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परिधीय धमनी रोग के एक Murine मॉडल में Monocyte डाक और ट्यूमर से संबंधित Angiogenesis की Intravital माइक्रोस्कोपी

Published: August 26, 2017 doi: 10.3791/56290
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 4, 1, 1
1Department of Cardiology and Angiology, University of Magdeburg, 2Leibniz Institute for Neurobiology, 3Institute of Molecular and Clinical Immunology, University of Magdeburg, 4Division of Hematology/Oncology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

Summary

Monocytes परिधीय धमनी रोग के संदर्भ में arteriogenesis के महत्वपूर्ण मध्यस्थ हैं । एक तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स और intravital माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, इस प्रोटोकॉल monocyte धमनी ऊरु बंधाव मॉडल में murine इंजेक्शन के बाद monocyte डाक और ट्यूमर से संबंधित angiogenesis की जांच ।

Abstract

परिधीय धमनी रोग और कोरोनरी हृदय रोग के लिए चिकित्सीय लक्ष्य hemodynamic रोग की वजह से कोरोनरी क्षेत्रों के लिए रक्त के प्रवाह में वृद्धि करने के लिए है । संवहनी सर्जरी चयनित मामलों में एक व्यवहार्य विकल्प है, लेकिन सर्जरी के लिए संकेत के बिना रोगियों के लिए इस तरह की प्रगति के लिए आराम दर्द, महत्वपूर्ण अंग ischemia, या जीवन या काम करने के लिए प्रमुख व्यवधान, वहां उनकी बीमारी को कम करने के लिए कुछ संभावनाएं हैं । monocyte के माध्यम से सेल थेरेपी-संपार्श्विक गठन की उत्तेजना के माध्यम से बढ़ाया छिड़काव कुछ गैर इनवेसिव विकल्पों में से एक है ।

हमारे समूह hindlimb ischemia मॉडल का उपयोग चूहों में monocyte प्रत्यारोपण के बाद arteriogenesis की जांच करता है । पहले, हम hindlimb छिड़काव में सुधार का प्रदर्शन किया है टिटनेस का उपयोग-उत्तेजित syngeneic monocyte ट्रांसप्लांटेशन । संपार्श्विक गठन पर प्रभाव के अलावा, ट्यूमर के विकास के रूप में अच्छी तरह से इस चिकित्सा से प्रभावित हो सकता है । इन प्रभावों की जांच करने के लिए, हम माउस के पार्श्व में Engelbreth-होल्म-झुंड सार्कोमा के extracellular मैट्रिक्स इंजेक्शन द्वारा एक तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स माउस मॉडल का उपयोग करें, रोड़ा धमनी के ऊरु के बाद ।

कृत्रिम ट्यूमर अध्ययन के बाद, हम intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए जमानती धमनियों के भीतर vivo ट्यूमर-angiogenesis और monocyte डाक में अध्ययन. पिछले अध्ययनों ने पशु मॉडलों की ऊतकीय परीक्षा का वर्णन किया है, जो पोस्टमार्टम कलाकृतियों को बाद में विश्लेषण की कल्पना करते हैं. हमारे दृष्टिकोण वास्तविक समय अनुक्रम में collateralization के क्षेत्रों के लिए monocyte डाक visualizes, प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और vivo मेंarteriogenesis और ट्यूमर angiogenesis की प्रक्रिया की जांच ।

Introduction

हृदय रोगों, कोरोनरी हृदय रोग या परिधीय धमनी रोग सहित, मौत का सबसे आम कारण दुनिया भर में1हैं । सेल थेरेपी विशेष रूप से लोगों को जो शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप से गुजरना करने में सक्षम नहीं हैं के लिए हृदय रोग का इलाज करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है । एक चिकित्सीय उपकरण के रूप में कोशिकाओं या उनके स्रावित पदार्थों का उपयोग करने के लिए कई दृष्टिकोण हैं2,3, छिड़काव में सुधार लाने और कोरोनरी और underperfused ऊतक के समारोह को बनाए रखने के लिए समग्र लक्ष्य के साथ. इस लक्ष्य को प्राप्त करने का एक प्रयास arteriogenesis को बेहतर बनाना है, जो संपार्श्विक धमनियों के विकास को बढ़ाता है । Monocytes collateralization के साथ संबद्ध एक महत्वपूर्ण कक्ष प्रकार हैं । हमारे समूह सूजन4,5के क्षेत्रों में monocytes के प्रभाव पर शोध पर ध्यान केंद्रित किया है, विशेष रूप से hindlimb ischemia मॉडल का उपयोग करने के ischemia और बाद में सूजन6प्रेरित करते हैं । सूजन के क्षेत्रों के लिए घर Monocytes और जटिल प्रणालीगत प्रतिक्रियाओं का कारण है कि collateralization के विकास के लिए नेतृत्व7।

intravital माइक्रोस्कोपी के उपयोग के साथ, हम vivo में इन कोशिकाओं के व्यवहार का अध्ययन और सूजन के क्षेत्रों के लिए इंजेक्शन monocytes के डाक का निरीक्षण कर सकते हैं । सबसे पूर्व अध्ययन केवल पोस्ट मार्टम विश्लेषण, जो ऊतकीय कलाकृतियों और जानवरों की बड़ी संख्या की तैयारी के लिए आवश्यक की एक परिचय सहित नुकसान पकड़ का वर्णन । हमारे दृष्टिकोण के साथ, हम एकाधिक समय बिंदुओं पर लाइव इमेजिंग के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं और संपार्श्विक गठन की जांच कर सकते हैं ।

कोरोनरी क्षेत्रों में संपार्श्विक धमनियों के विकास के अलावा, monocytes भी ट्यूमर के विकास को प्रभावित । इन प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए, हम एक तहखाने झिल्ली की तरह Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा, एक extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन में अमीर ट्यूमर से निकाले गए सुई इंजेक्षन8, और intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर विश्लेषण । इस मैट्रिक्स या तो endothelial सेल नेटवर्क के गठन या विरोधी angiogenic अवरोध के माध्यम से कैंसर के उपचारों के लिए परीक्षण अणुओं स्क्रीन करने के लिए प्रयोग किया जाता है; इस मामले में, हम सेल थेरेपी9,10,11के लिए monocytes के ट्यूमर angiogenic क्षमता का आकलन करेंगे ।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक आसान और कारगर तरीका प्रतिरक्षा एक vivo में मॉडल में ischemia की वजह से प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रदर्शन है । हम पोस्ट मार्टम मांसपेशी ऊतक के ऊतकीय workup की तुलना में एक अधिक यथार्थवादी परीक्षण वातावरण उत्पन्न कर सकते हैं ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > हमारा अध्ययन पशु संरक्षण के लिए जर्मन कानून की धारा 8 के अनुसार Saxony-Anhalt, Landesverwaltungsamt हाले के राज्य की अनुमति के साथ किया गया था । (& #167; 8, 18.05.2016-BGBI से पशु संरक्षण के लिए जर्मन विधि का पैरा 1 । I S. १२०६, १३१३, & #167; 31 TierSchVersV से 13.08.2013).

< p class = "jove_content" > नोट: यहाँ प्रयोगों के लिए, 8 से 12 सप्ताह पुराने पुरुष बालब/सी चूहों का इस्तेमाल किया गया था, और रक्त दाताओं से मानव monocytes intravital माइक्रोस्कोपी के माध्यम से monocytes के दृश्य के लिए इस्तेमाल किया गया.

< p class = "jove_title" > 1. सेल वडा

< p class = "jove_content" > नोट: monocytes के अलगाव के लिए, कृपया निर्देशों के लिए जौव पर हमारे पिछले प्रकाशित वीडियो देखें: & #34; अलगाव और Murine अस्थि मज्जा व्युत्पंन के नसों में इंजेक्शन Monocytes & #34; by Wagner एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > 4

< p class = "jove_content" > नोट: जब कोशिकाओं के साथ काम करना सभी कदम प्रदूषित होने से बचने के लिए बाँझ होना चाहिए.

  1. सेल सना के साथ 3, 3 & #39;-Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorate
    1. एक घनत्व के साथ सीरम मुक्त संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को reसस्पेंड 1 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल
      नोट: केवल सीरम मुक्त मध्यम सक्षम बनाता है एक कुशल धुंधला, के बाद से lipophilic डाई अंयथा पहले से ही सीरम के lipophilic घटकों द्वारा कब्जा किया जाएगा ।
    2. Add 5 & #181; L की 1 mM 3, 3 & #39;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate dimethylformamide में 1 एमएल का सेल सस्पेंशन और ध्यान से सस्पेंड ।
    3. पर सेल समाधान ३७ & #176; ग के लिए 20 min.
    4. केंद्रापसारक पर कोशिकाओं ३७ & #176; C और ५०० x g के लिए 5 min.
    5. supernatant और ३७ & #176 के साथ कोशिकाओं reसस्पेंड; सी गर्म भ्रूण बछड़ा सीरम पूरक मध्यम.
    6. दोहराएं कदम 1.1.4 और 1.1.5 दो बार ।
    7. सूत्र के साथ कोशिकाओं की गणना:
      < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56290/56290eq1.jpg"/>
    8. reसस्पैंड कोशिकाओं के साथ १५० & #181; L बाँझो ०.९% NaCl हल.
    9. कोशिकाओं को पूंछ नस में इंजेक्ट ।
< p class = "jove_title" > 2. संज्ञाहरण

  1. सांस लेना संज्ञाहरण
    1. भाप एक रासायनिक सुरक्षा हूड के तहत एक बंद बिन में 5% की एकाग्रता का उपयोग कर एक isoflurane की मदद से vaporizer ।
    2. ने माउस को सावधानी से संभाल कर उसे बिन में रख दिया.
    3. पीछे गर्दन की त्वचा द्वारा पशु संभाल के बाद यह चलती बंद कर दिया है ।
  2. Intraperitoneal संज्ञाहरण
    नोट: isoflurane संज्ञाहरण का प्रयोग करें, चरण २.१ के तहत वर्णित, एक Intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए । तेजी से वसूली और isoflurane संज्ञाहरण के लघु अभिनय मादक प्रभाव के साथ, यह माउस को संभालने और intraperitoneal संज्ञाहरण इंजेक्षन करने के लिए आसान है ।
    1. NaCl इंजेक्शन के लिए २.४ एमएल Ketamine (10%), ०.८ एमएल Xylazine (2%), और ६.८ एमएल intraperitoneal (०.९%) के सॉल्यूशन का उपयोग करें ।
      2. संवेदनाहारी.
      लागू करने से पहले पशु
    2. तौलना नोट: संवेदनाहारी के लिए सूत्र है:
      < img alt = "समीकरण 2" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56290/56290eq2.jpg"/>
    3. बाईं विद्रोह में समाधान इंजेक्षन करने के लिए एक 30 ग्राम सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें.
    4. अपने पिंजरे में माउस जगह और मादक प्रभाव के लिए प्रतीक्षा करें ।
      नोट: मादक प्रभाव आम तौर पर 5 मिनट के भीतर प्रकट होता है अगर इंजेक्शन सफल रहा था । संज्ञाहरण की सही गहराई या तो ढक्कन पलटा या पैर की अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया के अभाव से निर्धारित किया जा सकता है, साथ ही सांस लेने की एक नियमित रूप से नियंत्रित दर ।
< p class = "jove_title" > 3. तहखाने झिल्ली की तरह के आरोपण-मैट्रिक्स

< p वर्ग = "jove_content" > नोट: इस विधि monocyte इंजेक्शन के बाद ट्यूमर angiogenesis का अध्ययन करने के लिए हमारे समूह द्वारा प्रयोग किया जाता है । प्रयोगों पर निर्भर करता है, विकास कारकों तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स में जोड़ा जा सकता है । हम माउस के पार्श्व में ट्यूमर इंजेक्शन से पहले ऊरु धमनी बंधाव प्रदर्शन किया । इंजेक्शन के लिए मैट्रिक्स में 4 & #176; C का तापमान होना आवश्यक है । इस तापमान पर, मैट्रिक्स तरल पदार्थ है; जेल शरीर के तापमान पर एक ठोस करने के लिए कठोर (३७ & #176; C). चमड़े के नीचे मैट्रिक्स प्लग की बेहतर दृश्यता के लिए, इंजेक्शन साइट पर माउस की त्वचा दाढ़ी ।

< p class = "jove_content" > नोट: वैकल्पिक: जोड़ें १०० एनजी बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक, ३०० एनजी संवहनी endothelial विकास कारक, और 26 I.U. हेपरिन के तहत बाँझ शर्तों के तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स.

  1. एक 30 जी में मैट्रिक्स के 1 मिलीलीटर लोड इंसुलिन सिरिंज और उपयोग तक बर्फ पर दुकान.
  2. मेज पर जानवर रखना और पार्श्व पर इंजेक्शन साइट के बगल में माउस की त्वचा पकड़ो ।
  3. इंजेक्षन ५०० & #181; एल के तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स चमड़े के नीचे.
    नोट: व्यावहारिक कारणों के लिए, यह एक स्थान पर तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स को दृढ़तापूर्वक सुई के लिए चमड़े के नीचे फैलाव से बचने के लिए आवश्यक है । यह प्रयोग के अंत में माउस त्यागने के बाद ऊतक से कृत्रिम ट्यूमर को उखाड़ फेंकना आसान हो जाएगा.
< p class = "jove_title" > 4. पूंछ नस इंजेक्शन

< p class = "jove_content" > नोट: प्रयोग से पहले परीक्षण पशुओं पर NaCl समाधान के साथ पूंछ नस इंजेक्शन का अभ्यास करें । यदि monocytes पर्याप्त पूंछ नस में इंजेक्शन नहीं किया जा सकता है, वहां collateralization पर कोई प्रणालीगत प्रभाव होगा । इस प्रोटोकॉल में, हम २,५००,००० monocytes इंजेक्शन । 5 से अधिक नहीं इंजेक्षन करने के लिए प्रयास करें & #181; bodyweight.

के एल/
  1. २,५००,००० monocytes युक्त चरण 1.1.8 के अंतर्गत तैयार monocyte समाधान का उपयोग करें ।
  2. इंजेक्शन के लिए एक 30 जी सुई और एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें ।
  3. ध्यान से माउस को संभाल, निरोध में जानवर को नियंत्रित, और सुनिश्चित करें कि माउस को नुकसान नहीं पहुंचा है और सांस लेने के लिए पर्याप्त जगह है ।
  4. हीटिंग पैड पर छलनी डाल दिया ताकि पूंछ थाली से संपर्क कर सकते हैं ।
  5. पूंछ की नसों, जो पूंछ के पार्श्व ओर स्थित है की पहचान ।
  6. बारी टेल ९० & #176;, तो पूंछ की ऊपरी तरफ पूँछ नस दिखाई देती है.
  7. इंजेक्शन साइड monocytes इंजेक्शन से पहले संक्रमित.
  8. का सामना करना पड़ सुई के बेवल के साथ एक फ्लैट कोण में monocyte समाधान इंजेक्षन करने के लिए प्रयास करें.
    नोट: यह एक असफल इंजेक्शन का एक संकेत है के रूप में एक छाला प्रकट होता है, तो इंजेक्शन बंद करो । प्रक्रिया फिर से अधिक समीपस्थ प्रयास ।
  9. के बारे में 60 के लिए पूंछ पर कोमल दबाव लागू करने से इंजेक्शन साइट पर खून बह रहा बंद करो ।
  10. पशु पूरी तरह से बरामद किया गया है के बाद प्रणालीगत दुष्प्रभावों के लिए निगरानी और इसके पिंजरे में माउस जगह के लिए 30 मिनट के लिए जानवर का पालन करें ।
< p class = "jove_title" > 5. Intravital माइक्रोस्कोपी

  1. वडा
    1. हीटिंग पैड पर anesthetized माउस रखें (३७ & #176; C) एक निरंतर तापमान रखने के लिए और चिपकने वाला टेप के साथ जगह में पंजे को ठीक.
    2. पैर या पार्श्व कि माइक्रोस्कोपी के लिए प्रयोग किया जाता है की साइट पर त्वचा को संक्रमित ।
    3. बेहतर हैंडलिंग के लिए ब्याज की क्षेत्र दाढ़ी और बालों के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए ।
    4. ०.५ x ०.५ सेमी के एक वर्ग क्षेत्र में बाँझ स्केलपेल और ठीक संदंश के साथ त्वचा उत्पाद ।
      नोट: यह हित के क्षेत्र नम रखने के लिए महत्वपूर्ण है; अंयथा, छवियों और ऊतक की गुणवत्ता से समझौता किया जाएगा । NaCl समाधान के लिए क्षेत्र गीला किया जा सकता है ।
    5. दो समायोज्य टिकटों के बीच पैर जगह और टिकटों के शीर्ष पर एक कवर कांच की स्थिति ।
    6. सुनिश्चित ऊतक गीला है और कांच के साथ संपर्क में है ।
    7. Inject ५० & #181; एल rhodamine dextran जहाजों की बेहतर दृश्यता के लिए शिरापरक प्रणाली में retrobulbar ।
    8. माइक्रोस्कोप शुरू और अगर जरूरत पैर की स्थिति को समायोजित ।
  2. Intravital माइक्रोस्कोपी सेटिंग्स
    1. माइक्रोस्कोप, कंप्यूटर, इलेक्ट्रॉनिक इंटरफेस, और पराबैंगनीकिरण पर बारी ।
    2. मशीन चैंबर और/या हीटिंग स्टेज (प्लेट/पैड) के ताप इकाई पर बारी है, और ३७ & #176 के लिए तापमान सेट; C.
    3. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं । माइक्रोस्कोप एक गुंजयमान स्कैनर के साथ सुसज्जित है, तो इस तेजी से स्कैनिंग मोड का चयन करें.
    4. तापमान तक एक स्थिर स्तर तक पहुँच जाता है (३५-३७ & #176; C)
      ध्यान दें: एक स्थिर तापमान के लिए महत्वपूर्ण है: (क) माउस, जो संज्ञाहरण के तहत अपने शरीर के तापमान को नियंत्रित नहीं कर सकते, और (ख) से परहेज या कम से कम फोकल बहाव को कम । यह कई घंटे के लिए 1 h ले सकता है, आसपास की स्थितियों के आधार पर ( जैसे , वातानुकूलन प्रणाली और कमरे में गर्मी स्रोतों की संख्या, लोगों सहित) । यदि विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग किया जाता है, लेंस और कवर ग्लास (या ऊतक) के बीच संपर्क क्षेत्र अस्थिरता का एक विशिष्ट स्रोत है । एक उद्देश्य हीटर के साथ लेंस हीटिंग मदद कर सकते हैं; वैकल्पिक रूप से, एक उच्च प्रणाली के साथ एक खुर्दबीन अत्यधिक की सिफारिश की है ।
    5. एक उच्च अंक एपर्चर कि प्रयोग की आवश्यकताओं को पूरा (इस खंड के अंत में नोट देखें) के साथ एक आवर्धन लेंस का चयन करें ।
    6. लाभ के लिए सम्मान के साथ माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का अनुकूलन, चैनल सेटिंग्स, स्कैन गति, पिक्सेल संकल्प, गहराई मात्रा, चरण आकार, और मंच पर प्रयोगात्मक पशु रखने से पहले औसत.
      7. अधिग्रहण समय को कम करने के लिए
    7. स्कैन करें ।
    8. स्थान पर anesthetized माउस के बाद गरम माइक्रोस्कोप की अवस्था में सूक्ष्मदर्शी स्थिर परिस्थितियों में पहुँच गया है और सेटिंग्स एक डमी की मदद से परीक्षण किया गया है.
    9. तेज प्रकाश रोशनी का उपयोग करके ध्यान में तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स के भीतर ब्याज के क्षेत्र में लाने और संक्षेप में लागू fluorophores.
      10. के लिए पर्याप्त फिल्टर सेटिंग्स के साथ पराबैंगनी प्रकाश द्वारा केशिकाओं का निरीक्षण
    10. स्कैनिंग मोड में स्विच करें; कम संकल्प २५६ x २५६ मोड पर स्कैनिंग शुरू और एक संकेत मॉनिटर पर मनाया जाता है जब तक लाभ और लेजर शक्ति में वृद्धि.
    11. ब्याज की संरचना पर ध्यान केंद्रित । सभी विवरण दृश्यमान होने तक ज़ूम इन करें ।
    12. परिभाषित & #34; प्रारंभ & #34; व & #34; समा & #34; पदों के सलए दिशा में ।
    13. स्कैनिंग.
    14. आकार को परिभाषित ( जैसे , ०.५ & #181; m) और फोकल विमानों की संख्या ( जैसे , 10-20).
    15. अंतिम पिक्सेल संकल्प करने के लिए स्विच (५१२ x ५१२ या १,०२४ x १,०२४) चलती उपसेलुलर संरचनाओं या कोशिकाओं की गति के आधार पर और स्कैन गति (स्कैन आवृत्ति) है कि आंदोलनों के लिए सबसे अच्छा फिट बैठता है का चयन करें । द्वि-दिशा स्कैनिंग स्टैक के अधिग्रहण जकड़ना करने के लिए सिफारिश की है.
      नोट: पर्याप्त छवि गुणवत्ता देता है स्कैनिंग की उच्चतम स्कैन दर का चयन करें । ठेठ बिंदु स्कैनर ४०० हर्ट्ज और १.४ kHz के बीच गति प्रदान करते हैं. गुंजयमान स्कैनर एक अतिरिक्त 8 khz या 12 khz प्रदान करते हैं. y-दिशा में रेखाओं की संख्या को कम करके, स्कैन दर आगे बढ़ सकता है (विशिष्ट मान हैं ५१२ x ५१२, ५१२ x २५६, या ५१२ x २०० पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन) । सिग्नल-टू-शोर अनुपात के आधार पर, एक को 2 और 4 के बीच औसत लाइन जोड़कर छवि गुणवत्ता में सुधार करने की कोशिश कर सकते हैं । आमतौर पर, एक 8 KHz गुंजयमान स्कैनर के साथ द्वि-दिशा मोड में एक अधिग्रहण समय/फ्रेम में 18 ms की कोई औसत परिणाम के साथ ५१२ x २०० की एक सेटिंग; ५१२ x २०० और 4x औसत के साथ, यह नीचे प्रति फ्रेम ५६ एमएस के लिए धीमा कर देती है ।

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Representative Results

monocytes द्वारा ट्रिगर ट्यूमर और संपार्श्विक पोत विकास की परीक्षा के लिए Intravital माइक्रोस्कोपी ट्यूमर angiogenesis और arteriogenesis के आणविक तंत्र में नए पहलुओं को प्रकट करने में मदद कर सकते हैं । कोशिकाओं और तैयार किया जाना चाहिए ध्यान से प्रोटोकॉल के चरणों का उपयोग कर इंजेक्शन । मतभेदों को एकल प्रयोगों के बीच बदलाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । monocytes शिरापरक प्रणाली (चित्रा 1) में इंजेक्शन किया जाना चाहिए प्रणालीगत प्रभाव बनाए रखने और इंबोली से बचने के लिए, जो हो सकता है अगर इंजेक्शन धमनी प्रणाली में आयोजित की जाती है ।

यदि तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स प्रयोग किया जाता है, धीरे से इंजेक्शन के फैलाव से बचने के लिए आगे ऊतकीय परीक्षा के लिए प्लग explantation के साथ मदद मिलेगी (चित्रा 2, चित्रा 3) । माउस त्याग के बाद, तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स प्लग माउस के पार्श्व से explanted किया जाएगा । तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स प्लग के भीतर, हम विभिंन प्रयोगात्मक सेटिंग्स (चित्रा 4, चित्रा 5) के भीतर केशिकाओं गिनती द्वारा vascularization उपाय कर सकते हैं ।

सफल प्रयोगों के लिए एक और शर्त माइक्रोस्कोप सेटिंग है, जो सॉफ्टवेयर, हार्डवेयर पर निर्भर करता है, और पशु तैयारी (चित्रा 6). यदि उपसेलुलर संरचनाओं (& #60; 2 µm) की पहचान की जरूरत है, 2 के साथ एक ईमानदार माइक्रोस्कोप-फोटॉन-उत्तेजना और जल विसर्जन उद्देश्यों (20X या 25X, अंक एपर्चर १.०) लंबे समय से काम कर दूरी (& #62; 2 मिमी) के साथ सलाह दी जाती है । उच्च अंक एपर्चर के साथ जल विसर्जन उद्देश्यों के बाद से अत्यंत अपवर्तन सूचकांक विविधताओं के प्रति संवेदनशील हैं, इष्टतम छवि संकल्प और चमक उद्देश्य पर एक सुधार कॉलर चलती द्वारा समायोजित किया जाना चाहिए । दुर्भाग्य से, हाथ से समायोजन सीमित स्थान के कारण काफी मुश्किल है । इसलिए, एक मोटर कॉलर सुधार के साथ महंगे उद्देश्यों माइक्रोस्कोप निर्माताओं द्वारा की पेशकश कर रहे हैं ।

यदि सेलुलर संकल्प (5-10 µm) पर्याप्त है, एक अंक एपर्चर ०.४ या उच्चतर और एक लंबी काम दूरी (& #62; 2 मिमी) के साथ एक 10x शुष्क लेंस की सिफारिश की है । इस मामले में, एक ईमानदार या एक औंधा माइक्रोस्कोप स्टैंड चुना जा सकता है । लाइव सेल इमेजिंग एक 10x शुष्क लेंस के साथ (अंक एपर्चर ०.४) उच्च ज़ूम कारकों पर (& #62; 3) बहुत आसान है और सस्ता है क्योंकि शास्त्रीय फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (यानी, 1 फोटॉन उत्तेजना) के साथ छवि ढेर प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर्याप्त संकल्प. यदि अधिक समय के लिए छवियों के अधिग्रहण के लिए आवश्यक है, पोत के भीतर rhodamine dextran की मात्रा कम हो जाती है । जहाजों की एक बेहतर दृश्यता के लिए, fluorophore के इंजेक्शन दोहराया जाना चाहिए (चित्रा 7) ।

यह नमूना अलग समायोजन करने के लिए सबसे प्रभावी है और सबसे अच्छी छवि गुणवत्ता संभव फैसला । कोशिकाओं या तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स (प्रत्यारोपण के बिना) के लिए सकारात्मक जांच का उपयोग इष्टतम सेटिंग्स प्राप्त करने में मदद कर सकते हैं । हम रक्त के प्रवाह और मांसपेशी ऊतक (चित्रा 8, चित्रा 9) के भीतर intravital microcopy के माध्यम से लेबल monocytes का पता लगा सकता है । ऊतक वर्गों के ऊतकीय परीक्षा हमारे निष्कर्षों (चित्रा 10) की पुष्टि.

Figure 1
चित्र 1 : पूंछ नस में २,५००,००० monocytes के इंजेक्शन । शिराएं पूंछ के पार्श्व की ओर, पृष्ठीय और ventral ओर धमनियों के साथ स्थित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : तहखाने झिल्ली के इंजेक्शन की तरह मैट्रिक्स । माउस की त्वचा संभाल और तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स में पार्श्व में सुई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : Explanted मैट्रिक्स माउस के पार्श्व से प्लग (३.५ बिंदु देखें) । शामिल जहाजों पूंछ नस के माध्यम से monocyte प्रत्यारोपण के बाद पांच दिन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : तहखाने झिल्ली के भीतर vascularization की तुलना-मैट्रिक्स की तरह ( + एसडी, n = 3 प्रत्येक समूह में) । Equation 3 तहखाने झिल्ली के भीतर जहाजों-मैट्रिक्स प्लग की तरह, कोई वृद्धि कारक के साथ जोड़ा (लाल पट्टी), तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स प्लग के साथ विकास कारक के जहाजों की तुलना में जोड़ा । वृद्धि कारक के साथ तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स की पूरकता बढ़ पोत वृद्धि की ओर जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : जहाजों के भीतर तहखाने झिल्ली-मैट्रिक्स प्लग की तरह । जहाजों के भीतर रक्त प्रवाह (लाल) के दृश्य (तीर) और monocyte डाक (हरा) तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स प्लग के भीतर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : माउस छवि अधिग्रहण के लिए तैयार. पंजे चिपकने वाला टेप के साथ तय कर रहे है और एक कवर ग्लास दो समायोज्य टिकटों के शीर्ष पर तैनात है । ब्याज का क्षेत्र एक स्केलपेल के साथ आबकारी किया गया । NaCl क्षेत्र को गीला करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है तो छवियों और ऊतक की गुणवत्ता से समझौता नहीं किया जाएगा । इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7 : जहाजों की कम दृश्यता. 3, 3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate सना हुआ monocytes (तीर) के भीतर तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स एक पोत के बगल में (अनुदैर्ध्य अनुभाग, *) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : Monocyte पोत में फ्लश । 3 के vivo में दृश्य, 3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate सना हुआ और प्रत्यारोपित monocyte (हरा, तीर) जमानती धमनी के भीतर (*). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9 : Intravital माइक्रोस्कोपी. 3, 3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate सना हुआ monocytes (तीर) ठेठ corkscrew गठन के साथ जमानत वाहिकाओं के भीतर (*) दाग rhodamine dextran के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्र 10 : रान पेशियां का Immunohistological दाग । जहाजों (लाल: अल्फा चिकनी मांसपेशी actin, *), मैक्रोफेज (हरा: 3, 3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate, तीर), सेल नाभिक (नीला). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां वर्णित विधि संपार्श्विक धमनियों के विकास पर प्रकाश डालता है, इन जहाजों में monocytes के व्यवहार, और arteriogenesis की प्रक्रिया । इस प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए कदम जानने के लिए आसान कर रहे है और विज्ञान के अंय क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है । इन फायदों के बावजूद कुछ नुकसान भी होते हैं । मसलन, वर्णित तकनीकों को अंजाम देने के लिए सूक्ष्म उपकरणों की आवश्यकता होती है. एक प्रयोग के लिए उपकरण प्राप्त करना टिकाऊ होता है, इसलिए उपकरणों को साझा करने के लिए अन्य संस्थानों के साथ सहयोग करना महत्वपूर्ण है ।

इस प्रोटोकॉल से जुड़ी अन्य दिक्कतें हैं जिन्हें अभ्यास से बचा जा सकता है । शुरुआत में, वहां स्थिति के साथ खुर्दबीन के नीचे माउस की समस्याओं हो सकता है, और छवि की गुणवत्ता इन परिस्थितियों में पीड़ित कर सकते हैं । एक और महत्वपूर्ण बात पूंछ नस इंजेक्शन है । Monocytes को अगर ठीक से इंजेक्ट किया जाए तो रगों में ही देखा जा सकता है. इसलिए, यह माउस स्थिति से पहले इंजेक्शन अभ्यास करने के लिए सलाह दी जाती है ।

Monocyte अलगाव भी विचारणीय है. Monocytes कई प्रोटोकॉल है, जो अक्सर विभिंन परिणामों और सेल पैदावार12,13,14के लिए नेतृत्व का उपयोग कर विभिंन प्रजातियों से अलग किया जा सकता है । दूषण से बचने के लिए बाँझ परिस्थितियों में काम करना आवश्यक है । कोशिका क्षति ध्यान से pipetting और लगातार तापमान बनाए रखने से रोका जाना चाहिए ।

इन नुकसान के बावजूद, इस विधि व्यावहारिक और प्रदर्शन करने के लिए आसान है, उपयोगकर्ताओं को सक्षम करने के लिए ट्यूमर angiogenesis और परिधीय धमनी रोग के पीछे बुनियादी तंत्र पर प्रकाश डाला ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को और अधिक द्वारा समर्थित किया गया था-Kröner-Stiftung और DFG (ड्यूश Forschungsgemeinschaft, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) SFB ८५४ (Sonderforschungsbereich, सहयोगी अनुसंधान केंद्र) । हंस के लिए विशेष धंयवाद-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, ओटो-वॉन-Guericke विश्वविद्यालय मैगडेबर्ग, मैगडेबर्ग, जर्मनी, तकनीकी सहायता के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% fetal calf serum (FCS) Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1% penicillin/streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1mL Omnifix -F insuline syringe B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany
50 ml syringe  Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany Injectomat- syringe 50 ml with canule
6-well-ultra-low-attachement-plates Corning Incorporated, NY, USA
8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice  Charles River, Sulzfeld, Germany
Adhesive tape TESA SE, Hamburg, Germany
Acquisition Software Leica, Wetzlar, Deutschland  Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723
Canules B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 29G, 30G
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Cell culture medium Manufactured by our group with single components Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin)
Centrifuge Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany Allegra X-15R centrifuge
Depilatory cream Veet, Mannheim, Germany
DiO Invitrogen Eugene, Oregon, USA
Disinfection agent Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany
Disposable scalpel No.10  Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan 
EDTA Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Erlenmeyer flask GVB, Herzogenrath, Germany
Ethanol 70% Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Fetal Calf Serum Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine Forceps Rubis, Stabio, Switzerland
Flurophor/Rhodamindextran Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA Katalognummer: D-1819
Gloves Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Heating pad  Labotect GmbH, Göttingen, Germany  Hot Plate 062
Human macrophage-colony stimulating factor Sigma Aldrich, Hamburg, Germany SRP3110 
Humane leucocyte filters Blood preservation
Incubator Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany
Isoflurane Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Ketamine (10%) Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany
Leukocyte separation tubes (tubes with filter)  Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Light microscope  Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany Axiovert 40 C
Lymphocyte separation medium LSM1077 GE Healthcare, Pasching, Austria
Matrigel  Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Medium M199  PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria
Microbiological work bench Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany Hera safe
Microscope slide Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Art. Nr. 1879
Microscope stand with incubator and heating unit  Leica DMI 6000, Pecon, Germany
Monocyte wash buffer Manufactured by our group with single components PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA
Mouse restrainer Various
Multi-photon microscope  Leica, Wetzlar, Deutschland  Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent
NaCl (0,9%) Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
Neubauer counting chamber  Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Objective Leica, Wetzlar, Deutschland  Leica HC PL APO 10x/0.4 CS
PBS Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany ph 7,4 sterile
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Percoll Manufactured by our group with single components 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3
Percoll solution GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 10µL/100µL/200µL/1000µL
Pipettes serological Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany  Cellstar2ml, 5ml, 10ml
Pipetting heads Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Pipetus Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Polystyrol tube Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Scissor Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Scale Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany
Suction unit Integra bioscience, Fernwald, Germany Vacusafe comfort
Surgical scissors Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Trypan blue solution 0,4 % Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Tubes with cap Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 15ml, 50ml Cellstar
Xylazine (2 %) Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany

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References

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परिधीय धमनी रोग के एक Murine मॉडल में Monocyte डाक और ट्यूमर से संबंधित Angiogenesis की Intravital माइक्रोस्कोपी
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Wagner, M., Baer, C., Zuschratter, W., Riek-Burchardt, M., Deffge, C., Weinert, S., Lee, J. C., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease. J. Vis. Exp. (126), e56290, doi:10.3791/56290 (2017).

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