Summary
이 프로토콜, 초파리 간접 비행 근육의 미토 콘 드리 아 구조를 명료 하 게 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램 보여 줍니다.
Abstract
미토 콘 드리 아 ATP, 지질, 및 대사 산물, 뿐만 아니라 칼슘 항상성 및 세포 죽음 통제 세포 강국은. 이 세포 기관이의 독특한 cristae 풍부한 이중 막 열 대권 외 우아하게 생체를 분할 하 여 여러 기능을 수행 하기 위해 배열 된다. 열 대권 외의 미토 콘 드 리아는 연결 되어 속속들이 다양 한 기능; 그러나, 이러한 구조-기능 관계의 좋은 정보는 설명에 시작 됩니다. 여기, 우리가 초파리 간접 비행 근육의 미토 콘 드리 아 구조를 명료 하 게 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 직렬 섹션 전자 단층 촬영 3 차원에서 어떤 세포질 구조 연구에 적용할 수 있습니다.
Introduction
전자 현미경 subcellular 어셈블리 및 세포질 과정을 수행 하는 세포의 구조적 맥락을 연구 하는 귀중 한 도구입니다. 방법은 알데하이드와 화학 기정에 의해 조직이 나 세포의 열 대권 외를 보존 하기 위해 개발 되었습니다 또는 높은 압력에 의해 대체 (FS)1,2동결 동결 (HPF) 다음. 포함 된 견본 블록 있습니다 수 sectioned, 스테인드, 그리고 전송 전자 현미경 (TEM)으로 관찰 합니다. HPF 표본 수 또한 처리 cryo-조건 같은 곳을 알아내는 단면 또는 집중 된 이온 빔 (FIB) 밀링, 및 곳을 알아내는-EM3,4에 의해 관찰.
얇은-섹션 안에 유익한 형태학 통찰력 제공, 하지만 결과 2D 이미지만 특정 횡단면의 열 대권 외를 밝힐 수 있다. 3D 볼륨에서 열 대권 외의를 구성 하는 방법을 가려진 남아 있습니다. 세포 열 대권 외의 3 차원에서 시각화를 위해서는 전자 단층 촬영 방법 틸트 이미지의 시리즈 인수 하 고 다시 단층 촬영 개조5 (그림 1)을 생성 하 예상 했다 개발 되었다. 이중 기울기 시리즈 샘플 90 °를 회전 하 고 두 번째 기울기 시리즈를 취득 하 여 수집할 수 있습니다. 이 제한 된 샘플링 각도에서 발생 하는 tomogram의 해상도 개선 누락 쐐기 아티팩트 최소화 됩니다.
여기, 우리는 초파리 간접 비행 근육 (IFM)6,7,,89 의 열 대권 외의 미토 콘 드리 아 연구 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램 설명 . 3D 복원 전체 미토 콘 드리 아 (약 2.5 µ m 두께) 취재를 얻으려면 직렬 섹션 초파리 IFM 조직 블록에서 얻은 했다. 각 섹션의 Tomograms 자동 데이터 수집 소프트웨어를 사용 하 여 개별적으로 수집 했다. 단층 촬영 개조 했다 생성 하 고 직렬 tomograms를 전체 mitochondrion의 재건된 볼륨 아이 모드 패키지와 함께 합류 했다. 결합 된 tomograms는 3D 소프트웨어에 의해 분석 되었다. Cristae 미토 콘 드리 아의 밀도 3 차원에서 조직 공개 세분화 모델을 생성 하 세그먼트 했다.
Protocol
1. 섹션 초파리 조직을 진동 블레이드 톰을 사용 하 여
- 얼음에 초파리 를 anesthetize 하 고 인산 염 버퍼에 4% 낮은 녹는 agarose의 1 mL에 각 하나의 비행을 담가. 얼음에 공고히 agarose를 허용 합니다. 일반적으로, 4-6 파리 처리 되었습니다.
- 진동 블레이드 톰을 사용 하 여 섹션 agarose 젤에 포함 된 초파리 조각 100 µ m 두께 2.5%도 0.1 M 인산 염 버퍼에 포함 된 통 솔루션에 몰두.
참고: 조직 아키텍처 다른 방법에 비해 더 그대로 남아 있기 때문에 선호는 Vibratome 단면입니다. 또는, 핀셋을 해 부 2.5%도 0.1 M 인산 염 버퍼에 포함 된 통 솔루션으로 IFM을 해 부를 사용할 수 있습니다.
2. 준비는 고압 및 동결 대체 (HPF/FS) 방법으로 EM 표본
- 인산 염 버퍼, 2 방울 (~ 100 µ L) 20 %BSA 인산 염 버퍼의 다음의 3 방울 (~ 150 µ L)에서 조직 단면도 씻어. 다음 HPF 버퍼 및 20 %BSA 가득에 대 한 금 사업자에 섹션을 배치 합니다.
- 사용자 설명서에 따라 고압 냉동 고에 운반대를 포함 하는 샘플을 로드 합니다.
- 동결, 후 액체 질소 아래 홀더 사업자 놓고-140 ° c 냉각 동결 대체 장치에 전송
- 표 1, 2%도, 2% 오스뮴 tetroxide 그리고 아세톤에 0.1 %uranyl 아세테이트 칵테일 fs와 같이 동결 대체 프로토콜을 수행 합니다.
- 조심 스럽게 바늘으로는 표본 캐리어에서 제거 하 고 실 온에서 수 지에 견본을 포함. 16 h 65 ° C에서 수 지 유해
참고: FS 프로토콜 샘플의 준비를 수정 해야 합니다. HPF/FS는 열 대권 외의를 유지 하 고 세포 내용의 손실을 최소화를 선호 된다.- 양자 택일로, 화학 기정 프로토콜을 적용 됩니다. 표본 2.5%도 함께 하룻밤, 버퍼와 세척 고 1% 오스뮴 tetroxide 2 h. 세척에 대 한 해결 및 에탄올의 농도 오름차순으로 탈수와 다음 침투 고치고 16 65 ° C에서 polymerizing 전에 Spurr의 수 지에 견본을 포함 h입니다.
3. 전자 단층 촬영에 대 한 직렬-섹션은 견본의 준비
- 조직에 있는 원하는 블록 얼굴 노출 견본 블록을 잘라.
- 금 입자를 pretreat (10 nm 직경에서) 30 분 세척에 대 한 1 %BSA PBS 버퍼에 금 입자를 일시 중단 하 고. 표준 마커를 만드는 탄소 필름으로 코팅 된 구리 슬롯 격자에 금 입자를 오버레이 합니다.
- 단층 촬영 수집의 보기의 필드에 충분 한 표준 마커 (마커 적어도 5-10)를 가장 아래에서 확인.
- 두께 ultramicrotome를 사용 하 여 200-250 nm 직렬 섹션을 잘라.
- 슬롯 격자 얇은 섹션에 대 한 완벽 한 루프를 사용 하 여에 직렬 섹션을 수집 합니다.
- 10 분 동안 Reynold의 리드 시트르산과 섹션 얼룩.
- 섹션 상단 표준 금 입자의 두 번째 레이어를 오버레이 합니다.
4. 수집 이중 기울기 전자 단층 촬영
- 이중 축 단층 촬영 홀더에 그리드를 로드 하 고 200에서 전송 전자 현미경에 삽입 kV.
- Eucentric 초점에 현미경을 맞춥니다.
- 자동 데이터 수집 소프트웨어를 설정 합니다. 조정 하 고 다중 스케일 영상 설정에서 전자 빔 정렬. 작업 세부10 (그림 2)에 대 한 사용자 설명서를 참조 하십시오.
- 단층 촬영 컬렉션 설정에서 탄소 필름 없이 빈 영역에 카메라 어둡고 밝은 참조를 취득 합니다.
- 낮은 확대율에서 격자 아틀라스를 수집 합니다. 단층 촬영 컬렉션의 대상으로 직렬 섹션에 미토 콘 드리 아를 선택 합니다.
- 에 2 ° 증가와 60 °-60 °에서 기울기 시리즈를 취득 축-A 각 대상에 대 한.
참고: 기울기 각도 기계적으로 제한 될 견본 홀더 디자인. 홀더는 높은 기울기 각도에서 빔을 차단 됩니다. - 두 번째 기울기 시리즈를 수집 하려면 견본 홀더 90 ° 회전 합니다. 새로운 지도 획득 합니다. 해당 위치를 선택 하 고 각 대상에 대 한 축-B에 기울기 시리즈를 취득.
참고: 다른 소프트웨어 패키지, SerialEM 및 Xplore3D, 자동 데이터 수집을 위해 사용할 수 있습니다.
5. 3D Tomograms 재구성 및 세그먼트 하위 볼륨 소프트웨어를 사용 하 여
- 아이 모드 소프트웨어11를 사용 하 여 이중 축 기울기 이미지의 tomograms를 재구성 합니다.
- 작업 세부 사항에 대 한 사용자 설명서를 참조 하십시오.
- 골드 표준 마커의 위치에 의해 개별 기울기 시리즈를 맞춥니다. 모두 축 A에 다시 투영 메서드 또는 동시 반복적 재구성 기법 (SIRT) 메서드에서 tomograms를 재구성 및 축-B, 각각 (그림 3).
- 축-A의 tomograms 결합 축-b 감소 누락 쐐기 유물와 이중 기울기 tomogram 생성 하.
- 전체 mitochondrion 볼륨을 취재 하는 개조를 직렬 섹션의 더블-틸트 tomograms 함께 가입. 모델 아이 모드 프로그램에 의해 직렬 섹션 사이의 간격.
- 결합 된 tomograms 및 빈 볼륨 세분화에 대 한 원하는 크기 트림.
- 조인 된 직렬 tomograms 3D 소프트웨어를 사용 하 여 분석 합니다.
- 작업 세부 사항에 대 한 사용자 설명서를 참조 하십시오.
- 필터링 기능 대비 개선 하 고 배경 밀도 줄일 가우스 필터 (또는 다른 방법) tomograms.
- 수동 또는 자동으로 미토 콘 드리 아의 열 대권 외 세그먼트.
- 3d에서 검사 수 있도록 세분화 모델을 표시 합니다.
- 3D에서 사용할 수 있는 도구를 사용 하 여 영화를 생성 합니다.
Representative Results
우리는 직렬 섹션 전자 단층 촬영 cristae 미토 콘 드리 아의 구조 기능 분석에 그것의 에너지 상태와 노화 반영 하 적용. 우리 초파리 IFM의 미토 콘 드리 아 통합 형성 했다 cristae 및 매트릭스 3D (그림 4)7네트워크. 또한, 미토 콘 드리 아 DNA 복제 결함 및 가속된 노화 형 돌연변이 파리 양파 모양의 소용돌이 코어 (그림 5)7의 하위 섹션을 포함 하는 미토 콘 드리 아를 축적.
그림 1: 전자 단층 촬영 개조 기울기 시리즈에서의 일러스트. 실험에서 전자 빔은 개체를 다양 한도로 기울이면 3D 개체를 통해 전달 됩니다. 각 기울기 조건에 대 한 2D 투영은 생성 하 고 카메라와 함께 캡처. 2D 계획은 다시 중앙 조각 정리에 따라 3D 개체를 재구성 하 예상 됩니다. 그림에서 같은 프로세스는 다양 한 기울기 각도에서 단일 차원에 투영 하는 원래 2D 이미지 표시 됩니다. 1 D 계획 다음 2D 이미지를 재구성 하는 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 자동 데이터 수집. 직렬 섹션을 포함 하는 슬롯 격자의 아틀라스를 보여주는 소프트웨어의 이미지 뷰어 디스플레이, 미토 콘 드리 아의 대상으로 하 고 취득 다중 스케일 이미지 기울기. 눈금 막대 = 500 µ m (왼쪽된 상단 패널), 100 µ m (왼쪽된 하단 패널), 1 µ m (오른쪽 패널). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 직렬 섹션 전자 초파리 간접 비행 근육에 단일 mitochondrion의 단층 촬영. 2D 현미경 (A) 및 (B) 3D tomograms는 mitochondrion의 전체 볼륨을 덮고 직렬 섹션에서. (C) 조인 된 직렬 섹션 tomograms 섹션을 만드는 한 경도, 수직으로 표시 하는 z 축으로 투영 됩니다. 특히, 조직 단면 소재, 조인된 tomograms 사이의 격차를 떠나의 손실에 지도. 눈금 막대 = 500 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 내부-미토 콘 드리 아 cristae 및 매트릭스 네트워크 차원에서 통합. (A) 조각 z 축을 통해 플레이트 막 사이 스위치를 보여주는 미토 콘 드리 아 전자 단층 촬영 개조. (B) 스위칭 오른쪽 손으로 및/또는 왼손잡이 나선 패턴 관찰된 cristae의 삽화. (C) 단층 세분화 보여주는 3 차원 (D) Cristae 스위칭 패턴에에서 왼손잡이 나선 분석 하 고 세분화 모델 (E, F)에 색상 렌더링 했다. Cristae 막 (흰색 밀도)에 걸쳐 측면 매트릭스 confluency (어두운 밀도, 빨간색으로 표시)를 보여주는 단층 쪼 갠 다. (G) 세분화 보여줍니다 측면 매트릭스 confluency (레드) (E)에 tomogram의 모델 및 대표 cristae (회색)에서. 눈금 막대 = 50 nm (A), 200 nm (C), 그리고 300 nm (D, E, F, G). 그림은 장 외 에서 무단 전재 7 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 양파 모양의 소용돌이 코어와 미토 콘 드리 아 노화 중 미토 콘 드리 아 DNA 복제 결함을 가진 파리에 축적. 대표적인 단층 조각 고 보여주는 횡단면 뷰 (위)와 소용돌이 코어의 경도 섹션 보기 (아래) 해당 세분화 (오른쪽 패널). 볼륨 세분화는 소용돌이 코어를 강조 하기 위해 임의의 색상 렌더링으로 표시 됩니다. 눈금 막대: 200 nm. 그림은 장 외 에서 무단 전재 7 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 단계 | 온도 | 시간 | 솔루션 | |||
| 1 | --9 0 ° C 140 ° C | 30 분 | 액체 질소 | |||
| 2 | -90 ° C | 96 시간 | FS 칵테일 | |||
| 3 | -90 ° C ~-60 ° C | 6 시간 (5 ° C/hr) | FS 칵테일 | |||
| 4 | -60 ° C | 12 시간 | FS 칵테일 | |||
| 5 | -60 ° C ~-25 ° C | 7 시간 (5 ° C/hr) | FS 칵테일 | |||
| 6 | -25 ° C | 12 시간 | FS 칵테일 | |||
| 7 | -25 ° C에 0 ° C | 5 시간 (5 ° C/hr) | FS 칵테일 | |||
| 8 | 0 ° C | 1 시간 x 3 회 | 아세톤 | |||
| 9 | 방 온도 | 수 지 침투 | ||||
표 1: 동결 대체 프로토콜입니다.
Discussion
이 프로토콜에서 우리는 직렬 섹션 전자 단층 촬영 3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 초파리 간접 비행 근육의 연구에 적용 하기 위한 최적화 된 워크플로 설명 합니다. 샘플에서 열 대권 외의 보존은 분석의이 유형에 대 한 기본 기술 도전 이다. 위해 최고의 열 대권 외의 두 방법론 단계 포함 되었습니다. 첫째, 조직 조직 아키텍처를 가능한 한 많이 유지 블레이드 톰을 진동으로 단면에 의해 샘플링 되었다. 둘째, HPF/FS 프로토콜 포함된 견본 블록의 준비 하는 동안 세포 기관이 열 대권 외의를 유지 하기 위해 최적화 되었다. 표본 높은 압력, 물의 어는 점을 손상 열 대권 외1얼음 결정의 형성을 감소 시킨다는 동결 했다. 표본으로 0.1 m m 두께 즉시 vitrified 고 EM 분석을 위한 견본 블록을 생성 하는 대체 동결 대상이 될 수 있습니다. HPF/FS로 열 대권 외의 향상 된 보존, 화학 고정 방법에 비해 지적 했다. 이 일련의 단계를 사용 하 여 샘플 준비, 미토 콘 드 리아 이중 막과 cristae 막의 보존 극적으로 개선 되었다.
시료의 직렬 섹션을 얻는 방법의 가장 어려운 단계입니다. 으로 전자 빔 침투 전력 제한, 섹션의 두께 어느 250 또는 500 nm 200에서 가장을 사용 하 여 k v 또는 300 kV, 각각. mitochondrion의 두께 이상의 2 µ m 일 수 있으므로 직렬 섹션 전체 볼륨 복원을 얻기 위해 필요 합니다. 그러나, 전체 세포 기관이 되도록 직렬 섹션의 충분 한 수를 복구 하는 것은 기술 도전 이다. 트리밍는 사다리꼴의 기초 사이 가능한 평면 수 블록 얼굴 슬롯 눈금 더 많은 부분을 수용 하 고 따라서 더 큰 볼륨을 커버 수 있습니다. 또한, 얇은 섹션에 대 한 완벽 한 루프를 사용 하 여 직렬 섹션 그리드 전송 성공률을 증가 합니다.
표준 안에 핵심 장비와 직렬 섹션 전자 단층 촬영을 수행할 수 있습니다. 그러나, 메서드는 기술적 제한에서 발생 하는 몇 가지 피할 수 없는 제한이 있습니다. 하나는 자료 직렬 섹션, 조인된 재건에 격차를 떠나 사이 필연적으로 손실입니다. 두 번째 달성 제한 기울기 각도 때문에 발생 하는 누락 된 쐐기 유물이 이다. 이 제한에는 견본 홀더 전자 빔 차단 하지 않고 전체 회전에 설정할 수 없습니다 때문에 발생 합니다. 이러한 제한에도 불구 하 고 직렬 섹션 전자 단층 세포와 세포 기관이 열 대권 외의 차원에서 공개를 충분 한 확인을 합니다.
작은 규모 이미징, cryo 전자 단층 촬영은 고분자 복합물 및 어셈블리에 현장에서 함께 하위 단층 또는 하위 angstrom 해상도 구조를 사용할 수 있는 신흥 기술 재건축3. 이 응용 프로그램에서 셀 단면 또는 집중 된 이온 빔 액체 질소에서 밀링 thinned 있다. tomograms 분자 구조는 화학 고정, 탈수, 또는 포함 하지 않고 기본 상태에 가까운 유지 하는 곳을 알아내는-조건 하에서 수집 됩니다. 규모의 다른 쪽 끝에 해상도, 비용 큰 조직의 볼륨을 분석 하 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 법은 매력적인 적임 비록 특정 악기4필요 합니다.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
연구는 세포 연구소와 Organismic 생물학에서 EM 코어와 학계 Sinica, 타이 페이, 대만의 곳을 알아내는-엠 코어에서 수행 했다. 작품은 학계 Sinica 및 대부분에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
| high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
| freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
| ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
| dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
| transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
| CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
| Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
| Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |
References
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