Disección y la cultura de explante de Allantois murino para el análisis In Vitro del accesorio alantoideo

Summary

Se describe un ensayo en vitro al accesorio corioalantoideas de modelo, el primer paso en la formación de la placenta. El protocolo muestra la cultura disección y explante de murinos allantoides de la integrina α4β1 inmovilizados. Accesorio de la alantoides se evalúa microscópicamente en momentos predeterminados.

Abstract

La placenta es fundamental para el crecimiento y desarrollo de los embriones mamíferos. Por esta razón, numerosas alteraciones genéticas e insultos también ambientales probables que perturbe el desarrollo de la placenta o función pueden causar la pérdida temprana del embarazo en ratones y seres humanos. Sin embargo, se carecen de ensayos simples en vitro para detectar posibles efectos en la formación de la placenta. Aquí, nos centramos en el primer y fundamental paso en la formación de la placenta, que consiste en la fijación de la alantoides en el corion de modelado. Se describe un método para evaluar rápidamente el accesorio de explantes alantoideo de la integrina α4β1 inmovilizados, que sirve como un substrato chorio-mimético. Este enfoque en vitro permite una evaluación cualitativa de la fijación y propagar el comportamiento de los explantes de allantois múltiples en diferentes momentos consecutivos. El protocolo puede utilizarse para investigar el efecto de las mutaciones de ratón específicos, drogas o diversos factores ambientales que se han relacionado con complicaciones del embarazo o pérdida fetal en el alantoides accesorio ex vivo.

Introduction

La placenta es indispensable para el crecimiento embrionario y desarrollo en el ambiente uterino. Constituye la interfaz para oxígeno, metabolitos y nutrientes intercambio entre la circulación fetal y materna y también funciona como un órgano endocrino e inmunológico. Cualquier insulto endógeno o exógeno que deteriora el desarrollo placentario puede conducir a retraso de crecimiento intrauterino, pérdida fetal o complicaciones del embarazo, tanto en ratones como en seres humanos¹. Mientras que el número de mutaciones de ratón específicos causantes de la fisiología placentaria anormal continúa aumentando², con 219 genotipos actualmente listados en el sitio web de informática de genoma de ratón (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), muchos de estos fenotipos no están bien entendidas desde un punto de vista mecanicista. Además de alteraciones genéticas, fármacos de molécula pequeña, anticuerpos monoclonales, toxinas, patógenos, exceso metabolitos o diversos agentes ambientales pueden afectar desarrollo de placenta y función^{3,4,5 , 6 , 7}. sin embargo, simple en vitro ensayos que pasos críticos del modelo en el desarrollo de la placenta son escasos.

Desarrollo placentario murino se inicia en el midgestation temprano, cuando el alantoides (precursor del desarrollo del cordón umbilical) emerge desde el extremo posterior del embrión como un brote que crece hacia el corion⁸. Chorioadhesive las células en la capa externa de la yema alantoidea median el accesorio y separarse de la alantoides en la superficie del corión (corioalantoideas "fusión"). El corion posteriormente dobla en las vellosidades en las que crece la vasculatura de la alantoides para formar el laberinto, la capa interna de placenta donde se intercambian nutrientes y oxígeno entre la sangre materna estrechamente yuxtapuestas sinusoides y vasos embrionarios^{9 ,10}.

La fijación de la alantoides al corión es el paso inicial y fundamental en la formación del laberinto, y defectos en este proceso se encuentran entre las causas más comunes de mortalidad embrionaria en el midgestation¹. Aunque un número de mutantes de ratón se ha descrito donde corioalantoideas accesorio no ocurren¹⁰, y la base de datos MGI enumera actualmente 108 mutantes de ratón que se caracterizan por la fusión anormal corioalantoideas (http:// www.informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), la interacción intercelular entre el vascular cell adhesión molecule-1 (VCAM-1, expresado en el mesodermo alantoideo) y la integrina α4β1 (expresado en el mesotelio coriónico, que es derivado de mesoderm extraembrionarias) parece ser indispensable para la fijación corioalantoideas y fusión^11,12,13. La coloración de Immunohistochemical de montaje en todo tipo de salvaje embriones ha mostrado que VCAM-1 se expresa dentro de los dos tercios distales del tallo alantoideo por día aproximadamente embrionario (E) 7.5¹³ (1-4 etapa de somite), y que su expresión sigue siendo alta durante corioalantoideas apego y fusión^11,12. Normalmente se detecta fallo de accesorio alantoideo en el corion por análisis histológicos del útero brotes. Sin embargo, los tamaños alantoides son fisiológicamente muy variables entre y dentro de camadas de la misma etapa de desarrollo¹⁴y allantois solamente puede conectar al corion cuando ha alcanzado un tamaño suficiente para hacer contacto físico. Reflejando esta variabilidad natural, corioalantoideas accesorio ocurre en algún momento entre ~ E 8.0 y 9.0 E en el úteroy una evaluación estadísticamente fiable de este proceso por histología, por tanto, es dependiente en el análisis de un gran número de conceptuses obtener suficientes muestras en la etapa de desarrollo apropiada.

Aquí, describimos un método para evaluar apego alantoideo ex utero que es menos dependiente en tamaño del alantoides. Demostramos la disección de embriones de ratón y sus allantoides de los úteros de ratones embarazadas ~ 8 días post coitum (dpc; dpc 0.5 señala la detección de un tapón vaginal), y la posterior cultura del alantoides explantes de α4β1 inmovilizados integrinas. Este método permite una evaluación rápida y funcional de la fijación y propagar el comportamiento de los explantes de allantois múltiples en paralelo y en diferentes momentos sucesivos. El protocolo puede ser utilizado para detectar los efectos de las mutaciones específicas, drogas o diversos factores ambientales sobre alantoides accesorio ex vivo.

Protocol

Cría de ratón fue aprobado por el Regierung Unterfranken, y todos los análisis se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con todos los alemanes y la Unión Europea las leyes y reglamentos sobre uso y cuidado de animales de laboratorio.

1. capa de microtitulación las placas con la integrina α4β1 Ex útero alantoides explante cultura

1. Reconstituir la integrina α4β1 murino liofilizado 200 μg/ml en tampón fosfato salina (PBS). Diluir hasta una concentración final de 10 μg/mL en precalentado (37 ° C) PBS. Pipetear 20 μL/pocillo de la solución de la integrina α4β1 diluido en el número de pocillos de una placa de microtitulación (alantoides 1/pocillo).
   Nota: Evite la formación de burbujas de aire al recubrimiento de los pocillos de la microplaca.
2. Incubar las placas de microtitulación durante 60 min a 37 ° C por colocarlos en una incubadora humidificada cultivo de tejidos.
3. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante con una pipeta. Usar una succión suave e inclinar la placa para evitar tocar el fondo del pozo con la punta de la pipeta. Lavar los pocillos dos veces añadiendo 50 μl de medio de cultivo de precalentado (37 ° C) como de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) y quitarlo del medio de lavado por succión suave.
4. Paso crítico: bloque gratis sitios de Unión mediante la adición de 50 μL/pocillo de 0.1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) / DMEM e incube durante ≥ 30 min a 37 ° C mediante la colocación de las placas de microtitulación en una incubadora humidificada cultivo de tejidos.
   Nota: Explantes alantoides pueden unir a varias superficies en presencia de suero. Por lo tanto es imperativo para bloquear sitios de Unión inespecífica, después de cubrir los pozos con la integrina y antes de agregar el alantoides disecada para explantación cultura contiene suero en medio (ver paso 4.4).
5. Mantenga los pocillos recubiertos en la solución de bloqueo a 37 ° C hasta que se necesite en el paso 4.4.

2. útero disección de un ratón embarazada en Dpc 8

Nota: Reducir las tasas de falsos positivos embarazo peso ganancia discriminación¹⁵.

1. El ratón de sacrificio mediante dislocación cervical. Desinfectar la capa en la zona abdominal mediante pulverización con etanol al 70% (v/v).
   Nota: Lleve guantes al manipular ratones. Eutanasia por dislocación cervical sin anestesia evita la contaminación química de la alantoides, que pueden interferir con el accesorio de la alantoides.
2. Haciendo una pequeña incisión en la línea media con unas tijeras para abrir la piel abdominal. Use los dedos enguantados para sostener la piel por encima y por debajo de la incisión y separe la piel hacia el pecho y la cola del ratón.
3. Agarre el peritoneo con pinzas. Con la otra mano, hacen una incisión en forma de V desde anterior hacia posterior con unas tijeras y mueva el tejido para exponer la cavidad abdominal. Use las pinzas para empujar los intestinos a un lado para acceder al útero.
4. Localice los dos cuernos uterinos. Sostenga el cuello del útero (el segmento caudal) con pinzas y corte los ligamentos con tijeras finas. Luego separar ambos cuernos uterinos, cortar los oviductos con tijeras.
5. Utilice pinzas para transferir al útero en un plato de 10 cm estéril que contiene estéril, PBS de temperatura (RT). Eliminar el tejido adiposo, vasos y nervios que rodean los cuernos uterinos con finas pinzas o tijeras (figura 1A).

3. embrión disección

Nota: Realice los siguientes pasos bajo un estereomicroscopio equipado con una gama zoom 8:1.

1. Separar los embriones por el corte entre los sitios de implantación con las tijeras. Sujete la guarnición uterina muscular de los cogollos de útero con pinzas y tire de ella aparte para exponer la decidua (figura 1B).
2. Con unas pinzas, transferencia de los brotes del útero en una nueva placa de 10 cm que contienen estéril, RT PBS.
3. Fijar la decidua en el embrión con las puntas del fórceps.
4. Hacer una incisión en la parte de anti-mesometrial de la decidua con pinzas finas (figura 1) y retire la decidua con fórceps para exponer el embrión (figura 1).
   Nota: El polo mesometrial de la decidua está altamente vascularizado y puede ser más ancho en su base que la parte anti-mesometrial, que contiene el embrión y aparece más pálido.
5. Diseccionar el embrión con el fórceps (Figura 1E, F).
6. Usando una cuchara de micro, transferir el embrión en una gota de PBS estéril contenida en un recipiente estéril de 3,5 cm.
7. Transferir el embrión en una dulce gota de PBS en el mismo plato de 3,5 cm con una cuchara de micro y disecar el embrión del saco de yema de huevo con unas pinzas (figura 1, H).
8. Opcionalmente, si es necesario (por ejemplo, para la genotipificación por reacción en cadena de polimerasa), traslado del saco de yema de huevo en un tubo estéril aspirando con ~ 5 μl PBS en una punta de pipeta de orificio grande 200 μl. Almacenar a-20 ° C.
   Nota: Tejido materno (es decir, el saco vitelino parietal como membrana de Reichert y el cono de ectoplacental) que podría contaminar la preparación saco vitelino puede conducir a resultados erróneos de genotipificación. Eliminación de estos tejidos es más fácil antes de la disección del embrión desde el saco vitelino.

4. alantoides disección y cultura Ex Utero en la integrina α4β1 inmovilizados

1. Corte el alantoides desde su sitio de inserción basal en el extremo posterior del embrión con unas pinzas finas (figura 1 H).
2. Opcionalmente, si se requiere el desarrollo puesta en escena, contar los pares somite del embrión por inspección visual utilizando un microscopio equipado con óptica de contraste de fase y un 5 × 10 × objetivo.
   Nota: El embrión puede ser extendido con fórceps para facilitar el conteo del somite. Fusión y accesorio corioalantoideas ocurren entre E 8.0 y 9.0 E en embriones con pares ≥ 6 somite. Giro comienza en embriones con 6-8 pares de somite.
3. Pipeta de 40 μL/pocillo de DMEM suplementado con suero bovino fetal 10% (v/v), L-glutamina y antibióticos en el número requerido de prelacado pocillos de la placa (véase sección 1).
4. Recoger el alantoides flotante aspirando con ~ 5 μl PBS en un gran orificio de una pipeta de 200 μl. Transferencia 1 alantoides/bien.
5. Incubar el allantoides colocando las placas de microtitulación en una incubadora humidificada cultivo de tejidos (37 ° C, 5% CO₂) para p. ej., 6, 12 y 24 h. Para evitar interferencias con el accesorio de la alantoides, no se mueven las placas de microtitulación entre estos puntos de tiempo.
6. En cada momento, anotar accesorio alantoides (p. ej., no alantoides accesorio/flotante alantoides parcial o totalmente Unido; totalmente propagación alantoides) utilizando un microscopio equipado con óptica de contraste de fase contraste o diferencial de interferencia y un x 5 o 10 x objetivo (figura 2).
   Nota: Ejemplos representativos de allantoides recién aislados y totalmente conectados se muestran en la figura 2. Ex utero, la punta distal del allantoides aislados de ratones C57BL/6J de tipo salvaje se fija dentro de las 4-6 h (esto se denomina fijación parcial de la alantoides) y accesorio completo de allantois todo se logra dentro de ~ 12 h de la cultura. Por 18-24 h, el explante ha aplanado y asumió una forma circular (que se refiere como totalmente extendido alantoides) con CD31-positivo del plexo vascular^9,16.

5. confirmación la coloración de la alantoides Explanted de la célula endotelial marcador CD31

1. Aspire el medio de cultivo de los explantes de extensión completamente y fijar las células añadiendo 40 μL/pocillo de paraformaldehído al 4% (w/v) / PBS.
   Nota: Paraformaldehido es tóxico. Use guantes y gafas de seguridad para evitar contacto con los ojos y la piel.
2. Incubar por 10 min a temperatura ambiente y luego aspirar el sobrenadante. Lavar tres veces al agregar 40 μL/pocillo de PBS y quitarlo del medio de lavado por succión suave.
3. Permeabilizar las células y bloquear sitios de Unión inespecíficos mediante la adición de 40 μL/pocillo de 0,1% (v/v) suero de cabra normal BSA/10% Triton X-100/0.1% (w/v) (v/v) en PBS durante 30 min a RT. Wash dos veces añadiendo 40 μL/pocillo de PBS y quitarlo del medio de lavado por succión suave.
   Nota: El protocolo puede hacer una pausa durante la noche en este punto.
4. Mancha las células añadiendo 20 μL/pocillo de anticuerpos primarios anti-CD31 diluido 1:50 en 0.1% (p/v) BSA/PBS durante la noche a 4 ° C. Lavar tres veces al agregar 40 μL/pocillo de PBS y quitarlo del medio de lavado por succión suave.
5. Detectar anticuerpos primarios Unidos añadiendo 20 μL/pocillo de marcada con fluorescencia secundaria cabra anticuerpos anti rata diluido 1: 200 en 0.1% (p/v) BSA/PBS para 1 h en placas de microtitulación RT. proteger de la luz por envolver en papel de aluminio o colocando en una cámara oscura. Lavar tres veces al agregar 40 μL/pocillo de PBS y quitarlo del medio de lavado por succión suave.
6. Incrustar las células añadiendo 20 μL/pocillo de medio de montaje. Incubar durante ~ 1 h a temperatura ambiente hasta que haya solidificado el medio de montaje. Almacenar las placas de microtitulación a temperatura ambiente o a 4 ° C, protegido de la luz.
7. Imagen el plexo vascular de la alantoides explantes bajo un microscopio de fluorescencia equipado un × 5 o 10 × objetivo y filtros de fluorescencia adecuado.
   Nota: Imágenes representativas del plexo vascular CD31-positivo de un alantoides completamente propagación se muestran en la figura 3. Otros marcadores para el plexo vascular, tales como anticuerpos dirigen contra Flk-1, capitán, Tie-1 Tie-2 puede utilizarse o bien¹⁶.

Representative Results

Este protocolo describe un método para aislar y explante allantoides murino ex vivoy detalles de la evaluación cualitativa de la alantoides accesorio a la integrina α4β1, un proceso crítico en vivo corioalantoideas fusión. Los resultados representativos que se muestra en la figura 1A–H demuestran los pasos sucesivos de aislamiento alantoides a partir de útero durante el embarazo. Se retiran los tejidos maternos que rodean los cuernos uterinos, tales como tejido adiposo y vasos (figura 1A) y embriones se disecan desde el endometrio de forma escalonada después de la apertura hasta la capa muscular del útero (figura 1B- E). Posteriormente, se eliminan otros tejidos maternos como el parietal saco vitelino y el cono de ectoplacental (Figura 1E, F). Figura 1 - H muestra que la técnica implica la disección de la alantoides extraembrionarias del saco vitelino, otro tejido altamente vascularizado y extraembrionarias. Así, son en gran parte libres de contaminación maternos o embrionarios (extra) los tejidos distintos de la alantoides allantoides aislados según este protocolo.

Figura 2 muestra que el tamaño y forma de allantoides de embriones recién disecados en una sola camada pueden variar considerablemente¹⁴. Allantoides de C57BL/6J wildtype embriones disecados en 8.5 E tenían una morfología alargada en el 74% de los casos (45 de 61 embriones analizados), como se muestra en la figura 2 y figura 1 H. Sin embargo, en el 15% (9/61) de los embriones, el allantoides fueron notablemente más pequeños y más redondeado (ver referencia¹⁴) y el 11% (7/61) de los embriones no todavía formaba un alantoides visible en el momento de la disección. A pesar de las heterogéneas formas y tamaños en el momento a partir del alantoides explante cultura (figura 2, los paneles un–h), accesorio de alantoides y difusión completa de la integrina α4β1 inmovilizados se observó dentro de las 12 h en todas de los 54 allantoides recientemente aisladas disección de embriones de siete camadas. Sin embargo, las formas y tamaños de los explantes después de 12 h de la cultura fueron algo heterogéneo (figura 2), que refleja las diferentes morfologías alantoidea en el punto de partida del análisis.

La figura 3 muestra un immunocytochemical que manchaba para las células endoteliales CD31-positivo en allantoides completamente atados después de 24 h de explante cultura, que confirma que los explantes habían elaborado un plexo vascular por este momento, como esperado^{9 , 16}. tales culturas alantoides adherente se pueden utilizar para estudiar la formación de vasos sanguíneos en vitro⁹. Por lo tanto, los explantes de allantois metodología presenta rendimientos que pueden ser fácilmente cultivadas ex vivo, de acuerdo con previamente publican estudios experimentales^9,16.

El Protocolo establece el marco para la evaluación basada en la microscopía del accesorio de la alantoides en momentos predeterminados, tales como después de 12 h o 24 h de cultivo de explantes. Los resultados pueden ser evaluados de forma cualitativa (parcial/completa fijación o propagación completo en un momento dado, sí/no). Ya que el mismo explante puede visualizar repetidamente y anotó, este análisis refleja que las características de los allantois presentaron culturas en el tiempo. Además, la formación de un plexo vascular en explantes fijados y teñidos puede ser evaluadas (figura 3).

Figura 1: pasos de representante en la disección de la alantoides. Ver detalle (A) de un cuerno uterino aislado. Brotes del útero que contienen los embriones están marcados por las estrellas; tejido adiposo y vasos que rodean el cuerno uterino se observan en el lado izquierdo. (B) vista de la decidua (endometrio) después del retiro de la capa muscular del útero. Altamente vascularizado, mesometrial polo de la decidua está orientado a la izquierda, la parte de anti-mesometrial (marcada con una estrella) que contiene el embrión se orienta hacia la derecha. Lado (C) vista del polo anti-mesometrial disecada de la decidua (marcado con una estrella). La flecha indica la ubicación del embrión. (D) vista superior de conceptus (flecha) rodeado por el saco vitelino parietal después de retiro parcial de la decidua circundante. (E, F) Vistas representativas de los pasos posteriores en la disección del embrión (flecha). La punta de flecha indica el saco vitelino. En (E), el cono de ectoplacental (epc) es visible a la derecha. (G) disección parcial del embrión (flecha) del saco de yema de huevo (flecha). El alantoides es marcado con una estrella roja. (H) embrión aislado (flecha) con la alantoides (estrella roja). La posición donde el alantoides se reducirá desde su sitio de inserción basal en el extremo posterior del embrión se indica con una línea discontinua roja. Imágenes fueron tomadas en un estereomicroscopio con una gama zoom 8:1. Todas las barras de escala son 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: formas heterogéneas y tamaños de allantoides. Ocho allantoides (una–h) fueron aislados de embriones de una sola camada. Panel de la izquierda, allantoides inmediatamente después de la disección (0 h). Panel de la derecha, el mismo allantoides después de 12 h de la cultura de explante. Los explantes se unen firmemente, y se han extendido las células mesenquimales. Los explantes se circundaron para visualizar tamaño de explante. Imágenes fueron tomadas en un microscopio equipado con óptica de contraste de fase y un 5 × (panel de la izquierda) o un objetivo de 10 x (panel derecho). Todas las barras de escala son 500 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: formación del plexo Vascular en cultivos de explantes de allantois. Allantoides fueron disecados y explantados de la integrina α4β1 inmovilizados como se describe en el presente Protocolo. Explantes fueron cultivados durante 24 h, y las células endoteliales en el plexo vascular fueron teñidas con anticuerpos primarios anti-CD31 y etiquetado fluorescente anticuerpos secundarios. Las células endoteliales aparecen en verde. La imagen superior muestra el plexo vascular todo en la zona central de un explante de allantois representante. La imagen fue tomada en un microscopio equipado con óptica de fluorescencia y un objetivo de 5 x. Barra de escala, 500 μm. Los dos paneles inferiores son más imágenes de aumento de otro explante alantoides disecado y cultivadas en las mismas condiciones. Buque-como las estructuras y células endoteliales individuales pueden verse. Imágenes fueron tomadas en un microscopio confocal; escala de barras, 25 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En presencia de suero, que es una rica fuente de moléculas de matriz extracelular adhesiva Pro como la fibronectina, alantoides explantes concederá fácilmente a varios plástico, vidrio o filtro superficies^9,16. Por lo tanto, si del análisis realizado se pretende investigar específicamente el efecto de una modificación genética o cualquier otro tratamiento accesorio de la alantoides a inmovilizado α4β1, es fundamental para bloquear sitios de Unión inespecíficos (p. ej., con suero bovino albúmina) después cubriendo las superficies con integrina y antes de la incubación con suero que contiene los medios de comunicación.

La fijación inicial de allantois explantes a la integrina α4β1 inmovilizados es muy sensible al movimiento, y las placas de cultivo de tejidos, por tanto, se deben dejar sin perturbaciones durante un periodo de tiempo determinado (por ejemplo, por 12 h) antes de anotar el alantoides accesorio. Tenga en cuenta que el tiempo de contacto estable formación con el sustrato puede variar dependiendo de la cepa de ratón analizadas o la concentración de la integrina α4β1 inmovilizados.

El requisito de la intercelular VCAM-1/α4β1-interacción exitosa fusión corioalantoideas es firmemente establecida^11,12,13. Además, las moléculas de la matriz extracelular como fibronectina, colágenos y otras moléculas de interés pueden también inmovilizadas y utiliza como sustratos "chorio-mimético".

Corioalantoideas accesorio depende de la interacción intercelular de VCAM-1 y su socio Unión integrina α4β1. En el útero, accesorio corioalantoideas y fusión posterior sólo puede ocurrir cuando la alantoides ha ampliado suficientemente para hacer contacto con el corion. Dada la variabilidad fisiológica en tamaños de alantoides en una etapa de desarrollo particular, corioalantoideas apego y fusión llevará a cabo en algún momento entre E 8.0 y 9.0 E (gama, E 7,5 E 9.25)^14,16. Métodos de estudio específicamente el proceso transitorio del accesorio de la alantoides a la placa coriónica en el útero en el vida del ratón no están disponibles en el presentan. Más bien, análisis se centran sobre todo en la laboriosa determinación de fusión corioalantoideas por evaluación histológica de por ejemplo, alantoidea separarse en la superficie del corión y el desarrollo de la capa de laberinto en una sola, determinada previamente tiempo punto^11,12,13,16. Este análisis de punto final no pueden discriminar entre los defectos que son específicamente debido a la deteriorada fijación de allantois el corion y efectos dependientes del corion y es limitada por la variabilidad inherente en etapas de desarrollo del embrión y alantoideo tamaños. Como hemos comentado en Resultados del representante, la variabilidad fisiológica en tamaños de alantoides puede resultar en un retraso relativo en fusión corioalantoideas en ~ 26% de los embriones de tipo salvaje de C57BL/6J. Estadísticamente hablando, casi dos de cada siete ratones embarazadas por lo tanto hubiera sacrificado demasiado pronto (61 embriones de siete camadas, tamaño de camada promedio 8.7), que se traduce en la necesidad de un sustancial exceso de estudios de gran escala de la cría. Curiosamente, microsurgical experimentos han revelado que el corion es ya competente para fundirse con el alantoides en la 1 etapa de par de somite, y que el alantoides exhibe capacidad máxima fusión en embriones con 3-5 somite pares¹⁴. Por lo tanto, las células chorioadhesive de la alantoides son formados y funcionalmente competente antes de la fijación corioalantoideas real en vivo. Ex utero es el análisis de apego alantoides a ligandos inmovilizados, tal como se presenta aquí, por lo tanto, relativamente independiente de un tamaño dado de la alantoides. Por lo tanto, una de las ventajas de este método es que evita defectos en el alargamiento de la alantoides y se centra en el siguiente paso en la formación de la placenta, es decir, accesorio de chorioallantois. Así, este enfoque puede utilizarse para distinguir entre defectos en el alargamiento de la alantoides y el accesorio de chorioallantois en mutantes de ratón genético.

En contraste con el método tradicional de aspiración de allantois desde su punto de fijación al embrión mediante una pipeta de boca¹⁶, el protocolo actual utiliza un enfoque de corte manual y la alantoides es manejado posteriormente con puntas de pipeta de orificio grande . Una ventaja importante de aspiración de la alantoides es que este método evita la manipulación directa del tejido. Corte y manipulación de la alantoides pueden dañar las células chorioadhesive en la vaina externa del mesotelio alantoideo. Sin embargo, cortar el alantoides con el fórceps ha utilizado con éxito antes en cultivos ex vivo de tejidos pre-placental¹⁷, y la cinética del explante alantoideo accesorio y la morfología de las culturas explant se describen en el presente estudio son similares a los datos publicados que se basa en aislamiento del alantoides por aspiración¹⁶. Estos resultados sugieren que las células chorioadhesive están suficientemente bien conservadas al corte manual de la alantoides, y esa diferenciación de explante no es gravemente perturbado, como lo indica la formación de endothelia CD31-positivo. Directo también el corte de la alantoides ofrece la posibilidad de analizar sólo los dos tercios superiores de la alantoides que expresan VCAM-1¹³y asegura menos contaminación con células derivadas de saco vitelino, que tendría que ser cortado de la base de la alantoides después de allantois aspiración¹⁸.

Análisis ex útero de explante alantoideo adhesión a inmovilizado, la integrina α4β1 recombinante ofrece una lectura cualitativa de un paso importante, inicial que se requiere para corioalantoideas fusión, es decir, la interacción intercelular entre VCAM-1 expresada en el alantoides y la integrina α4β1 localizado el mesotelio coriónico, que se deriva del mesodermo extraembrionarias. Sin embargo, aunque estas moléculas de dos adhesión son reconocidas como jugadores de principio de fusión corioalantoideas, ~ 50% de embriones con mutaciones homocigóticas nocaut en integrina VCAM-1 o α4 se someten a fusión corioalantoideas en vivo^{11 ,12,13}. Debido a este penetrance incompleto, el ex vivo el método descrito en el presente Protocolo puede no ser suficiente para descartar un requisito para estas moléculas de dos adhesión en modelos genéticos con una falta de fusión corioalantoideas.

En condiciones fisiológicas, α4β1 integrinas están incrustadas en la membrana plasmática de trofoblastos coriónicas y se incorporan en una intrincada red de proteínas estructurales y de señalización que cooperar para regular la adhesión célula-célula (y célula-matriz) ¹⁹. como más reduccionista en vitro enfoques, la complejidad de la interfaz de enlace de VCAM-1 coriónica es modelar solamente en medida muy limitada por la integrina α4β1 inmovilizados. Además de la potencial falta de otros insumos importantes estructurales o señalización derivada del corión intacto en este sistema, es probable que sólo una fracción de las integrinas que son inmovilizadas en una superficie rígida, de dos dimensiones están presentes en el activo, conformación enlace competente, "abierto".

El método presentado aproxima el apego temprano y difusión paso de allantois hacia el corion y puede también Informe sobre el desarrollo del plexo vascular alantoideo infeccioso cuando se combina con el análisis de buque formación⁹. Sin embargo, el enfoque actual de modelo no la invasión del corión por brotación angiogénesis mediada por las células endoteliales alantoidea, ni refleja morfogénesis ramificación por el corion, que es un proceso esencial para la fusión corioalantoideas y el desarrollo posterior del laberinto placentario¹⁰.

Uso de contraste de fase o microscopio de interferencia diferencial combinado con (semi-) automatizado de análisis de imagen, el método presentado podría aplicarse en pantallas de gran escala para el análisis inicial de accesorio alantoideo retrasada o in vitro. Además del análisis de mutantes de ratón, el método puede ser de interés para los efectos de drogas, agentes patógenos, metabolitos o agentes ambientales accesorio alantoideo.

En numerosos mutantes de ratón, accesorio corioalantoideas no ocurre, aunque el alantoides y el corion parecen han desarrollado normalmente. Además, mutantes que muestran apego corioalantoideas defectos típicamente muestran penetrancia incompleta^1,2,10. Sería importante investigar si estos genes funcionalmente al parecer muy diferentes impactan vías moleculares comunes o procesos celulares. En proyección de imagen del alantoides explantes derivados mutantes de ratón tiene el potencial para dilucidar estos mecanismos. Por ejemplo, las células de la vaina externa de la alantoides disecado podrían ser etiquetadas con colorantes vitales fluorescentes (como DiI o DiO carbocyanine lipofílico trazadores^16,18) a imagen adhesión y difusión de eventos, o para rastrear celulares migración en tiempo real. Además, los reporteros fluorescentes que visualizar las proteínas citoesqueleto o adherencia pueden resultar informativo.

Recientemente, se ha descrito un sistema de cocultivo ex vivo para allantoides murinos accesorio pre y chorions, y este enfoque fue utilizado con éxito para investigar sucesos que ocurren después de corioalantoideas accesorio, como capa de laberinto formación¹⁷. El análisis de la eficiencia de fijación alantoides en inmovilizado chorions aisladas de varios (p. ej., modificado genéticamente) modelos de ratón pueden producir nuevos conocimientos sobre los jugadores moleculares y vías que rigen los primeros pasos en el desarrollo de la placenta murino.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-α4β1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
α4β1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine α4β1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca2+ and Mg2+.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
α-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.