Summary
ב פרוטוקול זה, נדגים היישום של אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה להבהיר את מבנה מיטוכונדריאלי בשריר טיסה עקיף דרוזופילה .
Abstract
המיטוכונדריה הם תחנות כוח הסלולר לייצר ATP, ליפידים ו מטבוליטים, כמו גם לווסת הומאוסטזיס סידן ומוות תא. Ultrastructure ייחודי עשיר cristae קרום כפול של אברון זה מסודר באלגנטיות כדי לבצע פונקציות מרובות על-ידי חלוקה למחיצות של מולקולות. Ultrastructure מיטוכונדריאלי קשורה בטבורה עם פונקציות שונות; עם זאת, הפרטים הקטנים של מערכות היחסים הללו מבנה פונקציה הם רק ההתחלה ראוייה. . הנה, נדגים היישום של אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה להבהיר את מבנה מיטוכונדריאלי בשריר טיסה עקיף דרוזופילה . טומוגרפיה סדרתי-סעיף אלקטרון עשוי להיות מותאם כדי ללמוד כל המבנה התאי של שלושה ממדים.
Introduction
מיקרוסקופ אלקטרונים הוא כלי חשוב ללמוד את ההקשר המבני של הרכבות subcellular ואת organelles לבצע תהליכים תאיים. פותחו שיטות כדי לשמר ultrastructure של רקמות או תאים או על ידי קיבוע כימי עם aldehydes או על ידי לחץ גבוה קפוא (HPF) ואחריו להקפיא החלפת (FS)1,2. הבלוקים הדגימה מוטבע ייתכן ואז להיות למחלקה, צבעונית, נצפתה עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). הדגימה HPF יכול גם לעבד בתנאי הקפאה, כגון על ידי חלוקתה הקפאה או יון ממוקדת קרן (שיקרתי) כרסום, שנצפה על ידי הקפאה-EM3,4.
למרות סעיף דק EM מספק תובנות מורפולוגיות אינפורמטיבי, תמונות דו-ממדיות וכתוצאה מכך יכול לחשוף רק את ultrastructure של חתך מסוים. איך ultrastructure מאורגן תלת-ממדי נשאר מעורפל. על מנת להמחיש ultrastructure הסלולר בשלושה ממדים, פותחה שיטת טומוגרפיה אלקטרון שבו סדרה של תמונות הטיה היו רכשה, מוקרן בחזרה כדי ליצור שחזור טומוגרפי5 (איור 1). סדרה הטיה זוגי ניתן לאסוף על ידי סיבוב המדגם 90° ורכישת סדרה הטיה השניה. הדבר יצמצם את חפצי טריז-חסר לגרום מזוויות דגימה מוגבל ומשפרים ברזולוציה של tomogram...
כאן, אנו מתארים את היישום של אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה ללמוד ultrastructure מיטוכונדריאלי דרוזופילה טיסה עקיף שריר (IFM)6,7,8,9 . על מנת לקבל שחזורים תלת-ממד כיסוי כל המיטוכונדריה (כ 2.5 מיקרומטר-עבה), סעיפים טורי התקבלו מבלוקים רקמות IFM דרוזופילה . Tomograms של כל אחד מהמקטעים נאספו בנפרד באמצעות תוכנה איסוף נתונים אוטומטי. שחזורים טומוגרפי נוצרו, tomograms טורי הצטרפו עם החבילה IMOD כדי לקבל נפח המשוחזרת מיטוכונדריון כולו. Tomograms הצטרף נותחו על ידי תוכנה תלת-ממד. הצפיפויות של cristae מיטוכונדריאלי היו מחולקים כדי ליצור מודל פילוח חשף הארגון שלושה ממדים.
Protocol
1. סעיף דרוזופילה רקמות באמצעות מיקרוטום רוטטת להב
- עזים ומתנגד דרוזופילה על קרח, לטבול כל זבוב אחד ב- 1 מ"ל של 4% agarose ההיתוך נמוכה במאגר פוספט. לאפשר agarose לגבש על קרח. בדרך כלל, 4-6 זבובים עובדו.
- השתמש מיקרוטום להב רוטטת סעיף agarose ג'ל מוטבע דרוזופילה לתוך פרוסות בעובי 100 מיקרומטר, לטבול בתמיסה מקבע המכילה 2.5% גלוטראלדהיד במאגר פוספט 0.1 M.
הערה: Vibratome חלוקתה הוא מועדף בגלל האדריכלות רקמת נשאר שלם יותר לעומת שיטות אחרות. לחלופין, לנתח פינצטה ניתן לנתח IFM בתוך תמיסת מקבע המכילה 2.5% גלוטראלדהיד במאגר פוספט 0.1 M.
2. מכינים EM דגימות על ידי קירור בלחץ גבוה הקפאת שיטת החלפת (HPF/FS)
- רחץ רקמות ובסעיף 3 טיפות (~ 150 µL) מאגר פוספט, ואחריו 2 טיפות (~ 100 µL) פוספט מאגר עם 20% BSA. ואז מקם מקטעי זהב ספקים עבור HPF מלא BSA מאגר ו-20%.
- לטעון את המדגם המכיל נושאות בפריזר בלחץ גבוה לפי המדריך למשתמש.
- לאחר הקפאה, שחרור נושאות ממחזיק תחת חנקן נוזלי ולהעביר למכשיר ההקפאה-החלפת מקורר ל-140 מעלות צלזיוס.
- לבצע פרוטוקול ההקפאה-החלפת כפי שמוצג בטבלה 1, עם FS קוקטייל המכיל 2% גלוטראלדהיד, 2% אוסמיום ארבע-חמצני ו- 0.1% אצטט uranyl של אצטון.
- בזהירות להסיר דגימות של נשאים עם מחט, להטביע דגימות שרף בטמפרטורת החדר. פולימריזציה השרף-65 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
הערה: FS פרוטוקולים צריך להיות שונה כדי להכין סוגים אחרים של דגימות. HPF/FS הוא העדיף לשמר את ultrastructure ולצמצם האובדן של תוכן סלולרי.- לחלופין, להחיל פרוטוקול קיבוע כימי. את דגימות עם 2.5% גלוטראלדהיד בן לילה, לשטוף עם מאגרי מכן לתקן עם 1% אוסמיום ארבע-חמצני עבור 2 ח' לשטוף, מייבשים עם עולה ריכוזי אתנול, ואז לחדור ואת להטביע דגימות שרף של Spurr לפני polymerizing ב 65 מעלות צלזיוס במשך 16 h.
3. להכין את סידורי-קטעים של דגימות עבור אלקטרון טומוגרפיה
- חתוך את אבני הדגימה כדי לחשוף את הפנים הרצויה בלוק המכיל רקמות.
- Pretreat חלקיקי זהב (10 ננומטר בקוטר) עם 1% BSA במשך 30 דקות לשטוף והשהה חלקיקי זהב במאגר PBS. כיסוי חלקיקי זהב על רשתות חריץ נחושת מצופה פחמן סרט ליצירת סמנים fiducial.
- תחת TEM שיהיה מספקת סמנים fiducial (סמני לפחות 5-10) להכניס שדה הראייה של טומוגרפיה רכישה.
- חותכים מקטעים טורי, 200-250 ננומטר בעובי, באמצעות ultramicrotome.
- לאסוף מקטעים טורית על חריץ רשתות באמצעות לולאה מושלם עבור מקטעים דק.
- כתם הסעיפים עם עופרת ציטראט וריינולד למשך 10 דקות.
- כיסוי שכבה נוספת של חלקיקי זהב fiducial על הסעיפים.
4. איסוף כפול ממונעת אלקטרון טומוגרפיה
- לטעון את הרשת על גבי בעל ציר כפול טומוגרפיה והכנס לתוך המיקרוסקופ האלקטרוני שידור פועלים ב 200 kV.
- יישר את המיקרוסקופ על המוקד eucentric.
- להגדיר את התוכנה אוסף נתונים אוטומטית. התאם ויישר כשקרן האלקטרונים על ההגדרה הדמיה מידה מרובה. עיין המדריך למשתמש המבצע פרט10 (איור 2).
- רוכשים את המצלמה כהים ובהירים הפניות באזור ריק ללא פחמן סרט תחת ההגדרה של אוסף טומוגרפיה ממוחשבת.
- אוספים של רשת אטלס בהגדלה נמוכה. בחר המיטוכונדריה במקטעי טורי כמטרות לאוסף טומוגרפיה ממוחשבת.
- רוכשים סדרה הטיה מ-60 ° עד +60 ° עם 2 ° במרווחים על ציר-A עבור כל מטרה.
הערה: הזוויות הטיה מכנית מוגבלות על ידי העיצוב של בעל הדגימה. המחזיק יחסום את קרן בזווית הטיה גבוהה. - כדי לאסוף את הסדרה השנייה הטיה, לסובב את הדגימה מחזיק ב- 90°. רוכשים של האטלס החדש. בחר עמדות המקביל ולרכוש את הסדרה הטיה על ציר-B עבור כל מטרה.
הערה: חבילות תוכנה אחרות, כגון SerialEM ו- Xplore3D, הינם זמינים עבור איסוף נתונים אוטומטי.
5. 3D Tomograms לשחזר קטע המשנה של אמצעי אחסון באמצעות תוכנה
- לשחזר tomograms של הטיה כפול-ציר תמונות באמצעות תוכנת IMOD11.
- עיין המדריך למשתמש המבצע פרט.
- יישר את הסדרות הטיה בודדים לפי המיקומים של סמנים fiducial זהב. לשחזר tomograms השיטה חזרה הקרנה או באמצעות השיטה סימולטני איטרטיבי שחזור טכניקה (SIRT) עבור שניהם ציר-A וציר-B, בהתאמה (איור 3).
- לשלב tomograms של ציר-A וציר-B כדי ליצור tomogram כפול ממונעת עם החפץ טריז חסרים מופחת.
- הצטרפו יחד זוגיות ממונעת tomograms סעיפים טורי להשיג שחזורים כיסוי מיטוכונדריון כל אמצעי אחסון. מודל הפערים בין מקטעים טורי על-ידי התוכנית IMOD.
- חתוך את tomograms הצטרף ו- bin לגודל הרצוי עבור אמצעי האחסון פילוח.
- לנתח הצטרף tomograms סדרתי באמצעות תוכנות תלת-ממד.
- עיין המדריך למשתמש המבצע פרט.
- לסנן את tomograms עם מסנן לפי עקומת גאוס (או אחרות השיטה הרצויה) כדי לשפר את הניגודיות של תכונות רקע צפיפות.
- קטע של ultrastructure של המיטוכונדריה באופן ידני או אוטומטי.
- הצגת מודלים פילוח כדי לאפשר בדיקה ב- 3D.
- הפקת סרטים באמצעות כלים זמינים ב- 3D.
Representative Results
אנחנו מוחלים טומוגרפיה אלקטרון סדרתי-סעיף כדי לנתח תכונות מבניות של cristae מיטוכונדריאלי שמשקף מצב אנרגטי והזדקנות שלה. הראינו כי המיטוכונדריה של דרוזופילה IFM טופס משולב cristae ו מטריצת רשת ב- 3D (איור 4)7. בנוסף, זבובים מוטציה עם פגם שכפול ה-DNA מיטוכונדריאלי, פנוטיפ של הזדקנות מואצת שהצטברו המיטוכונדריה שהכיל סעיפים קטנים דמויי בצל מתערבל הליבה (איור 5)7.
איור 1: איור של אלקטרון שחזור טומוגרפיה מסידרה הטיה. בניסוי, בקרן אלקטרון הוא עבר עצם תלת-ממדי כאשר האובייקט מטים את דרגות שונות. עבור כל תנאי הטיה, הקרנה 2D שנוצר, שנתפסו עם מצלמה. ההשתקפויות 2D ואז מוקרנים חזרה לבנייה מחדש של העצם התלת-ממדי בהתבסס על המשפט המרכזי פרוסה. באיור, אותו תהליך מוצג עבור תמונה דו-ממדית המקורי המועבר לתוך מימד יחיד תחת זוויות הטיה שונים. ההשתקפויות 1 י משמשים לאחר מכן כדי לשחזר את התמונה 2D. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: איסוף נתונים אוטומטי- התצוגה מציג תמונה של התוכנה מציג הרי האטלס של רשת חריץ המכיל מקטעים טורי, סולם רב פילוח של המיטוכונדריה ונרכשה להטות תמונות. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר (לוח העליון השמאלי), 100 מיקרומטר (החלונית השמאלית התחתונה), 1 מיקרומטר (לוח נכון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: סדרתי-סעיף אלקטרון טומוגרפיה של מיטוכונדריון אחד בשריר טיסה עקיף דרוזופילה . Micrographs 2D (A) ו- (B) tomograms 3D ממקטעים טורי המכסים את כל נפח מיטוכונדריון. Tomograms (ג) הצטרף הסדרתי-בסעיף מוקרנים ליצור מקטע האורך, עם ציר z המוצגים אנכית. ראוי לציין, רקמות חלוקתה הוביל לאובדן של חומר, עוזב את הפערים בין tomograms המצורפים. סרגל קנה מידה = 500 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: משולב אינטרה-המיטוכונדריה cristae ורשת מטריקס חשף ב- 3D- (א) פרוסות של אלקטרון מיטוכונדריאלי שחזורים טומוגרפי מציג בוררי בין ממברנות מחליפי דרך ציר z. (B) איורים של cristae שנצפה מיתוג דפוסי ספירלות נכון בידיים ריקות ו/או שמאלי. (ג) פילוח טומוגרפי הממחישות לוליין שמאלי ב- 3D (D) Cristae מיתוג דפוסי מנותח, מעובד לצבע על מודל פילוח (E, F). פרוסה טומוגרפי מציג confluency מטריקס לרוחב (כהה צפיפויות, המסומנים באדום) על פני cristae ממברנות (צפיפות לבן). פילוח (G) מודל של tomogram ב (E) מציג confluency מטריקס לרוחב (באדום), נציג cristae (באפור). סרגל קנה מידה = 50 ננומטר (א), 200 ננומטר (ג), ו- 300 ננומטר (D, E, F, G). הדמות הייתה הדפסה מחדש של ג'יאנג. et al. 7 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: המיטוכונדריה עם ליבות מתערבל ובצל כמו שנצבר זבובים עם פגמים שכפול ה-DNA מיטוכונדריאלי במהלך ההזדקנות. פרוסות טומוגרפי נציג, פילוח המתאים (לוחות נכון) מציג תצוגת חתך הרוחב (למעלה) ונוף חתך (התחתון) של גרעין מתערבל. פילוח נפח מזוהה באמצעות עיבוד צבע שרירותי כדי להדגיש את ליבת מתערבל. סרגל קנה מידה: 200 ננומטר. הדמות הייתה הדפסה מחדש של ג'יאנג. et al. 7 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שלב | Temp | זמן | פתרון | |||
| 1 | -140 ° C ל-9 0 ° C | 30 דקות | חנקן נוזלי | |||
| 2 | -90 ° C | 96 hr | FS קוקטייל | |||
| 3 | -90 ° C עד C º 60 | 6 שעות (5 מעלות לשעה) | FS קוקטייל | |||
| 4 | -60 ° C | מזושן | FS קוקטייל | |||
| 5 | -60 ° C ל--25 ° C | 7 בית (5 מעלות לשעה) | FS קוקטייל | |||
| 6 | -25 ° C | מזושן | FS קוקטייל | |||
| 7 | --25 ° C עד 0 ° C | 5 hr (5 מעלות לשעה) | FS קוקטייל | |||
| 8 | 0 ° צלזיוס | בית 1 x 3 פעמים | אצטון | |||
| 9 | חדר temp | הסתננות שרף | ||||
טבלה 1: ההקפאה-החלפת פרוטוקול.
Discussion
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים זרימת עבודה מיטביים להחלת סדרתי-סעיף אלקטרון טומוגרפיה ללמוד 3D ultrastructure מיטוכונדריאלי של שריר טיסה עקיף דרוזופילה . שימור ultrastructure במדגם הוא האתגר הטכני העיקרי עבור סוג זה של ניתוח. על מנת לשמר בצורה הטובה ביותר ultrastructure שני מתודולוגי נכללו צעדים. ראשית, רקמות. בדקנו על ידי חלוקתה עם רטט מיקרוטום להב על מנת לשמור על הארכיטקטורה רקמות ככל האפשר שנית, פרוטוקול HPF/FS אופטימלי כדי לשמר את אברון ultrastructure במהלך הכנת גושי הדגימה מוטבעים. דגימות קפאו בלחצים גבוהים, אשר מוריד את נקודת קיפאון של מים ומפחית היווצרות של גבישי קרח נזק ultrastructure1. דגימות עבה כמו 0.1 מ מ יכול להיות vitrified באופן מיידי, נתון ואז להקפיא החלפת להפקת בלוקים הדגימה לבדיקה EM. שימור משופרת של ultrastructure על ידי HPF/FS צוין, לעומת שיטות קיבוע כימי. באמצעות סדרת צעדים עבור הכנת הדוגמא, שימור ממברנות זוגי מיטוכונדריאלי וממברנות cristae היה השתפרו באופן דרמטי.
קבלת מקטעים טורי של הדגימה היא הצעד המאתגר ביותר של השיטה. כפי כשקרן האלקטרונים מוגבל כוח חדירה, העובי של הסעיף היא מוגבלת או 250 ננומטר או 500 ננומטר באמצעות TEM פועל ב 200 kV או 300 kV, בהתאמה. בגלל העובי של מיטוכונדריון עשוי להיות יותר מ 2 מיקרומטר, סעיפים טורי נדרשים להשיג שחזורים בפול ווליום. עם זאת, שחזור מספר מספיק של טורי מקטעים כדי להתפרס על אברון כולה היא אתגר טכני. זמירה פני בלוק להיות שטוח ככל האפשר בין הבסיסים של טרפז באפשרותך לאפשר רשת חריץ להכיל מקטעים נוספים, ובכך מכסה אחסון גדולים יותר. בנוסף, באמצעות לולאה מושלם עבור מקטעים דק גדל שיעור ההצלחה של העברת הסעיפים טורי לרשת.
טומוגרפיה סדרתי-סעיף אלקטרון יכול להתבצע באמצעות ציוד סטנדרטי של הליבה EM. אולם, השיטה יש כמה מגבלות נמנע מהתבטאויות אילוצים טכניים. אחד הוא חומר זה נמצא באופן בלתי נמנע לאיבוד בין מקטעים טורי, עוזב פערים שחזור המצורפים. השני הוא החפץ טריז חסר, אשר מתעורר עקב הזוויות ההטיה מוגבלת זה השגה. הגבלה זו מתרחשת כיוון לא פנה בעל הדגימה סיבוב מלא בלי לחסום את קרן אלקטרונים. למרות מגבלות אלו, טומוגרפיה סדרתי-סעיף אלקטרון מספק רזולוציה מספיק כדי לחשוף את ultrastructure הסלולר והדואר אברון ב- 3D.
עבור הדמיה בקנה מידה קטן יותר, הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה היא טכנולוגיה מתפתחים יכול לשמש כדי להשיג את המבנה של macromolecular מתחמי וההרכבות בחיי עיר ברזולוציה ננומטר או תת אנגסטרום בשילוב עם תת-טומוגרפי שחזור3. ביישום זה, התאים הם מדולל על ידי חלוקתה או יון ממוקדת קרן כרסום תחת חנקן נוזלי. Tomograms נאספים בתנאים-הקפאה שבו מבנים מולקולריים נשמרים קרוב למצב מקורי ללא קיבוע כימי, התייבשות או הטבעה. בקצה השני של הסקאלה, לנתח אמצעי אחסון רקמות גדולים על חשבון ברזולוציה, מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה פרצוף-בלוק טורי הוא מודאליות מושך למרות זה דורש מכשיר ספציפי4.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
המחקרים בוצעו הליבה EM-מכון של הטלפון הסלולרי וביולוגיה אורגניזם, ליבת הקפאה-EM אקדמיה Sinica, טאיפיי, טייוואן. העבודה נתמך על ידי האקדמיה Sinica ואת רוב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
| high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
| freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
| ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
| dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
| transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
| CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
| Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
| Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |
References
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice. J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
- Soto, G. E., et al. Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures. Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).
- Jiang, Y. F., et al. Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging. SciRep. 7, 45474 (2017).
- Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality. TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).
- Friedman, J. R., Nunnari, J. Mitochondrial form and function. Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
