तापमान को equilibrate करने के लिए चिप्स की अनुमति देता है । संपर्क microarray छपाई प्रिंट समाधान और प्रिंट सब्सट्रेट के बीच सतह तनाव और आसंजन का दोहन करने के धब्बे का उत्पादन । पूर्व मुद्रण या सोख्ता सामांय रूप से microarray पिन से अतिरिक्त समाधान हटाने के लिए समान रूप से आकार स्थानों उपज की आवश्यकता है । बलि पूर्व प्रिंट coverslip के बाद से यह बैच गुणवत्ता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मत छोड़ना ।
  2. पता करने के लिए बूंदों के वितरण के लिए सीरिंज, टयूबिंग और गाढ़ा नोजल तैयार
    1. जुदा १०० µ एल (जलीय छोटी बूंद के लिए) और 1 मिलीलीटर (कैपिंग तेल के लिए) ग्लास हैमिल्टन सीरिंज और आसुत एच2ओ के साथ भागों कुल्ला ।
    2. एक १०० मिमी की लंबाई फ़ीड १५० µm आईडी/360 µm आयुध डिपो के एक ४० मिमी लंबाई १.० mm आईडी/1/16 "आयुध डिपो पीएफए ट्यूबिंग के माध्यम से यह 2 मिमी से बहर तक जुड़े हुए सिलिका टयूबिंग । यह गाढ़ा नोजल बनेगी ।
    3. लागू करें cyanoacrylate गोंद की एक पतली परत के अंत में एक 10 µ l पिपेट टिप और डालने के ४० mm टुकड़ा में १.० mm ID/1/16 "ओडी पीएफए टयूबिंग । यदि आवश्यक हो, फ्यूजन सिलिका टयूबिंग स्थिति चिपकने वाला सेट से पहले नोक पर एक 2 मिमी दखलंदाजी बनाए रखने के लिए ।
    4. एक २०० मिमी लंबाई के अंत में जुड़े सिलिका केशिका के दूसरे छोर डालें ०.०१४ "ID/0.062" आयुध डिपो PTFE टयूबिंग और इस कनेक्ट एक १०० µ एल हैमिल्टन सिरिंज फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) (PBSA) में 4% गोजातीय सीरम सफ़ेदी (BSA) से भरा है ।
      नोट: प्रोटीन और अंय जैव रासायनिक प्रजातियों गैर विशेष रूप से सतहों के लिए बाध्य कर सकते है और खो दिया है या विकृत कर सकते हैं । BSA उन सतहों के लिए बाध्यकारी sacrificially द्वारा गैर विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए ' ब्लॉक ' सतहों के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    5. एक २०० µ l पिपेट टिप में १.० mm ID/2.0 mm OD FEP टयूबिंग की एक ४०० mm लंबाई डालें जब तक यह एक सील रूपों । एक और २०० µ एल पिपेट टिप cyanoacrylate गोंद की एक पतली परत लागू करें और पहले टिप में इस धक्का के लिए जगह में टयूबिंग तय । १.० mm ID/2.0 mm OD FEP टयूबिंग के खुले अंत कनेक्ट करने के लिए एक 1 एमएल हैमिल्टन खनिज तेल से भरा सिरिंज ।
    6. २०० µ l पिपेट टिप असेंबली को गाढ़ा नोजल के 10 µ l पिपेट टिप में डालें. सीरिंज को अलग से सिरिंज पंपों में रखें क्योंकि उन्हें स्वतंत्र रूप से संचालित करने की आवश्यकता होगी ।
    7. 4% PBSA अवरुद्ध समाधान के साथ १०० µ एल सिरिंज भरें । फिर से अनुलग्न करें और अवरुद्ध समाधान के साथ ' जलीय ' टयूबिंग फ्लश । 3 फ़्लशेस की कुल के लिए दो बार दोहराएँ.
    8. भरें १०० µ एल ०.१२५ µ जी एमएल के साथ सिरिंज-1 डिटेक्शन एंटीबॉडी (विरोधी p53 एंटीबॉडी (DO-1) Alexa ४८८ के साथ लेबल) में 4% PBSA और फिर से ट्यूबिंग देते हैं । 25 µ एल का पता लगाने एंटीबॉडी समाधान वितरण द्वारा टयूबिंग में अवरुद्ध समाधान की जगह ।
    9. सभी टयूबिंग और नोजल तेल के साथ भरता है जब तक ' तेल ' खनिज तेल के साथ ट्यूबिंग फ्लश । खनिज तेल और फिर से टयूबिंग-संलग्न के साथ 1 मिलीलीटर सिरिंज फिर से भरना । एक XYZ जोड़तोड़ करने के लिए टयूबिंग और नोक विधानसभा सुरक्षित ।
  3. तैयार microinjector और micromanipulator
    नोट: नीचे दिए गए चरण सामग्री की तालिका में निर्दिष्ट microinjector और micromanipulator तंत्र के घटकों के लिए विशिष्ट संदर्भ बनाते हैं, लेकिन सामांयत: ऐसे किसी भी उपकरण पर लागू होते हैं ।
    1. दबाव टयूबिंग और केशिका धारक संलग्न द्वारा microinjector इकट्ठा ।
    2. धीरे से जब तक खनिज तेल पूरी तरह से लाइन भरता है पिस्टन डायल घुमाएं ।
    3. अनुवाद सिर माउंट में केशिका धारक माउंट ।
    4. पकड़ सिर के साथ केशिका धारक में केशिका ठीक ।
    5. पिपेट 4% PBSA के एक अलग के कुओं में से एक समाधान ।
    6. micromanipulator का उपयोग कर अनुवाद और समाधान में केशिका की नोक विसर्जित ।
    7. धीरे 4% PBSA के साथ केशिका भरें और 10 मिनट के लिए ब्लॉक करने के लिए छोड़ दें ।
    8. microcapillary बाहर निकालें और अनुवाद मॉड्यूल कुंडा इतना है कि विधानसभा चिप के स्पष्ट है ।

2. फार्म पता करने वाली बूंदों और एकल कोशिकाओं के साथ लोड

  1. प्रपत्र पता करने के लिए बूंदें
    1. माइक्रोस्कोप मंच पर चिप सुरक्षित ।
      नोट: माइक्रोस्कोप एक औंधा प्रतिदीप्ति स्वचालित माइक्रोस्कोप एक अणु TIRF एक एक इनकोडिंग XY मंच और एक इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज डिवाइस कैमरा (EM-सीसीडी) के साथ सज्जित में सक्षम है ।
    2. स्वचालित माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सरणी में प्रत्येक स्थान के माइक्रोस्कोप चरण निर्देशांक रिकॉर्ड.
    3. माइक्रोस्कोप मंच पर XYZ जोड़तोड़ सेट । नोजल को 50-60 ° के कोण पर रखें । सुनिश्चित करें कि नोजल पर्याप्त लंबाई और मंजूरी चिप तक पहुंचने के लिए है । सेट ' जलीय ' और ' तेल ' सिरिंज पंपों पर 10 nL वितरण करने के लिए १०० µ l/मिनट और 5 µ l पर १०० µ l/मिनट, क्रमशः ।
      नोट: तैयारी के दौरान, नोजल के सिर पर जलीय समाधान सूख सकता है ।
    4. जलीय समाधान वितरण जब तक एक मनका द्रव की नोक के सिर पर दिखाई दे रहा है । इसे दूर करने के लिए एक धूल मुक्त पोंछा के साथ ढाब ।
      नोट: जांच के तहत शर्तों की संख्या के आधार पर, कोशिकाओं के लिए जलाशयों के रूप में सेवा करने के लिए कुओं के एक नंबर आरक्षित । एक एकल कक्ष लाइन के लिए/प्रकार एक ही जलाशय पर्याप्त होगा ।
    5. स्वचालित माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, माइक्रोस्कोप मंच सेट सरणी में एक एंटीबॉडी स्थान और coverslip सतह पर ध्यान केंद्रित करने के लिए निर्देशांक ।
    6. सावधान हाजिर परेशान करने के लिए नहीं, XYZ जोड़तोड़ का उपयोग कर, एंटीबॉडी स्थान के पक्ष के लिए गाढ़ा नोजल के कांच केशिका टिप संरेखित करें और जलीय समाधान के 10 nL वितरण । चरणों ले जाने के बिना, तेल की 5 µ एल वितरण के लिए जलीय समाधान टोपी । धीरे से छोटी बूंद की नोक स्पष्ट उठाने और अगले अच्छी तरह से करने के लिए कदम ।
    7. सरणी में सभी एंटीबॉडी स्थानों के लिए चरण 2.1.6 दोहराएँ.
    8. 30 मिनट के बाद, छवि सरणी में सभी स्थानों स्वचालित माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए एकल अणुओं की पृष्ठभूमि का निर्धारण करने के लिए एक एंटीबॉडी स्थान से पहले कोशिकाओं को लोड करने के लिए बाध्य ।
  2. कक्षों के साथ पता करने वाली बूंदें लोड करना
    1. मशीन से सेल संस्कृति कुप्पी निकालें और trypsin/EDTA समाधान का उपयोग कर कोशिकाओं को अलग ।
      नोट: इस अध्ययन में, मानव बृहदांत्र कार्सिनोमा सेल लाइन होना इस्तेमाल किया और Dulbecco के संशोधित ईगल्स मध्यम (DMEM) 10% (v/वी) foetal गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक का उपयोग कर एक सह2 मशीन में संस्कृति ।
    2. यदि आवश्यक हो, फ्लोरोसेंट कोशिकाओं दाग ।
      1. ०.१२५ μg/एमएल डिटेक्शन एंटीबॉडी (एंटी p53 एंटीबॉडी (DO-1) Alexa ४८८ के साथ लेबल) में 10% FBS में एल-15 मीडिया के समाधान में कोशिकाओं reसस्पेंड । एक एकल सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए, एक ४० µm पिच सेल छलनी के माध्यम से सेल समाधान फिल्टर ।
    3. एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना और पतला या 25-400 × 103 कोशिकाओं के एक एकाग्रता के लिए सेल समाधान ध्यान केंद्रित/ यह सुनिश्चित करता है कि पर्याप्त रिक्ति के साथ कोशिकाओं तलछट आराम से microcapillary हेरफेर करने के लिए ।
    4. micromanipulator और microcapillary का उपयोग कर सेल जलाशय से पता बूंदों में एकल कोशिकाओं लोड ।
      नोट: गैर-अनुयाई कोशिकाओं को micropipette में थोक में लोड किया जा सकता है और एक के बाद एक पता बूंदों में तिरस्कृत । सतह अवरुद्ध उपचार के बावजूद, अनुयाई सेल लाइनों गैर विशेष रूप से शीशे microcapillary भीतरी दीवार के लिए छड़ी और खो जाएगा करते हैं ।
    5. निरीक्षण करने के लिए एक 10 × उद्देश्य का उपयोग करना, microinjector कक्ष जलाशय से microcapillary में एक एकल कोशिका महाप्राण करने के लिए उपयोग.
    6. एक इलेक्ट्रॉनिक जोड़तोड़ मंच का उपयोग कर या मैन्युअल जेड स्थिति नोट अगर micromanipulator चरण निर्देशांकों की दुकान.
    7. यह ऊपर की ओर का अनुवाद करके micropipette वापस लेने के लिए चिप की 1 मिमी ऊंचाई स्पष्ट । एक जॉयस्टिक के साथ मैन्युअल रूप से यह प्रदर्शन या स्वचालित रूप से एक इलेक्ट्रॉनिक जोड़तोड़ मंच के ' बेदखल ' सुविधा का उपयोग कर.
    8. एक पता लगाने की छोटी बूंद की है कि करने के लिए मंच निर्देशांक सेट स्वचालित माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर । ' इंजेक्षन ' यह संग्रहीत करने के लिए लौटने से micropipette (या नोट) z-स्थिति । एक इलेक्ट्रॉनिक जोड़ तोड़ मंच का उपयोग करते हुए स्वचालित रूप से एक जॉयस्टिक के साथ या स्वतः यह प्रदर्शन.
      नोट: microcapillary कैपिंग तेल पियर्स और पता की छोटी बूंद के जलीय भाग के भीतर स्थित हो जाएगा ।
    9. microinjector का उपयोग कर पता करने वाली छोटी बूंद में सेल वितरण । एक 10 nL पता करने वाली छोटी बूंद की मात्रा से कम 1% की वृद्धि होगी ।
    10. दोहराएँ 2.2.5-शेष पता करने वाली बूंदों प्रयोगात्मक नियंत्रण जहां पता करने के लिए एक सेल शामिल नहीं है के लिए कुछ मुफ्त छोड़ने के लिए 2.2.9 ।
      नोट: एक microcapillary और micromanipulator का उपयोग कर पता करने के लिए बूंदों में एकल कोशिकाओं को लोड करने के लिए एक सरल विकल्प 4% PBSA में पता लगाने एंटीबॉडी के समाधान के साथ चरण 1.2.8 में समाधान को प्रतिस्थापित करने के लिए है 10 के आदेश पर एक एकाग्रता में कोशिकाओं से युक्त 5 कक्ष/एमएल, 1 सेल/10 nL के समकक्ष । सिंगल सेल अधिभोग Poissonian और सेल एकाग्रता को अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी ।
  3. लाइसे कक्ष और छवि सरणी
    1. brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर बूंदों में छवि कोशिकाओं, किसी भी प्रतिदीप्ति इमेजिंग सहित.
      नोट: इमेजिंग लगभग 3 मिनट लेता है छवि ~ १०० एक स्वचालित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर बूंदों । एक ६० NA = १.४९ तेल-विसर्जन उद्देश्य के साथ इमेजिंग प्रदर्शन । कोई फ़िल्टर brightfield इमेजिंग के लिए आवश्यक हैं, जबकि मानक फ़िल्टर सेट प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाता है ।
    2. छवि एकल अणु TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर सरणी में सभी स्थानों ।
      नोट: सेटिंग्स में एक विशेष TIRF फ़िल्टर सेट के साथ चरण 2.3.1 के रूप में उपयोग किया जाता है । इन छवियों को बाद में 3 धारा में विश्लेषण किया जाएगा एकल अणुओं की पृष्ठभूमि का निर्धारण करने के लिए lysis से पहले प्रत्येक एंटीबॉडी जगह बंधे । एकल अणु कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि के लिए लगभग 5 मिनट लगते है ~ १०० स्पॉट ।
    3. एक पता करने वाली छोटी बूंद में एक सेल पर ध्यान केंद्रित । एक एकल 6 एनएस लेजर पल्स (तरंग दैर्ध्य १०६४ एनएम, पल्स ऊर्जा १४.१ ± ०.३ µJ प्रति पल्स) ध्यान केंद्रित करके पूरा ऑप्टिकल lysis प्राप्त सेल के स्थान के करीब ।
      नोट: लेजर पल्स एक विस्तार cavitation बुलबुला सेट करता है कि कैंची सेल और छोटी बूंद मात्रा में सेलुलर घटकों को मुक्त कर देता है । 4 , 31 लेजर प्रेरित lysis के कारण यांत्रिक प्रक्रियाओं कम पल्स ऊर्जा पर तेल पानी इंटरफ़ेस परेशान नहीं करते । ऑप्टिकल lysis आमतौर पर लाइसे १०० कोशिकाओं के लिए लगभग 20-30 मिनट लगते हैं । चर्चा अनुभाग में चर्चा के रूप में, ऑप्टिकल lysis सेटअप संभव नहीं है, तो एकल कक्ष लाइसे करने के लिए वैकल्पिक विधियों की एक संख्या हैं ।
    4. सभी सेल युक्त पता करने वाली बूंदों प्रयोगात्मक नियंत्रण के लिए जहां पता करने के लिए एक संयुक्त राष्ट्र लीजड ड सेल शामिल 5 मुक्त छोड़ने के लिए दोहराएँ ।
    5. उस समय को नोट करें जिस पर प्रत्येक कक्ष लीजड ड है ।
      नोट: ये समय चरण 3.1.9 में प्रत्येक स्थान के लिए व्यक्तिगत बाइंडिंग curves सही करने के लिए उपयोग किया जाएगा । अक्सर यह समय है जब पहली और आखिरी कोशिकाओं लीजड ड है और lysis घटनाओं के बीच एक पर्याप्त रूप से सुसंगत समय संभालने बाकी अनुमान नोट करने के लिए पर्याप्त है ।
    6. एकल अणु सभी धब्बे के TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर पहले 30 मिनट के लिए हर 10 मिनट तो एक आगे ६० मिनट के लिए हर 20 मिनट के अधिग्रहण । यदि केवल प्रोटीन की मात्रा में संतुलन में रुचि, कमरे के तापमान पर ९० मिनट के लिए चिप मशीन के बाद सभी स्थानों छवि ।
      नोट: समय संतुलन तक पहुंचने के लिए छोटी बूंद की मात्रा और परख में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के समानताएं पर निर्भर करेगा । TIRF माइक्रोस्कोपी पर एक लेज़र उत्तेजना स्रोत का उपयोग कर किया जाता है = ४८८ एनएम और १.५ मेगावाट बिजली के रूप में वापस एपर्चर एक ऑप्टिकल बिजली मीटर का उपयोग कर मापा । एकल अणु छवियों पर अधिग्रहण सेटिंग्स की स्थापना द्वारा प्राप्त कर रहे है EM-सीसीडी कैमरा ९०० ms अधिग्रहण समय, 16 बिट डिजिटलीकरण पर 1 मेगाहर्ट्ज readout दर और 10 के एक उंहें लाभ कारक । coverslip को सावधानी से हटाकर अलग से पुन: उपयोग किया जा सकता है ।

3. डेटा विश्लेषण

  1. एकल अणु गिनती (गैर भीड़भाड़ डिजिटल शासन/
    1. फिजी (या Matlab) का प्रयोग, किसी भी गैर भीड़भाड़ एंटीबॉडी स्थान के लिए, lysis (पृष्ठभूमि, BKD) से पहले हासिल की छवि लोड ।
      नोट: निम्न चरणों में कार्रवाइयाँ फिजी छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर सीधा किया जाता है । कोई उपयोगकर्ता मार्गदर्शिका निंन लिंक https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html पर मिल सकती है ।
    2. फिजी में, BKD छवि का चयन करें । "छवि" मेनू के अंतर्गत डुप्लिकेट BKD के लिए "डुप्लिकेट" का चयन करें । डुप्लिकेट छवि का चयन करें और "प्रक्रिया > फिल्टर" के तहत, "गाऊसी कलंक" का चयन करें और एक ५० पिक्सेल त्रिज्या निर्दिष्ट ।
    3. BKD छवि को समतल करें ताकि धुंधला BKD छवि द्वारा BKD छवि को विभाजित करके उत्तेजना प्रकाश स्रोत का प्रभावी समान तीव्रता वितरण किया जा सके, BKD_FLAT का उत्पादन किया जा सके ।
      1. के तहत "प्रक्रिया" का चयन करें "छवि कैलकुलेटर...", आपरेशन निर्दिष्ट "विभाजन", आवश्यक छवियों, और बक्से का चयन "नई विंडो बनाएं" और "३२-bit (फ्लोट) परिणाम."
    4. 1 से छवि में प्रत्येक पिक्सेल घटाना ("प्रक्रिया > गणित", चुनें "घटाना..." और 1 का मान निर्दिष्ट करें) । औसत पिक्सेल तीव्रता 0 होना चाहिए ।
      नोट: समतल और चपटा पृष्ठभूमि छवियों को आसानी से चेक किया जा सकता है क्योंकि सभी पिक्सेल का योग 0 होना चाहिए और कोई भी शेष ऑफ़सेट अधिक सरल रूप से क्षतिपूर्ति की जा सकती है ।
    5. BKD_FLAT छवि के 4 कोनों में से किसी में एक ५० पिक्सेल × ५० पिक्सेल क्षेत्र का चयन करें । पिक्सेल तीव्रता मानक विचलन (σ) का चयन करके "विश्लेषण" और "माप" को मापने ।
      नोट: चयन के सारांश आँकड़े एक परिणाम विंडो में प्रस्तुत किया जाएगा. यह बंद जगह पृष्ठभूमि निर्धारित करता है जहां एक अणुओं का एक उच्च घनत्व होने की संभावना नहीं है । मापा जा करने के लिए क्षेत्र मैन्युअल रूप से डिफ़ॉल्ट मेनू चयन उपकरण का उपयोग कर या मैक्रो कोड "makeRectangle (x, y, चौड़ाई, ऊँचाई)" चला कर चुना जा सकता है; यह एक आयताकार चयन बनाता है, जहाँ x और y तर्क शीर्ष बाएँ कोने के निर्देशांक (पिक्सेल में) होते हैं.
    6. छवि थ्रेशोल्ड 3σ और एक बाइनरी छवि SM_MASK बनाने के लिए सेट करें ।
      1. "छवि > समायोजित करें" के अंतर्गत, "थ्रेशोल्ड..." चुनें और निचले थ्रेशोल्ड स्तर को 3σ पर सेट करे.
        नोट: पिक्सेल जिसका मान थ्रेशोल्ड के नीचे है शूंय पर सेट है और सीमा से अधिक पिक्सेल 1 पर सेट हैं । सीमा विश्वास है जिसके साथ थ्रेसहोल्ड पिक्सल एक ही अणु से संबंधित निर्धारित करेगा ।
    7. में विभाजित छवि SM_MASK, पिक्सेल तीव्रता मान सेट करें किसी भी ऑब्जेक्ट के शून्य करने के लिए 4-9 पिक्सेल2 का एक आकार नहीं है और ०.५-1 का एक प्रचलन का चयन करके "विश्लेषण" और उसके बाद "विश्लेषण कणों" और आकार और प्रचलन निर्दिष्ट करें ।
      नोट: पिक्सेल आकार अंय fluorophores और माइक्रोस्कोप सेट अप के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है । कैमरा शोर के प्रकार के कारण एक पिक्सल इस दहलीज के ऊपर हो सकता है और एक अणु नहीं होने के बावजूद खारिज नहीं किया जा. पिक्सेल आकार मापदंड ऐसे पिक्सेल को सही रूप से छोड़ देगा । एकल अणुओं के आकार में आम तौर पर परिपत्र रहे हैं । 1 का एक परिपत्र मान एक परिपूर्ण चक्र इंगित करता है, जबकि एक मूल्य आ रहा है एक तेजी से लंबी आकार इंगित करता है । शेष वस्तुएँ एकल अणु होती हैं और इनकी गिनती की जा सकती है. एक मुखौटा के लिए मौके के क्षेत्र demarcate पर भेदभाव के लिए जगह और ऑफ स्पॉट गिनती प्रति फ्रेम सेट किया जा सकता है । यह बाद के समय में प्राप्त फ्रेम के लिए आसान है, जब वहां एक पर्याप्त संकेत पर-स्थान है जो तब पहले फ्रेम के लिए लागू किया जा सकता है ।
    8. एक ही गैर भीड़भाड़ एंटीबॉडी स्थान के लिए, लोड और दोहराएँ चरण 3.1.1-3.1.7 सभी छवि फ्रेम के लिए एक समय के रूप में कब्जा कर लिया-हल श्रृंखला पोस्ट lysis हासिल की । चरण -6 में नोट किया lysis बार का उपयोग करें । किसी बाइंडिंग curves को सही करने के लिए ।
  2. एकल अणु गिनती (भीड़भाड़/
    1. आदेश में एक ही अणु की औसत तीव्रता की गणना करने के लिए, आगे बढ़ने से पहले, 3.1.1-3.1.8 कदम दोहराएं ।
    2. एक छवि है जिससे गैर शूंय पिक्सेल मूल्यों एकल अणुओं के साथ जुड़े रहे है का उत्पादन करने के लिए छवियों BKD_FLAT और SM_MASK गुणा ।
      1. इस प्रदर्शन के लिए, "प्रक्रिया" मेनू के तहत, "छवि कैलकुलेटर..." का चयन करें, ऑपरेशन "गुणा" और छवियों की आवश्यकता निर्दिष्ट करें, और बक्से का चयन करें "नई विंडो बनाएं" और "३२-bit (फ्लोट) परिणाम."
    3. "विश्लेषण" और फिर "माप" का चयन करके सभी पिक्सेल तीव्रता मूल्यों का योग; चयन के सारांश आँकड़े एक परिणाम विंडो में प्रस्तुत किया जाएगा. एक अणु प्रति औसत तीव्रता की गणना करने के लिए कदम 3.1.8 के अनुसार एकल अणुओं गिना की संख्या से विभाजित ।
    4. किसी भी भीड़भाड़ एंटीबॉडी स्थान के लिए, छवि लोड पोस्ट lysis का अधिग्रहण और 3.1.2 और 3.1.3 कदम के अनुसार एक धुंधला पृष्ठभूमि छवि के साथ समतल ।
    5. 1 द्वारा चपटा छवि में प्रत्येक पिक्सेल घटाना ("प्रक्रिया > गणित", चुनें "घटाना..." और 1 का मान निर्दिष्ट करें)
    6. छवि के 4 कोनों में से किसी में ५० पिक्सेल × ५० पिक्सेल क्षेत्र का चयन करें और पिक्सेल तीव्रता मानक विचलन (σ) को मापने । विवरण के लिए चरण 3.1.5 देखें ।
    7. 3σ करने के लिए छवि थ्रेशोल्ड सेट करें और पिक्सेल तीव्रता मान 4 पिक्सेल2से कम आकार वाले किसी भी ऑब्जेक्ट की शूंय करने के लिए निर्धारित करके एक बाइनरी छवि मास्क बनाएं । इस प्रदर्शन के लिए, "विश्लेषण" मेनू के तहत, "विश्लेषण कणों" का चयन करें और आकार और प्रचलन निर्दिष्ट ।
    8. बाइनरी छवि मुखौटा द्वारा चपटा भीड़भाड़ एंटीबॉडी स्थान छवि गुणा ।
      1. इस प्रदर्शन के लिए, "प्रक्रिया" मेनू के तहत, "छवि कैलकुलेटर..." का चयन करें, ऑपरेशन "गुणा" और छवियों की आवश्यकता निर्दिष्ट करें, और बक्से का चयन करें "नई विंडो बनाएं" और "३२-bit (फ्लोट) परिणाम."
    9. "विश्लेषण" के बाद "माप" का चयन करके शेष पिक्सेल तीव्रता का योग; चयन के सारांश आँकड़े एक परिणाम विंडो में प्रस्तुत किया जाएगा.
    10. भीड़भाड़ वाले स्थान के लिए बाध्य एकल अणुओं की संख्या की गणना करने के लिए औसत एकल अणु तीव्रता के द्वारा पिक्सेल तनाव के योग को विभाजित करें ।
  3. पूर्ण ठहराव के लिए अंशांकन वक्र
    1. एक ज्ञात एकाग्रता रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के साथ नुकीला 4% PBSA समाधान में पता लगाने एंटीबॉडी के साथ 10 nL पता करने वाली बूंदों फार्म करने के लिए वर्गों 1 और 2 दोहराएँ.
    2. रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के ज्ञात एकाग्रता अलग करके 102-107 रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की एक एकाग्रता श्रृंखला का प्रदर्शन समाधान करने के लिए जोड़ा । यह सीधी एकल सेल डेटा औजार बनाने के लिए छोटी बूंद प्रति प्रोटीन की संख्या के मामले में काम करने के लिए सिफारिश की है ।
    3. कदम 3.3.2 में एकाग्रता श्रृंखला डेटा का प्रयोग करें किसी भी एक अणु बूंदें प्रति स्थान प्रति प्रोटीन बहुतायत के लिए और विस्तार प्रोटीन बहुतायत से प्रति एक सेल जांचना ।

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Representative Results

निरपेक्ष बेसल प्रोटीन p53 की प्रतिलिपि संख्या एक मानव बृहदांत्र कैंसर सेल लाइन में एकल सेल संकल्प के साथ निर्धारित किया गया था, कोशिकाओं हो । हम प्रदर्शन कैसे p53 अभिव्यक्ति परिमाण के कई आदेशों पर भिंन हो सकते है और सेल आकार और प्रोटीन की नकल संख्या के बीच एक कमजोर सकारात्मक संबंध दिखाने के भीतर आराम सेल जनसंख्या हो सकता है ।

जब जलीय बूंदों एंटीबॉडी स्थान स्थानों पर तिरस्कृत कर रहे हैं और तेल के साथ छाया में पता करने वाली छोटी बूंद Microarrays का गठन कर रहे हैं । यहां, बूंदों एक संवेदनशील p53 प्रोटीन परख समर्थन करते हैं । Coverslips एक संपर्क microarrayer और एक पिन का उपयोग कर एंटीबॉडी स्थानों पर कब्जा के साथ सरणी रहे हैं । विरोधी p53 कब्जा एंटीबॉडी एक वाणिज्यिक एलिसा परीक्षण किट से लिया जाता है । मुद्रण की स्थिति ऐसी है कि कब्जा धब्बे थे लगभग १०० µm व्यास में ६.२ ± ०.५ एक्स के एक अधिकतम कब्जा क्षमता के साथ 10 हाजिर प्रति5 प्रोटीन । ३२

coverslip के लिए बंधुआ एक अलग का उपयोग करने के लिए बूंदों की एक उच्च घनत्व के बाद से यह आसपास के एंटीबॉडी कब्जा स्थानों के लिए तेल के प्रसार की सीमा का गठन किया जा अनुमति देता है । एक अलग बूंदों के प्रत्येक कुआं में एक जलीय समाधान है, जो तो तेल के साथ छाया हुआ है वाष्पीकरण को रोकने (आंकड़ा 1a) के वितरण के द्वारा गठित कर रहे हैं । तेल की एक ंयूनतम राशि छोटी बूंद टोपी के लिए तिरस्कृत किया जा सकता है; हालांकि, यह एक राशि है जो एक अलग अच्छी तरह से ठीक तरह से भरता है कि तेल की सतह इमेजिंग के लिए फ्लैट है वितरण उपयोगी है । अलग या तो व्यावसायिक स्रोत या लेजर काटने एक्रिलिक शीट्स द्वारा बनाई गई हैं । सिलिकॉन अलग उपलब्ध है पूर्व में एक 4 x 6 सरणी (n = 24) में कटौती कुओं लेकिन एक 4 x 11 सरणी (n = ४४) एक बायोप्सी या बहु छेद चमड़े के पंच का उपयोग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । आंकड़ा 1b में लेजर कटौती अलग २.८९ मिमी, एक केंद्र के लिए केंद्र के लिए अलग से 3.9 मिमी और 0.5 मिमी की ऊंचाई के एक अधिकतम व्यास के साथ १०० षट्कोण कुओं की एक सरणी से पता चलता है । बूंदों को संग्रहित किया जा सकता है और समय की विस्तारित अवधि के लिए स्थिर रहना (3 महीने तक मनाया) ।

बूंदों मैंयुअल रूप से एक घर बनाया तंत्र है, जो एक गाढ़ा टयूबिंग नोक (चित्रा 1C) है, जो दो सिरिंज पंपों (आंकड़ा 1a) से जुड़ा है का उपयोग कर बनाया जाता है । गाढ़ा टयूबिंग नोजल एक से जुड़े सिलिका केशिका, जो जलीय चरण तिरस्कृत, तिरछी टयूबिंग, जो तेल चरण तिरस्कृत की एक छोटी लंबाई के माध्यम से खिलाया शामिल है । एक खुर्दबीन का प्रयोग, नोजल एक एंटीबॉडी स्थान और पंपों के लिए गठबंधन है पहले जलीय समाधान तुरंत वितरण होगा तेल (आंकड़ा 1E, 1-4 कदम) के बाद । एक बार ADM में सभी बूंदों का गठन कर रहे हैं, एक microinjector और micromanipulator (सामग्री की तालिका देखें) एक एकल सेल (चित्रा 1 d) के साथ प्रत्येक छोटी बूंद लोड करने के लिए उपयोग किया जाता है । micropipette कोशिकाओं के एक जलाशय से एक सेल पर कब्जा होगा, चिप पर कुओं में से एक में तिरस्कृत, एक छोटी बूंद को अच्छी तरह से अनुवाद किया और फिर तेल टोपी घुसना करने के लिए जलीय छोटी बूंद में सेल उद्धार (आंकड़ा 1 d, 5-8 कदम) ।

बूंदों के भीतर सभी स्थानों lysis करने से पहले imaged हैं और धब्बे (चित्रा 2a) के लिए गैर विशिष्ट बाध्यकारी की डिग्री का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । एकल कोशिकाओं को पूरी तरह से लीजड ड (नाभिक सहित) ऑप्टिकल तरीकों का उपयोग कर रहे हैं । 31 ऑप्टिकल lysis कोशिकाओं को बाधित करने के लिए एक विस्तार लेजर पल्स प्रेरित cavitation बुलबुला की कतरनी बल पर निर्भर करता है । ध्यान दिया जाना चाहिए कि तेल-पानी अंतरफलक पल्स ऊर्जा सीमित और तेल से दूर कोशिकाओं को जमा करने से इन प्रक्रियाओं द्वारा परेशान नहीं किया जा/ एक बार कोशिकाओं लीजड ड हैं, सरणी TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा एक स्वचालित माइक्रोस्कोप का उपयोग करके imaged है; फ्रेम 30 मिनट के लिए हर 10 मिनट और फिर एक आगे ६० मिनट के लिए हर 20 मिनट का अधिग्रहण कर रहे हैं । इस तरह के एंटीबॉडी संबध, प्रोटीन प्रसार और छोटी बूंद मात्रा के रूप में शर्तों, ऐसी है कि बाध्यकारी संतुलन ९० मिन अधिग्रहण के भीतर पहुंच गया है । चित्र 2aमें एक विशिष्ट एकल कक्ष pulldown दिखाया गया है ।

छवि विश्लेषण की प्रक्रिया एकल अणु गिनती निर्धारित करने के लिए योजनाबद्ध रूप से चित्रा बीमें चित्रित है । धब्बे की छवियां या तो गैर भीड़भाड़, जहां लक्ष्य प्रोटीन एकाग्रता ऐसी है कि एक अणु अच्छी तरह से अलग है और आसानी से प्रतिष्ठित हैं, या भीड़भाड़, जहां लक्ष्य प्रोटीन एकाग्रता उच्च और एकल अणु छवियों है माना जाता है ओवरलैप और व्यक्तिगत रूप से अलग नहीं रह रहे हैं । TIRF उत्तेजना प्रोफ़ाइल असमान है के बाद से, यह महत्वपूर्ण है कि सभी अधिग्रहीत छवियों फ्लैट क्षेत्र सही हो । एक गाऊसी कलंक एक गैर भीड़भाड़ फ्रेम, जो विस्तार और शोर को हटाने और TIRF उत्तेजना प्रोफ़ाइल की औसत प्रोफ़ाइल के साथ एक छवि का उत्पादन करने के लिए एक चिकनी फिल्टर के रूप में कार्य करता है के लिए लागू किया जाता है । इस प्रोसेस्ड इमेज का इस्तेमाल मूल इमेज को ' समतल ' करने के लिए किया जा सकता है । गैर भीड़भाड़ छवियों के लिए, जहां भी संतुलन में, वहां कुछ एकल अणु हैं, एक फ्रेम खुद को सही करने के लिए संसाधित किया जा सकता है । यह दृष्टिकोण एक भीड़भाड़ जगह है, जहां एक अणुओं घनी जगह पर कब्जा करने के लिए लागू नहीं है और एक पृष्ठभूमि छवि समतल के लिए अधिग्रहीत किया जा करने की आवश्यकता है । समतल फ़्रेम तो तीव्रता के साथ पिक्सल के लिए सीमा से कम से 3 बार पृष्ठभूमि मानक विचलन प्लस इसका मतलब मान रहे हैं । एकल अणु तो स्वचालित रूप से 4-9 संकुल पिक्सेल की पहचान के साथ ०.५ से अधिक प्रचलन के साथ पता चला है के कण विश्लेषण सुविधाओं का उपयोग कर फिजी । परिणामों से, एक ही अणु की औसत तीव्रता की गणना की जा सकती है । यह एक एक अणु की ज्ञात औसत तीव्रता द्वारा एंटीबॉडी स्थान कुल तीव्रता को विभाजित करके एक भीड़भाड़ स्थल पर एकल अणुओं की संख्या निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इन चरणों फिजी के स्क्रिप्ट संपादक का उपयोग कर स्वचालित हो सकता है ।

एक एकाग्रता श्रृंखला रिकॉमबिनेंट p53 प्रोटीन के ज्ञात सांद्रता (चित्रा 3ए) के साथ बूंदों में संतुलन में एक अणु गिनती निर्धारित करने के लिए किया जाता है । इस तरह की स्थिति है कि कब्जा एंटीबॉडी स्पॉट कुल लक्ष्य प्रोटीन का एक अंश पर कब्जा, रैखिकता के क्षेत्र में लगभग 1% (2 बूंदेंप्रति 108 प्रोटीन के लिए = ०.९९ आर) । बूंदों में गैर-विशिष्ट बाइंडिंग का स्तर १८७ ± ६० अणु है । एकल सेल pulldowns के परिणाम तो प्रति कोशिका निरपेक्ष प्रोटीन प्रति संख्या के वितरण को प्राप्त करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है । चित्र बी एक ADMs का उपयोग कर कोशिकाओं में निरपेक्ष p53 प्रोटीन अभिव्यक्ति के वितरण से पता चलता है । P53 कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति है, जो आनुवंशिक रूप से समान या बहुत समान माना जा सकता है, एक stochastic प्रक्रिया है । वितरण गामा की तरह असममित और एक लंबी पूंछ के साथ unimodal है । नतीजतन, मतलब (१.८२ × 106 प्रोटीन) मोडल प्रोटीन बहुतायत अनुमान लगा सकते है (बिन 0-५.० × 105 प्रोटीन), और मानक विचलन (१.८८ × 106 प्रोटीन) पूरी तरह से वितरण की सुविधाओं पर कब्जा नहीं है । इस वितरण एकल कोशिका माप के महत्व का एक उदाहरण के लिए सेल जनसंख्या में प्रोटीन अभिव्यक्ति के विविधता पर कब्जा है, जो अंयथा जब थोक माप के साथ औसत खो जाएगा । प्रत्येक कक्ष के लिए अतिरिक्त पैरामीटर मापा जा सकता है । यहाँ, कोशिका मात्रा प्रत्येक कोशिका व्यास को मापने से पहले छोटी बूंद में lysis से अनुमान लगाया गया है और यह मानते हुए कोशिका लगभग गोलाकार है. चित्रा 3 सी सेल आकार के एक समारोह के रूप में एकल हो कोशिकाओं में p53 निरपेक्ष प्रोटीन की प्रतिलिपि संख्या की तुलना से पता चलता है । एक उच्च कुल p53 प्रतिलिपि संख्या है करने के लिए बड़े कक्षों के लिए एक प्रवृत्ति है । दिलचस्प है, यह वितरण से संभव है कि वहां p53 अभिव्यक्ति और कोशिका के आकार के बीच समंवय है क्योंकि वहां के लिए एक ंयूनतम p53 प्रति कक्ष की प्रतिलिपि संख्या प्रतीत होता है; हालांकि, तंत्र जिसके द्वारा यह उठता है आगे की जांच की आवश्यकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: पता छोटी बूंद Microarray तंत्र और चिप । (क) बूंदें मैंयुअल रूप से एक 3-अक्ष जोड़तोड़ का उपयोग करने के लिए एक गाढ़ा टयूबिंग नोक अनुवाद तिरस्कृत कर रहे हैं । जलीय छोटी बूंद एक एंटीबॉडी में विशिष्ट स्थानों पर तिरस्कृत किया जाता है microarray के बाद तेल कैपिंग । (ख) अलग से तेल के प्रसार को सीमित करके सब्सट्रेट पर पता करने वाली बूंदों का एक उच्च घनत्व सक्षम बनाता है । अलग लेजर ०.५ mm एक्रिलिक शीट्स काटने द्वारा उत्पादित किया जा सकता है । बूंदों के दृश्य सहायता करने के लिए, ब्लू खाद्य रंग डाई एक में तंत्र का उपयोग कर जमा किया जाता है । स्केल बार 10 मिमी, इनसेट स्केल बार 1 मिमी. (ग) गाढ़ा टयूबिंग नोजल प्रोटोकॉल के चरण १.२ में के रूप में इकट्ठे होने के लिए पता करने वाली बूंदों का गठन करने की अनुमति देता है । (घ) एक microinjector और micromanipulator कोशिकाओं अलग पता करने के लिए प्रोटोकॉल के चरण १.३ में के रूप में तैयार की बूंदों में अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है । (ङ) पता करने वाली बूंदें बनाने और लोड करने की प्रक्रिया में प्रमुख कदम दिखाया गया है । एक एंटीबॉडी स्थान एक इनकोडिंग अनुवाद चरण का उपयोग कर स्थित है (1) जहां केशिका टयूबिंग की नोक गठबंधन (2) और जलीय (3) तो तेल (4) घटकों तिरस्कृत कर रहे हैं । एकल कोशिकाओं को एक ग्लास microcapillary (5-8) का उपयोग कर लोड किया जा सकता है, जो एक बार जलीय छोटी बूंद (7) और एक सेल (8) जमा कर सकते हैं । स्केल बार्स १०० µm । में लाल तीर (5) और (8) अलग एकल सेल पर प्रकाश डाला गया और (8) के इनसेट उच्च आवर्धन (स्केल बार 10 µm) में अलग एकल सेल से पता चलता है । इस आंकड़े के भाग के संदर्भ12से संशोधित किया गया है, रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी की अनुमति से reproduced । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: छवि विश्लेषण चरण । सरणी में प्रत्येक स्थान (p53 परख के लिए ९० मिनट) तक पहुंच जाता है जब तक संतुलन (टीEq) तक TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged है । संतुलन समय समाधान में टी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लक्षित प्रोटीन के लिए ' एंटीबॉडी जोड़ी के समानताएं पर निर्भर करता है । a) उदाहरण एकल अणु TIRF पृष्ठभूमि के माइक्रोस्कोपी छवियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक उदाहरण एकल सेल pulldown (स्केल सलाखों 20 माइक्रोन). इनसेट छवि कुछ एकल लाल तीर (स्केल बार 5 माइक्रोन) द्वारा प्रकाश डाला अणुओं के साथ पृष्ठभूमि छवि का एक बढ़ाया भाग से पता चलता है । ख) प्रोटोकॉल के चरण 3 में विस्तृत छवि विश्लेषण की रूपरेखा । संक्षेप में, वहां दो व्यापक शासन जहां धब्बे गैर माना जा सकता है भीड़भाड़, एक अणु विरल हैं, और भीड़भाड़, जहां एकल अणुओं का घनत्व है कि ऐसी महत्वपूर्ण है ओवरलैप और नहीं रह सकता है अकेले पहचाने जाते हैं । छवि विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण कदम उत्तेजना लेजर के गैर-समान तीव्रता प्रोफ़ाइल के प्रभाव को दूर करने के लिए समतल क्षेत्र है । डिजिटल गिनती शासन में, एकल अणुओं सीधे उनकी तीव्रता और आकार मापदंडों के आधार पर पहचाने जाते हैं । एनालॉग गिनती शासन में, एकल अणुओं की संख्या संतुलन पर कुल हाजिर तीव्रता को मापने और एक एकल अणु है, जो डिजिटल गिनती शासन से जाना जाता है की औसत तीव्रता से विभाजित द्वारा गणना की है । ImageJ में डेटा का विश्लेषण करने के लिए चरण सीधे स्वचालित हो सकते हैं । छवियों के नीचे पैनल अनुक्रम एंटीबॉडी कैद स्थान पर लक्ष्य प्रोटीन के संचय से पता चलता है; शुरू में, स्पॉट भीड़भाड़ (टी1) नहीं कर रहे हैं, जबकि लक्ष्य प्रोटीन एंटीबॉडी स्थान पर जमा, एकल अणुओं तेजी से भीड़भाड़ हो सकता है (टीएन) जब तक संतुलन (टीeq) तक पहुँच जाता है. ध्यान दें कि चाहे एक जगह गैर भीड़भाड़ रहता है या भीड़भाड़ हो जाता है कारकों की एक संख्या पर निर्भर करता है, विशेष रूप से विश्लेषण मात्रा में लक्ष्य प्रोटीन की बहुतायत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: एकल कक्ष डेटा । निरपेक्ष ठहराव एक अंशांकन वक्र का उपयोग कर हासिल की है । (क) एकल अणु गणना रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की ज्ञात सांद्रता का उपयोग किया जाता है. यह एक अंशांकन वक्र है और विश्लेषण मात्रा और इसलिए एक सेल कॉपी संख्या में लक्ष्य प्रोटीन की संख्या के लिए प्रत्येक स्थान पर गिना एक अणु को बदलने के लिए प्रयोग किया जाता है । क्षैतिज लाल डैश्ड रेखा १८७ ± ६० अणुओं के गैर-विशिष्ट बाइंडिंग के स्तर को इंगित करती है । त्रुटि पट्टियां 3 प्रायोगिक रन के माध्य का एक मानक विचलन हैं । धराशायी लाइन प्रोटीन का पता लगाने १००% का प्रतिनिधित्व करता है । (ख) एकल सेल बेसल p53 प्रोटीन अभिव्यक्ति में कैंसर की कोशिकाओं का वितरण एक लंबी पूंछ गामा की तरह वितरण दिखा रहा है जहां कुछ कोशिकाओं में p53 प्रोटीन अभिव्यक्ति मोडल मूल्य से काफी अधिक है दिखाया गया है । (ग) p53 प्रोटीन की तितर बितर भूखंड सेल के आकार के एक समारोह के रूप में कैसे प्रोटीन अभिव्यक्ति बदलता दिखा कोशिका मात्रा के एक समारोह के रूप में सेल प्रति संख्या की प्रतिलिपि । इस आंकड़े के भाग 12 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ reproduced । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

पता करने योग्य छोटी बूंद Microarrays मात्रात्मक एक एकल कक्ष के भीतर प्रोटीन की निरपेक्ष प्रतिलिपि संख्या का निर्धारण करने के लिए एक संवेदनशील और एक्सटेंसिबल विधि हैं ।

गैर-विशिष्ट बाइंडिंग (NSB) के स्तर को सीमित करना संभव के रूप में पता लगाने की कम सीमा के रूप में प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण है । प्रोटीन और अंय जैव रासायनिक प्रजातियों गैर विशेष रूप से बूंदों के भीतर मौजूद इंटरफेस के एक नंबर के लिए बाध्य कर सकते है-coverslip सतह, एंटीबॉडी स्पॉट और तेल/ प्रोटीन इंटरफेस या तेल में ही विभाजन से खो दिया जा सकता है । हमने दिखाया है कि 4% जलीय छोटी बूंद में मौजूद BSA प्रोटीन के NSB प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग सीमित करने में सक्षम है । वैकल्पिक प्रोटीन लक्ष्य और उंहें पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी वैकल्पिक दृष्टिकोण को रोकने की आवश्यकता हो सकती है, ऐसे गैर ईओण डिटर्जेंट या संगत सर्फेक्टेंट । Fluorinated तेलों भी कैपिंग तेल के रूप में सेवारत में उनकी उपयुक्तता के लिए परीक्षण किया जा सकता है । ऐसे मामलों में, इस तरह के महत्वपूर्ण micelle एकाग्रता और कैपिंग तेल के घनत्व के रूप में अतिरिक्त विचार किया जाना चाहिए ।

unधोये मुद्रण बफर, जो प्रत्येक स्थान पर रहता है के बाद स्थिति एड्स संरेखण में सरणी । जब शुरू में बूंदें जमा, देखभाल के लिए खरोंच या गाढ़ा टयूबिंग नोक की नोक से एंटीबॉडी स्थान को नुकसान नहीं लिया जाना चाहिए । आगे विधि विकसित करने में, एक फ्लोरोसेंट डाई एंटीबॉडी प्रिंटिंग बफर जो कैप्चर एंटीबॉडी के अलावा मैटीरियल हो जाता है में मैगनीज किया जा सकता है । यह धोने और अवरुद्ध कदम के लिए अनुमति देने के लिए सरणी छोटी बूंद से पहले किया जाएगा; हालांकि, इस तरह के एक कदम जरूरी नहीं होगा अगर सरणी कि ऐसी inkjet मुद्रण तरीकों के रूप में छोटी बूंद की स्वचालित तरीकों का उपयोग कर ।

वाणिज्यिक स्रोत coverslips की सतह पर जो बूंदों का गठन कर रहे है एक हाइड्रोफिलिक बहुलक के साथ लेपित है और जलीय बूंदों उन पर 10 nL की एक मात्रा के साथ उत्पादित ७५१ ± ४२ mm का व्यास है । वहां कितनी जमा छोटी बूंदें सतह गीला करना चाहिए या एक ंयूनतम मोटाई नीचे के बाद से कैपिंग तेल के वजन के कारण फैलता है के लिए एक सीमा है TIRF उत्तेजना लेजर से ऑप्टिकल स्कैटर वृद्धि हुई है । तितर बितर पृष्ठभूमि के औसत स्तर बढ़ जाती है और जब एकल अणुओं का पता लगाने के संकेत डूब सकते हैं । एंटीबॉडी स्थान भी उत्तेजना लेजर प्रकाश आंशिक रूप से या पूरी तरह से जलीय छोटी बूंद के बाहर एक क्षेत्र हड़ताल कर सकते है के बाद से छोटी बूंद किनारे से दूर स्थित होना चाहिए । महत्वपूर्ण कोण हालत अब ग्लास-पानी इंटरफेस के विरोध के रूप में कांच तेल इंटरफेस हड़ताली प्रकाश के लिए नहीं मिले होंगे ।

मात्रात्मक प्रोटीन की प्रचुरता निर्धारित करने के लिए एक जगह से बंधे अणुओं की संख्या छवि विश्लेषण के माध्यम से निर्धारित किया जाना चाहिए । एक अणु गिनती से समाधान में प्रोटीन की कुल राशि का निर्धारण करने के लिए एक अंशांकन वक्र की आवश्यकता है और तकनीक बिल्कुल मात्रात्मक होने के लिए सक्षम बनाता है ।

photobleaching को कम करने के लिए, धब्बे लगातार imaged नहीं कर रहे है और TIRF उत्तेजना लेजर स्रोत शक्ति को कम कर रहे हैं । प्रस्तुत के रूप में प्रोटोकॉल photostable fluorophores के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है जैसे Alexa Fluor रंजक । वैकल्पिक fluorophores इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन photobleaching मूल्यांकन किया जाना चाहिए और इमेजिंग प्रोटोकॉल यदि आवश्यक हो तो अनुकूलित । फ्रेम प्रति एक अणु की कुल संख्या समय के खिलाफ की साजिश रची जा सकता है बाध्यकारी वक्र हालांकि यह निश्चित रूप से आवश्यक नहीं है अगर बाध्यकारी कैनेटीक्स और इमेजिंग संतुलन में एक भी फ्रेम नहीं कर रहे है पर्याप्त होगा ।

हालांकि वहां दो उच्च संबंध एंटीबॉडी की एक आवश्यकता है, एक अति संवेदनशील और अत्यधिक विशिष्ट परख, एक सेल स्तर पर माप के लिए महत्वपूर्ण में यह परिणाम है । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया p53 एंटीबॉडी अच्छी तरह से एकल कोशिकाओं से मुक्त p53 का पता लगाने में अनुकूलित कर रहे हैं. लक्ष्य प्रोटीन एंटीबॉडी के चयन के द्वारा निर्धारित किया जाता है और तरीकों की एक संख्या में संशोधित हो सकता है: 1, दोनों को पकड़ने और जांच एंटीबॉडी वैकल्पिक लक्ष्य बाँध करने के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है; 2, पता लगाने एंटीबॉडी प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत या पोस्ट अनुवाद करने के लिए प्रोटीन पर कब्जा एंटीबॉडी करने के लिए बाध्य संशोधनों को प्रतिस्थापित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए कब्जा कर लिया p53 की फास्फारिलीकरण स्थिति निर्धारित; 3, मल्टीप्लेक्स परख बंद निकटता में एकाधिक कैप्चर एंटीबॉडी धब्बे मुद्रण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है-एक 3 × 3 स्थान सरणी मुद्रण 10nL बूंदों के भीतर संभव है । बेशक, लक्ष्य प्रोटीन के किसी भी परिवर्तन के लिए एंटीबॉडी स्क्रीन, नियंत्रण और अनुकूलन के एक नंबर शुरू किया जाना चाहिए ।

lysing एकल कक्षों के लिए कई विधियों की रिपोर्ट की गई है । ३३ ऑप्टिकल lysis कोशिकाओं की सामग्री को बदलने और प्रोटीन और उनके परिसरों की अखंडता को बनाए रखने के बिना तेजी से लाइसे व्यक्तिगत कोशिकाओं के लिए एक रासायनिक मुक्त दृष्टिकोण है. रासायनिक lysis डिटर्जेंट का उपयोग कर जब खनिज तेल का उपयोग कर बूंदों की अखंडता के लिए एक समस्या बन गया है और अणुओं के बीच बातचीत के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । ३४ हालांकि, परख के लिए जहां रासायनिक lysis संगत है यह आकर्षक दृष्टिकोण के बाद से यह ऐसे पराबैंगनीकिरण या micropatterned इलेक्ट्रोड के रूप में उपकरणों पर निर्भर नहीं है । ३५

बूंदें वैकल्पिक एकल कक्ष विधियों के साथ तुलनीय प्रदर्शन दिखाती हैं । सुझाव p53 एंटीबॉडी का उपयोग कर बूंदों की वर्तमान पीढ़ी में, NSB के स्तर पर हाजिर प्रति १८७ ± ६० अणुओं है । एकल अणु गणना मजबूत रैखिकता का प्रदर्शन (आर2 = ०.९९) क्षेत्र में फैले 105 –छोटी बूंद प्रति 108 रिकॉमबिनेंट p53 प्रोटीन । यह सुझाव है कि जबकि प्रोटीन के निचले स्तर कोशिकाओं में पता लगाया जा सकता है, वहां 105 p53 प्रोटीन के quantitation की एक सीमा है; यह ९०१ ± ८३ के धब्बे पर एक एकल अणु गिनती करने के लिए मेल खाती है । यह मुख्य रूप से बूंदों की मात्रा और अंतरफलक के लिए सोखना द्वारा सीमित है । p53 परख के प्रदर्शन ऐसी है कि जब एक 10 nL मात्रा में प्रदर्शन कुल लक्ष्य प्रोटीन का केवल १.१ ± ०.२% समाधान से कब्जा कर लिया है; यह ८५ ± 9% करने के लिए बढ़ जाती है जब विश्लेषण मात्रा को कम करने के लिए ०.२ nL. ३६ 1nL नीचे करने के लिए बूंदों की मात्रा को कम करने और सोखना को कम करने से, वहाँ निर्दिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर सेल प्रति < 50 प्रोटीन के लिए खोज की सीमा में सुधार लाने में p53 करने के लिए संभावित है. इसलिए, पता करने वाली बूंदों एकल कोशिकाओं से बहुत कम बहुतायत प्रोटीन को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए क्षमता है ।

आसानी से penetrable तेल कैप द्वारा वहन की गई बूंदों की पता कक्ष विश्लेषण वॉल्यूम को क्रमिक रूप से चुनौती देने के लिए अनुमति देता है । एक micropipette का उपयोग 10-20 pL, जो काफी मात्रा में वृद्धि नहीं करता है की एक प्लग में प्रत्येक छोटी बूंद में कोशिकाओं की एक वांछित संख्या के इंजेक्शन सक्षम बनाता है । १०० कुओं के साथ चित्र 1b में दिखाया चिप के लिए, बूंदों के रूप में और उंहें एकल कोशिकाओं के साथ लोड आमतौर पर लेता है 75-90 min. loading कोशिकाओं को भी micropipette के बजाय गाढ़ा टयूबिंग नोक का उपयोग कर छोटी बूंद को संबोधित करके प्राप्त किया जा सकता है या एक का उपयोग जब शुरू में बूंदों के गठन कोशिकाओं से युक्त समाधान । बाद प्रोटोकॉल में कदम की संख्या सीमित में उपयोगी होगा, लेकिन दोनों ही मामलों में, छोटी बूंद प्रति अधिभोग एक Poissonian वितरण का पालन करेंगे । यह चिप प्रति एकल सेल डेटा के अनुपात को सीमित करेगा; हालांकि, शूंय या एकाधिक कक्षों वाली बूंदें नियंत्रणों के रूप में कार्य करती हैं । बूंदों का पता करने के लिए गाढ़ा नोजल का उपयोग करने में एक अतिरिक्त सीमा छोटी बूंद मात्रा 10nL वेतन वृद्धि में वृद्धि होगी है । इस के ऊपर सुझाव संशोधनों के साथ सुधार किया जा सकता है । पर चिप छोटी बूंद microfluidics उच्च आवृत्ति पर बूंदों का उत्पादन करने में सक्षम है और क्षमता है स्वचालित रूप से ADMs के साथ संयुक्त करने के लिए उत्पादन और बूंदों में हेरफेर और क्रमिक उंहें एक planar सरणी में जमा । यह निश्चित रूप से ADMs के उत्पादन में सीमाओं को दूर करते हुए भी बूंदों के एकल अणु readout को सक्षम करेगा ।

प्रत्येक व्यक्ति छोटी बूंद को संबोधित करने की क्षमता संभव का उपयोग करता है की एक सीमा है । हमने क्रमिक रूप से एकल कक्षों को लोड करने की क्षमता प्रदर्शित की है । यह भी unbounded सेलुलर सामग्री पोस्ट lysis और विश्लेषण के लिए पिपेट द्वारा अंय तरीकों का उपयोग कर के बाद विश्लेषण हटाने की अनुमति देता है । अनुवर्ती विश्लेषण के उदाहरणों में मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर या मास-स्पेक्ट्रोमेट्री शामिल होता है ।

एक सेल प्रोटीन विश्लेषण के लिए एक मात्रात्मक दृष्टिकोण रखना चाहते प्रयोगशालाओं के लिए मौजूदा अड़चनों में से एक उच्च तकनीकी बाधा और विशेष उपकरणों के लिए की जरूरत है । ADMs के साथ, लघुकृत, उच्च संवेदनशीलता विश्लेषण के लिए स्वच्छ कमरे की सुविधा के लिए आवश्यकता के बिना प्राप्त किया जा सकता है microfluidic लैब बनाने के लिए एक चिप उपकरणों पर । प्रयोग चिप के डिजाइन और उनकी मात्रा और स्थिति के द्वारा सीमित नहीं है नए स्वामी गढ़े के लिए आवश्यकता के बिना बदल सकता है । निश्चित रूप से, वहां तकनीक को सरल बनाने में सुधार के लिए गुंजाइश है और एक सेल विश्लेषण के लिए प्रवेश के लिए बस एक microarrayer के लिए बाधा कम, दोनों एंटीबॉडी और छोटी बूंद microarrays मुद्रित करने के लिए, और एक प्रतिदीप्ति microplate पाठक, छवि के लिए ।

एकल कोशिका विश्लेषण के नैदानिक अनुप्रयोगों के एक नंबर, विशेष रूप से कैंसर के उपचार में उभर रहे हैं । ट्यूमर विविधता प्रभावी कीमोथेरेपी के लिए एक प्रमुख चुनौती है । ट्यूमर के विकास में, उत्परिवर्तनों बढ़ती आवृत्ति और विविधता के साथ पैदा रूपात्मक में परिणाम कर सकते हैं, आनुवंशिक, और proteomic परिवर्तनशीलता । सिंगल सेल विश्लेषण एक ट्यूमर के भीतर सेलुलर विविधता को हल करने और बेहतर समझने और दवा प्रतिरोध और गाइड थेरेपी की भविष्यवाणी करने में मदद करने के लिए एक मंच प्रदान करने में सक्षम है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

ASR डिज़ाइन किए गए प्रयोग, विकसित प्रोटोकॉल और विश्लेषण डेटा । एससी और पी एस सेल आकार प्रयोगों प्रदर्शन किया । ASR और OC पांडुलिपि लिखा था । लेखकों को आभारी करने के लिए उपकरणों का उपयोग प्रदान करने के लिए प्रो डेविड आर Klug के समर्थन को स्वीकार करना चाहता हूं । लेखकों को निर्माण और प्रोटोटाइप सुविधाओं के लिए उपयोग के लिए इंपीरियल कॉलेज उंनत Hackspace धंयवाद करना चाहता हूं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Life Technologies 10010015
DMEM high glucose Sigma D6429
Foetal Bovine Serum (FBS) Biochrom S0115
cell culture flasks Corning SIAL0639
Trypsin/EDTA Biochrom L2153
Name Company Catalog Number Comments
Microarray
Microcontact Arrayer DigiLab, UK OmniGrid Micro
Microcontact pin ArrayIt, USA 946MP2
Coverslips (Nexterion) Schott, Europe 1098523 Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17
p53 capture antibody Enzo ADI-960-070
p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled Santa Cruz sc-126 stock concentration 200μg/mL
Saline-sodium citrate buffer Gibco 15557-044
Betaine Sigma 61962
Sodium dodecyl sulphate Sigma L3771
384 well plate (low volume) Sigma CLS4511
Nitrogen gas cylinder BOC Industrial grade, oxygen-free
Name Company Catalog Number Comments
Droplets
Micromanipulator Eppendorf Patchman NP2
Manual Microinjector Eppendorf CellTram Vario
Micropipette Origio, Denmark MBB-FP-L-0
Syringe pumps KD Scientific KDS-210
100 μL syringe Hamilton 81020 Gas tight, PTFE Luer lock
1 mL syringe Hamilton 81327 Gas tight, PTFE Luer lock
Silicone isolator Grace Bio-Labs JTR24R-A-0.5 6x4 well silicone isolator with adhesive
Laser cutter VersaLASE VLS2.30 CO2 Laser 3W for laser cutting of custom isolators
1mm thick acrylic sheet Weatherall-UK Clarex Precision Sheet 001 for laser cutting of custom isolators
Adhesive sheet 3M used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips
Super glue Loctite LOCPFG3T
150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing IDEX FS-115
1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing IDEX 1503
0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing Kinesis 008T16-100
1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing IDEX 1673
Bovine Serum Albumen (BSA) Fisher Scientific BP9700100
Mineral oil Sigma M5904
Ultra-pure water Millipore, Germany MilliQ
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy & Optics
TIRF microscope with encoded XY stage Nikon, Japan Nikon Ti-E
EM-CCD Andor Technologies, Ireland IXON DU-897E
Laser excitation source Vortran, USA Stradus 488-50
Optical lysis laser source Continuum, USA Surelite SLI-10
Microscope filter cube for TIRF Chroma, USA z488bp
Microscope filter cube for Optical Lysis Laser 2000, UK LPD01-532R-25
Name Company Catalog Number Comments
Software
Fiji Open Source Image analysis software
Matlab Mathworks version 7.14 or higher Image analysis software

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References

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Chatzimichail, S., Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays. J. Vis. Exp. (137), e56110, doi:10.3791/56110 (2018).

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