Summary
ひと脳脊髄液 (CSF) の内因性ペプチドの質量分析法である. します。分子量カットオフろ過、クロマトグラフィーによる事前分別、質量分析、ペプチドの同定戦略の後の組み合わせを採用し、約 10 倍に比べて知られている CSF ペプチドームを展開することが可能だった先行研究。
Abstract
このプロトコルでは、人間の脳脊髄液 (CSF) の内因性ペプチドを識別する手法について説明します。この目的のため分子量カットオフ (MWCO) ろ過に基づく開発済み、質量分析は、オフラインの高 pH の逆相高速液体クロマトグラフィー事前分別ステップと結合されました。
CSF への分泌は、中枢神経系の細胞に流す分子の除去のための主要な経路です。したがって、中枢神経系の多くのプロセスは、CSF、貴重な診断液、それはレンダリングに反映されます。CSF は、濃度範囲 8-9 桁の蛋白質を含んでいる、複雑な組成を持ちます。タンパク質以外にも先行研究はまた内因性ペプチドの大規模な数の存在を示しています。蛋白質より少なく広く研究、一方、これらのバイオ マーカーとして潜在的な利益可能性がありますも保持します。
内因性ペプチド MWCO のろ過により CSF 蛋白質含量から引き離されてしまいます。サンプルのタンパク質含有量の大半を外して研究サンプル ボリュームとそれによりまた内因性ペプチドの総量を増やすことが可能です。濾過ペプチド混合物の複雑さは、逆相液体クロマトグラフィー質量分析の前にアルカリの ph (RP) 高速液体クロマトグラフィー事前分別ステップを含むで修正されました。分別が結合された分析時間消費は、12 に 60 分画を集めたシンプルな連結方式で、まだほとんど共溶出を避けながらそれにより減る。
3 つの異なるペプチド ・ タンパク質同定ソフトウェア プログラムを使用して、その後結果を組み合わせることによって自動化されたペプチッド同定を行った。別のプログラムは 3 つの間重複 id の 15% 未満に匹敵するのではなく、相補的な.
Introduction
現在、神経変性疾患には、脳脊髄液 (CSF) のバイオ マーカーに研究変形させています。アルツハイマー病、以上 6000 万に影響を与える最も一般的な神経変性疾患の人々 世界中1,2, ペプチド アミロイド ・ ベータ蛋白タウの微小管安定化から成るバイオ マーカーの三重項とリン酸化タウ フォーム、高い感度と特異性、病気を検出することができます診断研究条件3に含まれています。パーキンソン病や多発性硬化症などの他の神経変性疾患におけるプロテオーム研究はいくつかは、現在臨床研究4,5 の評価中、数多くのバイオ マーカー候補を識別しました。、6。
CSF にはタンパク質と一緒に内因性ペプチド7,8,9,10、11,12の豊富さも含まれています。多くの脳由来蛋白質の開裂製品を構成する、これらのペプチドはまた疾患バイオ マーカーの可能性のある重要な源を表します。試料調製及び LC-MS 分析 (簡単なプロトコル スキームに含まれている図 1ひと脳脊髄液で識別された内因性ペプチドの在庫の増加、臨床において CSF endopeptidomic 解析を有効にする方法を開発しました。).最近の研究でこのメソッドのアプリケーションは拡大の既知の CSF endopeptidome 10 倍13非特定診断のいくつかの個人から CSF 標本約 16,400 内因性 CSF ペプチドの同定結果になったメソッドは、定量化の定圧ラベリング手法と組み合わせて必要に応じて使用できます。
サンプル準備
髄液中蛋白質量の主な情報源は血漿成分 (アルブミンや免疫グロブリンなど) 血液脳関門14,15上を通過します。彼らの高い豊富な低豊富で脳由来サンプル コンポーネントの検出を阻害します。内因性ペプチドは、LC-MS 分析、それによって低い豊富なペプチドの検出を有効にするのに使用される CSF ペプチド エキス量が大きくなり、高豊富なタンパク質から容易に分離できます。
ここで提示されたプロトコル、分子量カットオフ (MWCO) ろ過タンパク質端数から CSF ペプチドを分離する使用されました。前のいくつかで使用されているメソッドは、8,9,10、11,12,16を研究します。ろ過ステップは高 pH 移動相勾配上で実行オフラインの RP HPLC 事前分別手順が続いた。主な違いをされている pH タンデムで RP HPLC の 2 つの手順を実行するとして、異なるペプチド電荷状態の結果として変更されたペプチド保持から主に 2 つのステップの選択性の違いの結果します。酸性条件下で LC MS 前に pH が高いペプチド事前分別のアプリケーションは効率的なペプチドの同定の17,18, の増加で、さらに複雑な生物学的にこの目的のために優れている証明します。サンプルより直交分離モード19、強い猫イオン交換 (SCX) や RP20などと比較して。プールごと 12回画 (例えば1、13、25、37、49 分画)、RP hplc 高解像力のためまだ大きく異なる由来ペプチドの共同の溶出を避け、連結スキームが使われます、分析時間を短くにはLC-MS の分数はステップ20,21です。
ペプチドの同定
Peptidomic 研究におけるペプチドの同定とは異なるプロテオーム研究のデータベース検索で酵素胸の谷間は指定できませんし、結果として、識別率が通常より低い11。最近の研究13示した適応の得点を使用してスコアリング アルゴリズム各ソフトウェア プログラムの既定値が変更されたときを Sequest とマスコットを用いる生体内ペプチドの同定率大幅に改良されました。アルゴリズム パーコレーター、生体内ペプチドの最適なスコアリング アルゴリズムがトリプシン ペプチド13のそれと異なることを示します。2 つのフラグメント イオンの指紋ベースの検索エンジンを補完する研究では、ピーク (BSI) ソフトウェアを使用して自動ペプチドde novoシーケンスに基づく識別が見つかったという点での大幅に大きいセットの識別ペプチド。
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Protocol
下記プロトコルは、内因性ペプチドの大規模な量が人間の CSF15でした以前の研究で使用される 1 つの洗練されたバージョンです。元のプロトコルへの更新は、脳脊髄液の化学的前処理を少し修正するだけでなく、オフラインの高 pH RP HPLC 前の分別のために使用されるグラデーションの最適化を含みます。
倫理的配慮
スウェーデンの患者および制御材料研究のすべては、倫理委員会によって承認されている: 聖ヨーラン (ref. 2005-554-31/3)。アムステルダム認知症コホートから脳脊髄液サンプルと神経、脳神経、ロンドンの国立病院で収集されたサンプルは、すべての参加患者から書面による同意と地域の倫理委員会から承認の研究に使用されました。ここで主に利用される材料から成っていた診断の目的のためのサンプルから左に CSF と私たちの研究に含まれている前にデ識別だった。個人の寄付者や寄付者のグループにサンプルのトレース バックの可能性はないです。
1. ひと脳脊髄液 (CSF) の抽出:
- (訓練を受けた医師によって実行されなければならない) 腰椎穿刺によって脳脊髄液を抽出22標準化されたプロトコルを使用しています。
- 20 分間 2,500 × g で遠心分離によって細胞残屑および他の非水溶性物質を削除します。
- 穿刺出血による血液汚染を示す可能性があります変色の脳脊髄液サンプルを目視で確認します。血とプロテアーゼの存在で有意に高い蛋白質の集中は、分析の結果に大きく影響可能性があります。
2. 前処理 CSF (1.5 mL サンプル ボリューム、ない定量化):
- 解凍室温 (RT) CSF 因数の 1.5 mL、10 mL ポリプロピレン チューブに内容を移して、緩衝剤として 1 M Triethylammonium 重炭酸塩 (TEAB) の 80 μ L を追加します。
- 0.65 mL 8 M ため塩酸塩 (GdnHCl) を追加 (アクティブ濃度 GdnHCl: 2.4 M) と RT 10 分間穏やかにボルテックス。
注: カオトロ ピック、GdnHCl が溶媒の粘性に影響を与える両方と展開されて精力的に好ましい23蛋白質で起因するポリペプチド鎖と相互作用します。したがって、GdnHCl はタンパク質凝集体を溶解し、その後濾過時に内因性ペプチドの回収率を向上します。 - 水溶液中の 200 mM の 60 μ L を追加 tris(2-carboxyethyl) ホスフィン塩酸塩 (TCEP) (アクティブ濃度 TCEP: 6 mM) と 55 ° C のシステイン disulphides を減らすために 1 時間で孵化させなさい。
- 400 mM ヨードアセトアミド (IAA) の 35 μ L を追加 (アクティブ濃度 IAA: 4 mM)、アルキレート システインに 30 分間、暗闇の中で室温で孵化させなさい。アルキル基の追加により、システイン残基は自発的に任意の時点で後続のサンプル準備の間新しい二硫化物橋が形成できません。
- 3.25 mL の脱イオン水と 5.5 mL の総サンプル ボリュームの結果 MWCO ろ過前にサンプルを希釈するために簡潔に渦を追加します。この手順は、時々 フィルター デバイスから高分子物質の溶出させる高濃度が観察されていると 1 M 以下に GdnHCl を希釈する提供しています。
3. 前処理 CSF (10 x 150 μ L サンプル容積、定圧ラベリング定量化):
- 常温 10 個人から CSF 因数の 150 μ L を解凍後個々 の 1.5 mL 低結合マイクロ遠心チューブに内容を転送および緩衝剤として 1 M TEAB の 8 μ L を追加します。
- 8 M GdnHCl の 65 μ L を追加 (アクティブ濃度 GdnHCl: 2.4 M) と RT 10 分間穏やかにボルテックス。
- 6 μ L 水溶液 TCEP の 200 mm を追加 (アクティブ濃度 TCEP: 6 mM) とシステイン disulphides を減らすために 1 h 55 ° C で培養。
- 3.5 μ 400 mM 水性 IAA を追加 (アクティブ濃度 IAA: 6 mM) アルキレート システインに RT と暗闇の中で 30 分間インキュベートし、。
- 定圧ラベリング キットを準備 (e.g。、タンデム質量タグ 10plex 等圧ラベリング試薬)。不要な試薬水和反応を避けるため、高速液体クロマトグラフィー用アセトニ トリル (AcN) の 41 μ l 添加し 5 分間穏やかな攪拌による解散にそれらを開く前に RT に到達する定圧ラベリング試薬バイアルを許可します。
- 対応するサンプルに定圧ラベリング試薬溶液の 30 μ L を転送し、穏やかな動揺の下で室温で 1 時間インキュベートします。定圧ラベリング試薬には、ペプチド N 末端に存在の第一級アミンとだけでなく、リジン残基と反応する NHS エステル グループが含まれています。
- 5% のヒドロキシルアミンの 8 μ L を追加 (アクティブ濃度ヒドロキシルアミン: 0.16%) とラベリングの反応を癒やすために 20 分間常温軽く振る。別にラベルのサンプルを組み合わせるので、ラベリングの反応を急冷することを確認します。さらにヒドロキシルアミンのフォームのアミン グループの豊かな、残りの定圧ラベリング試薬を反応させた、従ってレンダリング不活性。
- シングル 15 mL ポリプロピレン チューブに 10 個別ラベル サンプルのそれぞれの内容を結合します。
- 複合サンプルと簡単に 3% に 12% から AcN 濃度を低減する渦に 6.4 mL の脱イオン水を追加し、GdnHCl 濃度より高い濃度として 1 M 以下に GdnHCl は高分子物質の溶出がありますが観察されておりフィルター デバイス。
4. 分子量カットオフろ過
- ロード 10 mL 水溶液 1 M GdnHCl、25 mM TEAB 2,500 x g と RT で 15 分間遠心分離することによって汚染物質、条件、MWCO フィルターの可能性を除去するために、フローを通じて (フィート) 破棄します。
- フィルターのサンプル全体ボリュームをロード (5 mL 非標識 CSF (ステップ 2.5) または 10 mL isobarically ラベル CSF (ステップ 3.9))、2,500 g と RT、x で 30 分残して、フロースルー (FT) コンテナーのコレクションで遠心力場します。ろ過の結果はより大きい蛋白質と残留細胞残骸から小さなタンパク質及びペプチドが分割されています。この手順は、プロテオミクス実験でペプチドを生成するタンパク質のプロテアーゼ消化の使用と同等の peptidomic として見ることができます。
- ペプチドの回収率を高めるために 5 mL の 25 mM TEAB (水性) フィルターおよび 2,500 × g で 15 分間遠心して、RT をロードします。
- 渦 (非標識の合計 10 mL、15 mL isobarically ラベル サンプル)、2 つの手順から複合 FTs、サンプルの酸性化に進みます。
5. 脱塩漬けサンプルのクリーンアップと固相抽出法による
- 固相抽出 (SPE) の前に、ステップ 4.4 からフィルター処理されたサンプルを酸性化します。酸性化は、SPE カートリッジの固定相と溶質 (ペプチド) の相互作用を改善するために実行されます。
- 非ラベル サンプル (ボリューム 10 mL): 1% トリフルオロ酢酸 (TFA) - サンプルの容量を 550 μ l 添加: 0.05 mL の 10.55 TFA。
- 定圧ラベル サンプル (ボリューム 15 mL): 追加の 20 mL の 0.1% 酸性、AcN 濃度 3% から 1% のサンプルの容量を下げる TFA: 0.066 %30 mL TFA。
注: TFA は、ない彼ら自身を保持する SPE カートリッジの梱包材で十分に強力な疎水性相互作用の可能なペプチドの保持を向上させるイオン対試薬としてその機能の追加もされます。 - 場合 pH > 3、サンプルの pH まで 20% リン酸でサンプルを滴定 < 3。
- 84% の AcN, 0.1% ギ酸 (FA)、破棄、フィートで 1 回 1 mL の添加により SPE カートリッジを状態します。以降の手順でペプチドとともに溶出だろうそれ以外の場合、不要な物質を除去するカートリッジ フィルターの調節が必要です。さらに、エアコン フィルターの増加を透磁率。
- 0.1 1 mL の添加により SPE カートリッジを平衡 %tfa、一度フィートの繰り返しを破棄します。あることを確認、フィルターが乾燥平衡の最後のステップの後フィルターの上に少量を維持します。カートリッジ フィルターの平衡がエアコン ステップから左 (アセトニ トリル) 疎水性の物質を除去することによってペプチドを保持するフィルターを準備するために実行されます。
- 必要に応じて、いくつかの部分でサンプル全体ボリューム (10.55 mL 非ラベル サンプルまたはサンプルの isobarically ラベル 30 mL)、ロード、無駄に FT。カートリッジがないラウンドを読み込むサンプル間乾燥を実行か最後のサンプル ボリュームをロードされている - 後フィルターの上に少量を維持してください。
- 1 mL 0.1% を渡す塩および試薬を削除し、一度フィートの繰り返しを破棄するフィルター、TFA。カートリッジが実行されないこと乾燥後各洗浄のステップ - を確保するカートリッジの上に液体の少量を維持します。
- 場所 1.5 mL 低結合マイクロのカートリッジの下の管を遠心し、84% の 1 mL を渡すことによってサンプルを溶出 AcN、0.1% カートリッジで FA。
- デ塩サンプルから実行まで乾燥、加熱は-80 ° C で保存または高 pH 分別にすぐに進み、真空遠心分離機で蒸発によって溶剤を削除します。
6. オフライン高 pH を逆相 HPLC サンプルの分別
-
水性高 pH (設立) 移動相を準備します。
パイプ バッファー a: 純粋な水
パイプ バッファー b: 84% AcN
パイプ バッファー c: 25 mM NH4オ
パイプの読み込みバッファー: 2.5 mM NH4ああ、2 %acn
注: パイプの読み込みバッファー トランスポート ソリューションとサンプル バッファーとして使用します。 - 20 分間穏やかな攪拌による 16 μ L パイプの読み込みバッファーのサンプルを再溶解します。
- Batthらに従って構成されている 96 ディープウェル プレート内部一部コレクターと 15 μ L 高速液体クロマトグラフィー システムのサンプルを読み込む20軽微な変更。PH 安定した分離カラム (C18 3.5 μ m、2.1 mm × 250 mm) を 100 μ L/分の流量で分別し、60 分の線形グラデーションで毎分 1 つの分数を収集します。
- 次のグラデーションの時間ポイントを使用: t = 0 分、B = 1%、C = 10%;t = 4 分、B = 1%、C = 10%、開始分数コレクション;t = 76 分、B = 70%、C = 10%;終了分画コレクションt = 76.5 分、B = 85%、C = 10%;t = 80 分、B = 85%、C = 10%;t = 80.5 分、B = 1%、C = 10%、t = 90 分、B = 1%、C = 10%。
- したがって連結分数間隔 12 分、6 連結部分分数を含む各 12 分画の結果、円形のパターンで 12 の井戸で繰り返し分数を収集します。
- サンプルから乾燥まで RT と 3000 rpm での真空遠心分離による溶媒を削除し、-80 ° c 液体クロマトグラフィー質量分析の前にサンプルを格納します。
7. LC MS
-
モバイル水溶液を準備します。
バッファー a: 0.1% FA
バッファー b: 0.1 %fa、84% の AcN
読み込みバッファー: 0.05% 2% TFA AcN
注: バッファー トランスポート ソリューション、サンプル バッファー読み込みポンプ用移動相とされます。 - 再バッファーを読み込んで、RT で 20 分間揺れ 6 μ L 添加による溶解 12 画の各
- トラップ列構成で動作ナノ流動 HPLC で負荷 5 μ L のサンプル (トラップ列: 75 μ m x 2 cm、C18100 Å の細孔径、3 μ m 粒子径; 分離カラム: C18、75 μ m × 500 mm、100 Å の細孔サイズ、2 μ m の粒径、次のグラデーションを使用して 150 nL/min の流量でペプチド分離を行い: t = 0 分、B = 2%t = 10 分、B = 2%t = 11 分、B = 7%;t = 100 分、B = 26%;t = 170 分、B = 45%;t = 175 分、B = 80%;t = 181 分、B = 2%、および t = 210 分、B = 2%。
-
ナノ ESI インタ フェースを介して高速液体クロマトグラフィーに接続されている高解像度ハイブリッド質量分析計で MS を実行します。M/z範囲 350 1,400 以上 120,000 (2.0e5 AGC ターゲット) の解像度の設定で MS モードにフル スキャン スペクトルを記録します。
- データ依存型・ アクイジション ・ モードで質量分析計を動作、 m/z > 150 とフラグメント イオン分析用強度範囲の 1.0e4 1.0e5 内トップ 10 最も強烈なピークからの MS/MS スペクトルを選択します。60% で 1 m/zの四重極分離ウィンドウ、最大射出時間 100 ms と RF のレンズを使用して前駆イオンを分離します。
- 15 の除外時間で動的な除外を適用 s、± 10 ppm のm/z許容値。高い衝突エネルギー解離 (HCD) セルに断片化を実行し、50,000 (5.0e4 AGC 目標値) の解像度の設定で orbitrap MS/MS 買収を記録します。
8 ペプチドの同定
-
ペプチッド識別プロテオミクスの検索エンジンは、次の設定を適用することで質量分析から .raw-ファイルの結果を提出します。
注: 以前の研究15、3 つの検索エンジン。ピーク v7.5、Sequest HT マスコット v2.4 は並列で使用され、特に明記しない限り、ここで指定した設定がすべての 3 つの検索エンジンの採用されました。調整可能な設定の大半は、ペプチド ・ タンパク質同定のため普遍的なものし、任意の検索エンジンに対応する設定がある必要があります。
スペクトル セレクター:
前駆体分質量: 350 ダ
Max。前駆体物質: 5,000 Da
スキャンの種類: 完全
信号/ノイズのしきい値: 1.5
シーケンス データベース検索
データベース: UniProt_SwissProt [version2015_11]
分類: ホモ ・ サピエンス
酵素: どれも
Max。劈開を逃した: 0
楽器 (マスコットのみ): ESI トラップ
分のペプチドの長さ (SequestHT のみ): 6
Max。ペプチドの長さ (SequestHT のみ): 144
前駆体の質量許容差: 15 ppm
質量公差をフラグメント: 0.05 ダ
静的な変更: Carbamidomethyl (C);[ラベル] の場合TMT10plex (試用期間)
動的な変更: 酸化 (M);[ラベル] の場合TMT10plex (K)
ペプチド スペクトル マッチ (PSM) の検証
パーコレーター (マスコット、Sequest HT のみ) またはおとり融合 (ピークのみ)
FDR をターゲット: 0.01
検証に基づいて: q 値
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Representative Results
ここで説明する方法を適用されており、サンプルの事前分別 (表 1) の導入の前に 3 つの研究で評価。最初の研究は、MALDI ターゲット プレートの CSF 分数をスポッティングのためのオフラインの LC を使用、730 の識別された内因性ペプチド11の結果します。2 次試験で定圧ラベリングが採用されました。同時に識別および CSF endopeptidome ・ プロテオーム解析における潜在的なバイオ マーカーの性格描写のため研究ケース/コントロールを中心に24、第 2 研究定圧ラベリング治療効果体内を監視する使用されたとCSF の 36 h16以上のペプチド発現に γ-セクレターゼ阻害剤。ケース ・ コントロール研究では 437 の内因性ペプチドが同定された、広告と個人間の濃度のうち 64 が大幅に変更と健全なコントロール。第三に、治療研究、1798 内因性ペプチドを識別、監視対象のペプチドの 11 は治療に反応する示すことができます。
4 番目の研究では、目的は特に低い豊富なペプチドを識別するために、特定の CSF ペプチドの数を増やすにされました。したがって、設立 RP クロマトグラフィーによるペプチド プレ分画が含まれていた、16,395 ペプチドの同定の結果、10 倍拡大 CSF 試料量が使用されました。本研究では定圧ラベルは実行されません。サンプル分別に加え最も最近の研究は、結合ペプチドの同定を採用手法は、最初の 3 つの研究でのみ単一のデータベース検索を行った、一方ペプチドの大きい数のためいくつかの範囲のアカウントに識別されます。使用されているアルゴリズムは、ある程度の量が比較的少ないので補完、ペプチドの未満 15% (2440)、個々 の検索エンジン (マスコット、Sequest HT またはピーク) 最も最近の調査から得られた結果を比較することを示しますすべての 3 つの検索エンジン (図 2) によって識別されます。さらに、 de novo-検索エンジンのピークだった、ほとんどのシーケンス 5,400 ペプチドがない識別されている場合にのみピークがされていたよりも識別の内因性ペプチドがより効率的な使用 (図 2)。同じ材料のいくつかの検索エンジンのアプリケーションに潜在的な複数のテスト問題と、この問題に対応する識別正確性13のテスト。最新の試用版からプロテオーム検索で得られたすべての結果と同様に、取得した生 MS/MS データで行われている使用可能な識別子 PXD004863 と ProteomeXchange を経由してプライド データ リポジトリ。
図 1: メソッドの主な手順を可視化するプロトコル スキーム。2 非水溶性物質を除去する遠心分離によって続いて腰椎穿刺によって脳脊髄液の抽出) 追加の GdnHCl サンプルに内因性ペプチド; の回復を高めること、ペプチド-タンパク質骨材を分離するには減少およびアルキル化システイン disulphides; の定圧ペプチド定量化 (オプション) 3 のラベル) 蛋白質、4 から内因性ペプチドを分離する分子量ろ過) 塩と他の極性汚染物、5 を削除する固相抽出) RP HPLC 事前分別、アルカリ移動相のグラデーションとすべての 12番目の分数の連結 6) RP 高速液体クロマトグラフィー/タンデム質量、酸性移動相勾配 7 を連続して、各連結分画実行) としてすべての 12 の分析の実行から MS/MS データの送信によって実行されるペプチッド識別、検索エンジンに、その後ペプチド Id を比較した 1 つのサンプルとすべてのユニークなペプチド Id の合計を行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 研究概要 | TMT ラベリング (y/n) | パイプ RP 分別 (y/n) | 質量分析 (μ l) あたり CSF の量に応じた | 識別されたペプチドの数 | コメント | 参照 |
| 探索的 CSF ペプチドーム解析 | n | n | 500 | 730 | オフライン LC MALDI ターゲット準備、MALDI MS;MWCO フィルターの評価 | 4 |
| CSF ペプチド; の定量的比較20 からのサンプル + 8 Ctrl | y | n | 200 | 437 | 高速液体クロマトグラフィー ESI MS;複合 peptidomic とプロテオームのプロトコル | 25 |
| 広告 γ セクレターゼ阻害剤治療研究 | y | n | 300 | 1798 | 高速液体クロマトグラフィー ESI MS;治療後 6 時間ポイントで抽出した CSF | 17 |
| 拡大 CSF ペプチドーム | n | y | 750-1000 | 18.031 | 高速液体クロマトグラフィー ESI MS;ペプチド同定ソフトウェアの組み合わせ | 15 |
表 1: 分子量ろ過と質量分析計による人間の CSF の内因性ペプチドの同定に適用されますこのグループによって実行される最近の研究のコンパイル。
図 2: マスコット、Sequest HT とピークに each of 3 つの検索エンジンから得られたペプチドの同定結果を比較するベン図形型図表。合計 16,395 内因性ペプチドが同定されました。De novo-10,967 内因性ペプチド; 検索エンジンのピークをシーケンス識別フラグメント イオン指紋ベースの検索エンジンのマスコット、Sequest HT 8118 と 7304 内因性ペプチドをそれぞれ識別されました。すべての 3 つの検索エンジンとの間の識別のコンセンサスは、2440 内因性ペプチドまたは 14.8% に達した。マスコットとの結合ペプチドの同定の 70% に相当する Sequest HT の比較的大きな識別重複があった。ピークが比較的小さい識別マスコットと Sequest HT; 重複20.5% 18.9% とそれぞれ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
分子量限外ろ過11内因性ペプチドの回収率の開発済みプロトコルに高 pH RP HPLC 事前分別ステップの導入相対的なサンプルの複雑さの低減し、5 倍より大きいのそれにより許可サンプル ボリュームを検討します。、これはターンでは、ペプチド各画分に存在のサブセットの濃度を増加し、それにより低豊富なペプチドの検出のチャンスを改善します。
並列に 3 つのプロテオームのソフトウェアを採用した内因性ペプチドの同定戦略を実行して知られている髄液 endopeptidome の 10 倍以上を展開することが可能だった。16,395 内因性ペプチドの合計は、プールされた CSF 試料の予備試験で識別されました。Id の間で神経変性疾患のコンテキストで上記タンパク質から派生した内因性ペプチドの大規模な数であった。上記の研究ではいくつかのペプチドは、当研究室におけるバイオ マーカーとして現在評価されています。このプロセスは、貯蔵中のペプチドの安定性を評価する対象の質量試金の確立の重い同位体で標識合成類似体と髄液を打ちつけることによってペプチドのアイデンティティの検証を含む、いくつかの手順と凍結融解のサイクルと異なる臨床コホートで分析。
変更は、MWCO ろ過中にサンプルの GdnHCl の高濃度の結果として汚染物質 (手順 2.5 および 3.5) の導入を避けるために元のプロトコルに行われました。事前分別グラデーション (ステップ 6.3.1) に更新が行われた、能力の延長、線形グラデーションが使用されます。
ここで説明したプロトコルでは試料の損失の主な原因は、RP のガスクロマトグラフィーによる二段 MWCO ろ過、ステップをクリーンアップ SPE サンプル帰することができます。
ペプチド MWCO フィルター、またはろ過中にそれを保持するタンパク質との相互作用による損失を避けるために困難し、の源になる可能性がありますインター サンプルのばらつきです。
さらに選択的な損失可能性がありますは、RP ガスクロマト グラフの手順で発生します。ペプチドの疎水性が pH に依存するので手順 2 連続 RP ガスクロマト グラフで高低 pH、それぞれがの損失につながる列と同様に 2 番目に保持する pH ≥9 にも親水性ペプチドのサブセットサブセットも保持する pH 3 で親水性。
以前使用していたメソッド事前分別の雇用は内因性ペプチドの同定の 10 倍の増加につながっていると比較。それ以前は未確認のペプチドの多数の成功した検出を許可している、したがって研究と CSF ペプチドーム、おそらく他の複雑な試料と同様の探査に貴重なツール。
多重定圧ラベリング プロトコルはさらに髄液、血液や脳の組織の様々 な神経変性疾患のバイオ マーカー候補を識別するために適用されるものと組み合わせます。
このような影響 LC さんを実行する定圧ラベリング ペプチドのサンプル準備減少の初期の段階で CSF 蛋白質・ ペプチドの分析分析のバリエーションに貢献してサンプルの準備のステップでさまざまな回復バリエーション大幅。以前に報告されたサンプル準備のプロトコルと比較して、pH が高い逆相ペプチド事前分別の実装は 5 の要因によって識別されたペプチドの数を高めた。異なるペプチッド識別ソフトウェア プログラムには、さまざまな検索アルゴリズムを採用を結合するとき MS/MS データから内因性ペプチドの同定が大幅に改善されました。
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Disclosures
競合する利益、金融や他の著者との間は報告されていません。
Acknowledgments
Tanveer Batth や同僚と事前分別方法の設定でのアドバイスに感謝します。
この作品はスウェーデン研究評議会、Wallström、Sjöblom 財団、銃とベルティル Stohne 財団 Stiftelse、マグナス Bergwall 財団、Åhlén 財団、Alzheimerfonden、Demensförbundet、Stiftelsen のためからの資金によって支えられました。ガムラ ・ Tjänarinnor、クヌートとアリス バレンベリー財団、Frimurarestiftelsen、気の狂ったアメリカの Götalandsregionen。
このプロジェクトのための資金の主な受信者はカイ Blennow、ヘンリック ・社会行動」論とヨハン ・ Gobom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al.
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer's disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M.
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al.
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
