Summary
本稿では、異物による酸化ストレスの検討のため住セルイメージ投射の遺伝子にコードされた蛍光レポーターの使用について説明します。この実験的アプローチでは、毒性学的酸化ストレス検査に用いられる従来の欠点の多くを回避しながら比類のない時空間分解能、感度、特異性を提供しています。
Abstract
酸化ストレスは一般に引用された毒性学的メカニズムが、それを研究する従来の方法に苦しむサンプル、潜在的なアイテムの紹介と、反応の特異性の欠如の破壊を含む、欠点の数関与する種。従って、非破壊、敏感なと具体的な方法を観察しより一般的に呼ばれる酸化ストレス、細胞内レドックスの摂動を定量化するための毒物学の分野で現在の必要性があります。RoGFP2 とハイパー、異物による酸化的応答を観察する生細胞イメージング研究で使用する 2 つの遺伝子にコードされた蛍光センサーの使用法を紹介します。roGFP2 は、ハイパー中グルタチオン酸化還元電位 (EGSH) である過酸化水素 (H2O2) を直接検出します。両方のセンサーは、トランスフェクションや伝達、経由でさまざまな種類の細胞に表現できるので、特定の細胞コンパートメントをターゲットすることができます。最も重要なは、これらのセンサーを用いた生細胞顕微鏡は、従来の方法を使用して可能ではない高の空間的で、一時的な解像度を提供しています。510 nm で順番に 404 によって励起され、両方の遺伝子にコードされた蛍光センサーの読み出しとして監視の蛍光強度の変化 nm、488 nm の光。このプロパティは、共通の顕微鏡によるアーチファクトの除去とセンサー式のセルの間の違いを補正する両方のセンサーのレシオ メトリックです。さまざまな共焦点イメージング システム、従来の広視野顕微鏡、プレートでの使用に適しており、所定の波長でエキサイティングで収集排出できる蛍光プラットフォームこの方法論を適用できます。読者。両方の遺伝子にコードされた蛍光センサーは、携帯電話の EGSHと H2O2世代リアルタイムで監視するさまざまなセルタイプおよび毒性学的研究で使用されています。ここで説明は、細胞の種類や酸化ストレスの細胞毒性評価に roGFP2 とハイパー用蛍光プラットフォーム間で広く適応可能である標準化された方法です。
Introduction
用語「酸化ストレス」は毒性のメカニズムとして頻繁に引用されまだ稀、この用語です具体的に説明されています。酸化ストレスは活性酸素、フリーラジカル、抗酸化剤分子の酸化によって引き起こされる損傷の生成を含むいくつかの細胞内プロセスを参照でき、特定のシグナリングの活性化もカスケードします。5 異物化合物自体のいずれかの直接作用によって酸化ストレスを誘導する広範な環境汚染物質1,2と医薬品3,4に記載されています。、6または細胞応答7,8,9,10の一部として酸化種の生産によって第二。だからこそ、それを正確に観察し、副作用につながる酸化プロセスを特徴付ける毒物学に大きな関心の。酸化ストレス測定の従来の方法を含む酸化生体11,12,13,14,15または 16の抗酸化物質の同定 ,17,18,19、20、または21,22,23、自体反応種の直接測定 24。ただし、これらのメソッドは、通常細胞の中断は、しばしばサンプルを消費、空間分解能を排除し、可能性のある成果物25を紹介を必要です。酸化種の検出および酸化ストレスのマーカーのより敏感な特定の方法の開発、生体異物露出の副作用の調査に広く適用。
遺伝子にコードされた蛍光センサーの新世代を用いた生細胞顕微鏡は、生きた細胞の細胞内酸化還元状態を監視する強力なツールとして浮上しています。これらのセンサーは、通常、トランスフェクションや伝達の方法論によって導入されたウイルス プロモーターの制御の下でベクトルを使用して表されます。蛍光センサーを発現する細胞は視覚的に簡単に識別することができますので、高発現効率は、必要ありません。毒性学的評価は、蛍光顕微鏡を使用してリアルタイムで異物化合物に公開されているこれらのセンサーを発現する細胞を観察できます。この実験的なデザインは、独自のコントロールとして動作する各セルの確立されたベースラインを許可する同じセルで繰り返し測定を許可します。住セルイメージ投射によって与えられる高時間分解能は控えめな大きさか一時的な自然の中で、特に酸化のイベントの検出に適してします。ターゲット分子に敏感な特定であること、に加えて 2 つの波長の光を使用してこれらのセンサーのいくつかの蛍光を励起することができます。この現象により、センサー式、セル厚、ランプの変化など工芸品によって引き起こされたものから本格的なセンサーの応答に関連付けられている信号変化の識別を可能にする比率として表現される蛍光発光強度や退色、蛍光検出器26の感度。蛍光センサーの使用のもう一つの利点は、その対象とは従来25,26,27によって比類のない空間分解能のレベルを作成する特定の細胞コンパートメントです。
緑色蛍光タンパク質 (GFP) 遺伝子にコードされたセンサーの大家族が開発されさまざまな生理学的マーカーは、pH、温度、カルシウム濃度、ATP/ADP 比25 などのレポートに特徴づけられる ,28,29,30,31。これらの中で含まれているグルタチオン酸化還元電位 (EGSH) と過酸化水素 (H2O2) のセンサーです。一方、これらのセンサーは、酸化還元の生物学および生理学のアプリケーション用に開発された、彼らはまた異物による酸化ストレス研究に適応されています。具体的には、ここで説明したプロトコルでは、EGSHセンサー roGFP2 と H2O2センサー ハイパーの使用について説明します。
roGFP2 細胞内還元と酸化型グルタチオン (GSH/GSSG) グルタチオンペルオキシダーゼ (GPx)、glutaredoxin (Grx) やグルタチオン還元酵素を含む酸化還元リレー経由の酸化還元電位 (GR) (図 1)25,報告します。32,33. グルタチオンは、優勢な細胞の抗酸化分子が細胞質25,34中 millimolar 濃度の形 (GSH) で主に存在します。EGSHはない任意の機能的な結果にリンクされている、しながら、細胞内の酸化状態の34の重要な指標として認識されます。GSSG の濃度の比較的小さい増加は roGFP2 によって検出不可能である Eグルタチオン (gsh)の増加の結果します。同様に Eグルタチオン (gsh)の監視、重要な異物のエクスポー ジャーの中に roGFP2 を使用することができます潜在的明らかに酸化還元リレーでいくつかのポイントでのアクションのメカニズムについてはあまりしペントース リン酸などの関連付けられている経路シャント (図 1)35。ここで説明した 2 番目のセンサー、ハイパーに由来する細菌の H2O2の規制領域に黄色い蛍光蛋白質 (YFP) を挿入の細胞内 H2O2プローブ-敏感な転写係数 OxyR136。H2O2はますます生理的条件37,重要な細胞内シグナル伝達分子として認識されているが、以前考えられていた有害な活性酸素中間、38, 毒物学同様に H2O2の認識できない役割が存在することを示唆します。例えば、異物曝露による過剰な H2O2は、細胞内シグナル伝達や、生体エネルギーのシフトで破綻の前兆かもしれない。
両方の遺伝子にコードされた蛍光センサーはひと類表皮癌細胞株 A431 ひと気管支上皮細胞線ベアス-2 b、EGSHと H2 の変化を観察するなど、いくつかの確立されたセルラインで表現されています。O2さまざまな毒性のエクスポー ジャーに対応。ガス状汚染物質 (オゾン35)、粒子状物質 (1, 2 ナフトキノン39,40 , 亜鉛41)、およびニッケル微粒子 (未発表データ) の水溶性成分が含まれます。これらの研究は、これらの 2 つのセンサーの応用の可能性の小さなサブセットのみを表します。理論的には、受信し、従来の分子生物学的手法によってこれらのセンサーの DNA を表現することができる任意のセル型は、細胞の酸化状態を変更する疑いのある化学物質の効果を評価するために利用できます。日には、1 つ以上これらのセンサーは、様々 な原核生物と真核生物、いくつかの哺乳類、植物、細菌、および酵母細胞の種類25,26,36,42を含むで表現されています。EGSHと H2O2センサーの読み出しは 510 で放出される蛍光強度の変化 488 と 404 nm の光を励起に nm。このメソッドは、各種顕微鏡 (共焦点と広視野)、プレート リーダーを含め、蛍光のプラットフォームに広く適応されます。ここで紹介した方法は O2 体外毒性学的システムにおける細胞内GSH E と H2の特異的かつ高感度の観測できます。
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Protocol
1. 細胞の調製
注: この手順は、不死化細胞ライン (ベアス 2 b; のレンチ ウイルスの伝達を説明しますATCC、マナッサス、VA) 目的のレポーター (roGFP2 またはハイパー) を表現します。彼らは記者式視野 (通常 5-10 セル) あたりセンサー発現細胞の十分な数を視覚化するのには十分のレベルの結果として、他のセル行/型や遺伝子、トランスフェクションなどのメソッドを利用できます。最終的に分析法を使用する料理の手順が実行される必要がありますトランスフェクション メソッドを使用している場合 (例えば、transfect 顕微鏡が表示されます同じ皿のセル)。以下の手順は、6 も細胞培養プレート内で実行する細胞伝達の準備の詳細を提供します。この形式が目的のアプリケーションの適切なサイズでない場合は、代わりに他の船舶が使用できます。
- 細胞を正常な成長のメディアで約 40 ~ 60% 合流に成長します。
注: 本研究は、ケラチノ サイト成長媒体 (KGM) で栽培、ベアス-2B ひと気管支上皮細胞の線を利用しました。 - 直前の伝達、細胞の成長媒体を 500 μ L の数式で計算されたウイルスの適切な量を含む無血清メディアに置き換えます。
- ベアス 2 b 細胞の伝達ウイルスの孵化中に KGM の成長媒体を置き換えるため表皮細胞の無血清基礎培地 (KBM) を使用します。
注: 上記の計算は、6 ウェル フォーマット内のセルの 1 つの井戸の 1 つの伝達です。必要な場合は、いくつかの伝達を実行井戸を導入する井戸の数で乗算式を調整することによって実行できます。レンチ ウイルスの伝達、5 と 20 の間感染 (MOI) の多様性を使用します。アデノ ウイルス伝達は、100 から 500 の間の慣性モーメントを使用します。
- ベアス 2 b 細胞の伝達ウイルスの孵化中に KGM の成長媒体を置き換えるため表皮細胞の無血清基礎培地 (KBM) を使用します。
- 4 h、料理の簡単なロッキングすべて 30 ~ 60 分でウイルス粒子の再配布または運動を旋回の 37 ° C でウイルスの混合物を持つセルを孵化させなさい。
- 皿に完全な成長媒体の 1 つの mL を追加し、追加 4-16 h の 37 ° C で孵化させなさい。
- すべてのメディアを削除し、完全な新鮮な成長媒体に置き換えます。
- 成長し細胞の通路、必要に応じて展開し続けます。
注: セルかなり 12 48 h 以内センサーで表現しはじめる必要があります。情報伝達系のレンチ ウイルスのベクトルを使用した場合、必要なセンサーを安定に発現は全体の通路続ける必要があります。 - 顕微鏡ベースの評価では、ガラスにシード細胞顕微鏡皿の底、イメージングの前に必要な合流点 (70 - 80%) まで拡張します。
注: 播種密度皿、使用されている細胞株の成長率およびシードに続く評価の時間のサイズによって異なります。たとえば、1 日に成長後約 70-80% の合流を屈する 35 mm ディッシュにシード 300,000 のベアス 2 b のセルです。
2 顕微鏡のセットアップ
メモ: 以下のプロトコルは 404、488 nm のレーザー ラインを搭載した共焦点顕微鏡を使用して実行されます。所定励起/排出量でこのプロトコルで記述されているセンサーの蛍光評価を行う他の手段はまた実行可能なデータを得られるはず。重要なは、機器の設定によって大きく異なります型、年齢、および使用されている計測器の条件したがって、計測器の値を上記は他の所で使用される機器に特定できない場合があります。
- 環境コントロールを使用して適切な温度 (例えば、37 ° C)、湿度を維持するすべてのイメージング分析を実行 (通常 > 相対湿度 95%)、ガス濃度 (例えば5% CO2) 中の細胞に適したおよび/または、実験の期間です。
- 相対湿度の高い値を使用している場合を保つ加湿雰囲気と接触する表面 (e.g。、対物レンズ) でか、湿度が結露を防止するために生成される温度をやや上回る。これは、客観的ヒーターや暖房テープと適切なヒーター制御を使って実現できます。
- 顕微鏡のすべてのコンポーネントをオンにし、510 で発光 488 と 404 nm 連続励起に必要なすべての機器を設定する nm。リアルタイム ・ アクイジションの光学構成のすべてのコンポーネントが適切に設定されてを確認します。
- ステージ トップ環境チャンバーを 37 ° C、5% CO2雰囲気で一定の温度を維持するために設定および > 95% の湿度。画像の取得を開始する前にすべての環境コントロールの初期設定後、少なくとも 10 分間環境室を平衡します。
注: 環境条件が除去または実験長さ、セルの型、および使用されている露出に応じて調整されます。 - 環境制御チャンバー内でステージの上に細胞 (ステップ 1.7) の皿を配置します。
- 目的の対物レンズと接眼レンズと白色光を用いた細胞の焦点面を見つけるし、正常な形態を確保します。
注: 1.4 NA 60 X バイオレット修正、油浸対物レンズが一般的に使用、共焦点システムの光学解像度を最大化しながら細胞内コンパートメントの同定可能します。 - ビューのフィールドのセルの蛍光発現を確認します。かに (FITC) などの適切なフィルター セットを持つ広視野蛍光照明の下で細胞を可視化しながら行うこと。この時点で広視野照明を使用して細胞の研究へのフィールドを選択する皿を移動しやすくなりますので、接眼レンズをのぞきはより便利です。一般に、緑の蛍光性によって示されるようにセンサーを表現している少なくとも 5 ~ 10 セルが含まれている場合は、ビューのフィールドを選択します。
- また、confocally レーザー励起を使用して表現されているセンサーと最も互換性がある波長でこのアセスメントの実施 (488 nm 通常最高の作品)。
注: 彼らの本質的な蛍光特性のためそれが難しくなるどちらかの FITC を使用してこれらの表現する roGFP2 よりもハイパーを発現する細胞を可視化する、488 nm。しかし、かすかなセルを表示可能なはずです。
- また、confocally レーザー励起を使用して表現されているセンサーと最も互換性がある波長でこのアセスメントの実施 (488 nm 通常最高の作品)。
- 希望の視野が見つかったら、環境制御チャンバーを閉じます。
注: は、研究を通して安定したフォーカル プレーンの保守も容易にフォーカスを維持する機能は、高度な顕微鏡スタンドにしばしば利用を使用します。 - 希望の暴露期間にわたって関心のセンサーの最適な評価を確保するため集録パラメーターを設定します。以下の推奨事項および共焦点イメージング センサーの応答のための方法は以下のとおりです。
- 488 nm で励起と 510 で放射のレーザー パワーを調整 nm。細胞の可視化を可能にするレーザー電力レベルを選択し、これをサンプルまたはレプリケート料理の一定に保ちます。
注: この研究の 12%、1.5% のレーザー パワー使用された 488 と 404 nm レーザー ラインのそれぞれ。 - 集録ソフトウェアの共焦点のコントロールを使用して、選択した焦点平面は、セル (z 軸) の中央に最大蛍光発光強度の 488 でスキャンによって最適化されていることを確認 z 平面を調整しながら nm。これは過剰に露出した細胞において z 平面を捜している間高いゲイン設定を使用して簡単にはなります。適切な焦点面を発見すると、ゲイン観察されるピクセルを飽和することがなく使用されているレポーターの蛍光に最も最適な設定に戻ります。
注: を見つけると、実験中の細胞を観察することに適切なレーザーとゲインの設定は利用されている共焦点システムに完全に依存。一般的に、細胞は、ビューのフィールドで発見されている、一度はお勧めレーザー電力量が最小限であること、ハイパワー レーザー光を用いた細胞の過剰なスキャン センサーによって酸化変更検出を誘発する可能性があります (通常引時間: 20%) を使用します。 - ゲインを使用すると、ベースラインの蛍光を絞り込みます。RoGFP2、これらの細胞は EGSH増加 488 nm 励起によって誘起される 510 nm の蛍光を失うと白とびすることがなく計測器の上限 (≈ 90% 相対強度) 付近のベースラインを確立します。対照的に、488 nm 励起蛍光であるべき発現細胞、H2O2が検出されると、これらの細胞は 510 nm の蛍光強度を得るため、ハイパーのベースラインで低 (≈ 10% 相対強度)。
- 手順 2.9.2 と 404 nm 励起と 510 で排出 2.9.3 nm。404 nm 励起波長のゲイン設定、各センサーの 488 nm 励起に使用されるものとは逆 (すなわち、低いベースライン蛍光 (≈ 10% 相対強度) 404 で高いベースライン蛍光 (≈ 90% 相対強度) H2 roGFP2 の nmO2センサー)。
注: 一般に、404 nm 励起の蛍光 (510 排出) かなりより低くなります 488 nm 励起細胞を用いて得られるには roGFP2 とハイパー 404 nm ピークとして表現するこれらの両方の最大の比較的マイナーな励起センサー。
- 488 nm で励起と 510 で放射のレーザー パワーを調整 nm。細胞の可視化を可能にするレーザー電力レベルを選択し、これをサンプルまたはレプリケート料理の一定に保ちます。
3. データ集録
- 順番に 2 つの励起波長を励起するため取得ソフトウェアのセットアップ (最初 488 nm と、404 nm) 510 で両方の排出量を収集し、nm 実験の希望の長さ全体にわたって所定の時間間隔で (例えばキャプチャ、画像ごとの 6060 分の秒)。
- また、画像を取得手動でのエクスポー ジャーの前後にテストされている異物の EGSHや H2O2の変更のおおよそのタイミングがわかっている場合。ただし、これは一時的な解像度の損失につながる可能性があります。
- 実験パラメーターのリアルタイム評価の分野で少なくとも 5-10 センサー発現細胞を選択し、対象 (「ロア」) 実験中に蛍光変化を監視する領域としてそれらを確立します。
注: この手順は省略可能で、リアルタイムで直接観察が望ましい場合はソフトウェアの制限は継続的な監視を防ぐ実験後に実行できます。セル人口によって発現・ ロワとして細胞センサーの選択は複数のセル式レベルの範囲を表す可能性があります。- これらの研究では、5 分間のベースラインの期間後環境毒性物質 9, 10 フェナンスレンキノン (9, 10-PQ) または過酸化水素 (H2O2) を追加します。
- このプロトコルでは後で使用できるすべての試薬を準備します。 9, 10-15 mM の濃度にジメチルスルホキシド (DMSO) で PQ を溶解し、250 μ M 作業ソリューションを生成する基底細胞メディアで希釈します。 また、射出時に 1 mM の最終的な集中をもたらす水に過酸化水素の実用的なソリューションを準備します。
- 実験パラメーターが定義されている開始時間コース取得。異物のエクスポー ジャーを開始する前に、少なくとも 5 分 (または 5 のデータ ポイント) のベースラインの期間を確立します。
- 公開、毒性物質に細胞の in vitro投与の従来のアプローチを使用して調査中します。水か他の適当な溶剤に可溶性化合物を準備し、メディアに直接注入します。
- (ジメチルスルホキシドやエタノールなどの有機溶剤が必要な場合は、0.1% 以下で最終溶剤濃度を維持します。溶媒が EGSHや H2O2生産細胞の別々 の皿に、車両制御に及ぼす影響を生成しないことを確認します。
- 溶解性の低い化合物の注入が行われた後、プロトコルにマイクロ ピペットを使用して混合手順を追加します。適切なキャリアの混合ガスを用いた環境制御チャンバーに直接気体のエクスポー ジャーをポンプします。
- 暴露期間中に蛍光性の変更を監視します。その後注射を必要に応じて実行します。同じセルが同じ焦点面をイメージしながら全体の時間コース全体で続いているように、注射中、皿に細心の注意を取る.
- 実験の終わりには、適切なコントロールにセルを公開します。両方の遺伝子にコードされた蛍光センサー、酸化し、レシオ メトリック敏感さの先の尖ったデモでこれらのセンサーを削減する知られている化合物の特定濃度を追加します。H2O2およびジチオトレイトール (DTT) は酸化し、両方のセンサーを減らす適切なコントロールとして機能します。通常、最終濃度 100 1,000 μ M H2O21 ~ 5 mM ジチオトレイトール (DTT)、続いては完全に酸化し、これらのセンサーを削減するユーザーをことができます。
- これらの研究では、最大のセンサー応答を決定するのに 5 mM DTT を続けて 1 mM H2O2を使用します。
- 対応するため、センサーを許可するように少なくとも 5 分を待つし、DTT、セニョールを削減し、蛍光または確立されたベースライン付近のレベルに戻るなどの還元剤を注入されています。
注: この手順でコントロールの使用の正規化のため非常に重要です、各セルでセンサーのダイナミック レンジを決定するすべての実験の終わりに実行する必要があります。RoGFP2、aldrithiol は実験の終わりに追加できます。Aldrithiol は、センサーを直接酸化する roGFP2 酸化還元リレーをバイパスします。これは異物センサー機能を評価するために役立ちます。
4. データ解析
- 確立されていない場合は、分析対象とするセルの周囲・ ロワを描画します。適切なソフトウェアを使用すると、時間のコースの中で各波長の各 ROI の蛍光強度を測定します。セルが移動しなかったかプレートがずれたり、実行中にしてください。
注意: ・ ロワの確立は各細胞の蛍光発現パターンを示す閉じた領域を描画することによって最も簡単に達成します。さらに、このプロセスを支援するには、確立されたビューのフィールド内のセルの透過光 (または明視野) 画像はセルの境界を定義する取り組みの蛍光画像の上に重ねることができます。ただし、透過光像の使用では、実験の過程で追加のチャネル (画像のセット) をキャプチャするユーザーが必要です。また、特定のメーカーは、輝度しきい値などの特定のパラメーターを使用して、量的なあまり主観的な方法で Roi を確立彼らのイメージング ソフトウェアにアルゴリズムを組み込みます。 - 解析ソフトウェア (電子スプレッドシートなど) にデータをエクスポートします。
- 式を使用して各時点での各 ROI のレシオ メトリック センサーの応答を計算します。
- 各時間ポイントすべての Roi の計算のレシオ メトリック値の平均値します。
- 異物 (例えば、最初の 5 回ポイント) の加算の前に収集された以前に計算されたレシオ メトリック値 (4.4 ステップ) を平均することによって、データを正規化するため、ベースラインの値を計算します。
- 4.5 で計算された基準値でそれぞれの値を割って手順 4.4 からレシオ メトリック値を正規化します。正規化の比率がベースラインで 1 の値の周り中心、次の注射 EGSHや H2O2の増加は、比率を増やす原因となります。酸化変化を誘発する異物の評価は、3-6 回基準値の範囲内の値を生成する傾向があります。
- 応答内および実験間の比較を支援、100% として制御酸化剤 (例えば、1 mM H2O2) への応答を定義することによって最大のセンサー応答の割合として正規化されたデータを表現します。
注: 最大センサー応答の割合としてデータを表現する場合、同じコントロール オキシダント濃度は実験で一貫して使用されるように重要です。生細胞イメージング解析から得られたすべてのデータは、捜査官の裁量で選ばれる従来のペアとグループの統計分析に従う義務があります。
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Representative Results
EGSHと細胞内の H2O2の変更の検出で roGFP2 とハイパーの使用されている前述の25,36,42,43ここで。ベースラインと H2O2と DTT の情報に加えて、以下の roGFP2 を発現する細胞の共焦点画像を図 2のとおりです。実験を通して収集した画像からデータがエクスポートし、プロトコルのセクション 4 で説明されているように分析します。肯定的な制御として外因性 H2O2の追加で再現可能な応答を生成するデータは、それぞれの基準に正規化され、知られている外因性の添加で定義されたダイナミック レンジを設立示すように、酸化剤・還元剤 (すなわち、H2O2と DTT) (3、4、および 5 の数字)。
毒性学的刺激に対する応答は、通常コントロールによるものよりも可変です。これは、予想される異物化合物、細胞、細胞内タンパク質の内転にサイクリング酸化還元に至る多面的効果があります。RoGFP2 と毒性物質 9, 10 PQ フェナントレン44, 大気中の反応によって形成された酸化の大気汚染物質への暴露によるハイパー応答の例は、図 6 と 7で掲載されています。これらの数字のグラフには、プロトコルのセクション 4 で概説したデータ分析にかかわる各ステップの進行が描かれています。示すように、独自のベースラインと肯定的な制御 (図 6B) 各セルの正規化は (図 6A) の生のデータからのセンサー応答の大きさで細胞間のばらつきを低減します。細胞応答の差異が関心の場合、グラフ上の独自のラインによって表される個々 の細胞で、この時点までデータの正規化を実行できます。大きさまたは同じ料理中の細胞応答の速度の変化は、例えば細胞周期の違いを反映する重要な機械論的洞察を明らかにできます。また、皿の細胞の平均応答は標準偏差 (図 6C) と共に表示できます。それ以外の場合、個別の実験のレプリケートが提示されている場合データを正規化された相対的な蛍光強度の値または (3、4、5、および 6 D の数字)、制御酸化による最大応答の割合として表示ことがあります。平均値の標準誤差を伴うすべての複製の平均を表示しています。RoGFP2 (によって検出された大気汚染物質 9, 10-PQ は強力な酸化還元サーマルサイクラーに知られている、我々 は仮説をハイパー (図 7) によって検出された過酸化水素製造の周期的なピークを担当し段階的な EGSH増加図 6D)。
図 1.RoGFP2 グルタチオンの酸化還元のリレー。グルタチオン ・ ペルオキシダーゼ (GPx) 酸化過酸化水素 (H2O2) に応えて GSSG の還元型グルタチオン (GSH),グルタチオン酸化還元電位 (EGSH) が増えています。蛍光センサー roGFP2 は、細胞内 EGSH glutaredoxin (Grx) によって酸化されるときであります。還元経路の Grx は GSSG レベルは減少、グルタチオン (gsh) の正常なレベルに NADPH を犠牲にしてグルタチオン還元酵素 (GR) によって再度確立されます deglutathionylation を介して roGFP2 の還元を触媒します。NADPH はペントースリン酸経路 (PPP) を介してのグルコースによって提供されます。ギブス フローノイら35から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.ひと気管支上皮細胞の共焦点顕微鏡画像ライン ゾル性細胞質の roGFP2 を表現するベアス 2B 。セルは 488 で照らされた nm (A ~ D)、続いて 404 nm (E H)。画像表示 510 で放出される蛍光 nm 以下の条件: ベースライン(A ・ E)、100 μ H2O2(B, F)、1 mM H2O2 (C, G)、および 5 mM DTT (D, H)。60 X 計画 Apo VC 目的。スケール バーを表す 25 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 3.H2O2と 2 b 細胞によって誘導される roGFP2 に依存する変更を線量します。セルは、エクスポー ジャーの前に - フェノールレッド フリー表皮基底メディア (KBM) で 30 分間平衡だった。510 で 5 分 roGFP2 蛍光のベースラインの期間後に発生した H2O2のすべての追加 nm は 525/30 nm のバンドパスを使用して収集した次の 404 と 488 nm レーザー励起フィルターします。細胞応答は、彼らのそれぞれの基準と最大のセンサー応答 1 mM H2O2の添加に正規化されました。値は、平均 ± 標準誤差、n として表示 = 3、n が 5-10 の独立した細胞の平均ので構成されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.グルコース応答飢えた H2O2の様々 な用量に roGFP2 を表現するベアス 2B セル。セルは、露光前にグルコースを含まない最小塩培地で 2 時間平衡だった。510 で 5 分 roGFP2 蛍光のベースラインの期間後に発生した H2O2のすべての追加 nm は 525/30 nm のバンドパスを使用して収集した次の 404 と 488 nm レーザー励起フィルターします。細胞応答は、彼らのそれぞれの基準と最大のセンサー応答 1 mM H2O2の添加に正規化されました。値は、平均 ± 標準誤差、n として表示 = 3、n が 5-10 の明瞭な細胞の平均ので構成されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。H の様々 な用量にハイパーを発現するベアス 2 b 細胞の応答2O2.セルは、エクスポー ジャーの前に - フェノールレッド フリー KBM で 30 分間平衡だった。5 分 510 で放出される蛍光のベースラインの期間後に発生した H2O2のすべての追加 nm は 525/30 nm のバンドパスを使用して収集した次の 404 と 488 nm レーザー励起フィルターします。細胞応答は、彼らのそれぞれの基準と最大のセンサー応答 1 mM H2O2の添加に正規化されました。値は、平均 ± 標準誤差、n として表示 = 3、n が 5-10 の明瞭な細胞の平均ので構成されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。RoGFP2 を発現するベアス 2 b 細胞の 9, 10 PQ による応答。セルは、曝露前 - フェノールレッド フリー KBM で 30 分間平衡だった。料理、別の行で表される各セルの個々 のセルの生 roGFP2 比を示しています O2 20 分、24 分パネルAで 5 mM DTT で 1 mM H2の追加に続く 5 分で 25 μ M 9, 10-PQ 混合の追加が発生しました。パネルBはその基準センサー蛍光する個々 のセルから値の正規化を示し、 Cパネルで個々 の正規化された比率にこのデータの標準偏差と平均が重畳。すべてのセル全体の平均最大センサー応答の割合は、パネルDで描かれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7. ハイパーを発現するベアス 2 b 細胞の 9, 10 PQ による応答します。セルは、曝露前 - フェノールレッド フリー KBM で 30 分間平衡だった。25 μ M の追加は 20 分、25 分 510 で放出される蛍光で 5 mM DTT で O2後で 1 mM H2の加算混合 9, 10 PQ が 5 分で発生しました nm は 525/30 nm のバンドパスを使用して収集した次の 404 と 488 nm レーザー励起フィルターします。細胞応答は、彼らのそれぞれの基準と最大のセンサー応答 1 mM H2O2の添加に正規化されました。5-10 の異なるセルの平均値を記載します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
それぞれ、細胞内GSH E と H2O2の変更の検出で roGFP2 とハイパーの使用は25,生理学的及び毒性学的研究前35,36 によく記載されています。 ,,3940,41,42,43。ここで説明したプロトコルは細胞内レドックス恒常性の異物による摂動を評価するために設計されている先の尖ったの毒性学的研究でこれらの遺伝子にコードされた酸化還元センサーを実装する効果的な方法をレポートします。最も重要なは、これらのセンサーの適切な使用は、最終的に多くの従来の酸化ストレス アプローチと特異性の欠如を明らかに特定の酸化還元対または ROS (EGSHや H2O2) に確認された変更をリンクします。実験を設計するとき考慮これらのセンサーは、いくつかの側面から生成されるデータの品質を撮影する必要があります保証とデータの解析・解釈。彼らを含める: 1) 適切なコントロール、適切なセンサーの応答の検証 2)、3) 機構を解明する実験的パラメーターの操作を使用します。これらの観測期間の終わりにコントロールとして外因性 H2O2と DTT の添加は、複数の目的を提供しています。最初に、それは達成可能な最大および最小の信号を基準にして有毒な露出にセンサーからの応答の大きさを評価する機会を与えます。これは、実験間の比較のための応答の正常化に最も便利です。さらに、強力な外因性酸化および還元的刺激の追加実験を終了センサー/リレー整合性に前の露出の効果を評価できます。さらに、aldrithiol は、リレーを取り外して、露出自体 fluorophore に与えた可能性があります潜在的な損傷のために直接センサーの機能をテストの実行の末尾に追加できます。
その他のテクニックは、毒性学的成果の特定検査のためこの方法論を適用する場合と同様に、観察の正確性について定性的な評価を行うことが重要です。任意の新しい異物と roGFP2 またはハイパースレッディングを活用しながら各励起波長の蛍光 (510 nm 発光) 最初の用量の範囲をテストすることが重要だ (404 nm、488 nm) が適切に変化 (すなわち増加増減) に使用されている酸化還元セニョール。目標は、センサーの応答が検出可能ですがセンサーのあからさまな操作または化合物の他の非特異的作用によって妨害されない線量を識別することです。直接内転やセンサーへのダメージは、どちらかの励起波長 (488 または 404 nm) の蛍光性の非定型の変化としてマニフェストがあります。どちらかのセンサーが一貫してエクスポー ジャー間で、毒性物質のほかに不適切な対応を観察されている場所の状況、調査官が、線量評価に関連して実験的パラメーターを調べることを検討すること勧めセル生存率、センサー式、または応答の観察に使用されている計測器の光/色彩異常。
任意の毒性の読み出しと、取得したデータは通常は、観察された応答が検証または検討することは無意味と見なされます機械論的アプローチと実験的限界を使用しています。このため、強力な酸化還元評価を生成するセンサーの固有の性質と組み合わせていくつかの実験的パラメーターを利用できます。RoGFP2 センサーの使用に固有の調査は最終的にどの roGFP2 感覚 Eグルタチオン (gsh) (図 1) による酸化還元リレーを懸念します。リレーには、細胞内の酵素、グルタチオンペルオキシダーゼ (GPx)、グルタチオン還元酵素 (GR)、glutaredoxin (Grx) などが含まれます。細胞コンパートメント、セルタイプ Grx の内因性のレベルの相違は、Eグルタチオン (gsh)の測定に影響を与えるし、実験困難43間の比較できます。この問題に対処するため、関連する酵素 roGFP2 センサーへ直接リンク、「フュージョン プローブ」のシリーズが合成されています。最も最近、人間 Grx 1 はフォーム Grx1 roGFP2 に Gutscher と同僚の32 roGFP2 にリンクされていた。RoGFP1 より大きいダイナミック レンジを持つ、pH に依存しないことに加え、Grx1 roGFP2 は、EGSHセルタイプまたはどの Grx の活動が制限されるそれ以外の場合の仕切りを監視できます。細胞の種類や細胞同じ皿の中でも、NADPH のレベルの相違は roGFP2 応答の変動にも貢献できます。NADPH はペントースリン酸経路、グルコースから生成され、グルタチオン還元酵素 (GR) GSSG を抑えるグルタチオン (gsh) (図 1) に戻る利用可能します。同じフィールドのセル容量の異なる還元実験を開始、Eグルタチオン (gsh)の変更、結果 roGFP2 レスポンス刺激がとれなくなります。グルコース飢餓細胞の NADPH 株式を使い果たすと調和する roGFP2 応答実験開始前の期間を通じて、この問題を克服できます。Eグルタチオン (gsh)回復のため減少した能力は、通常のグルコース濃度 (図 3 および 4) を添加した細胞と比較して血糖の飢えていた細胞に、25 μ M の H2O2線量で見ることができます。Thusly、グルコース飢餓により NADPH レベルの操作は、複数のリレー コンポーネント センサーに異物曝露が及ぼす影響を伝達の関与を確認する手段として使用できます。毒性のコンテキストで roGFP2 を使用する場合のもう一つの懸念は、EGSHが変化する酸化還元リレーを介して作用するのではなく、酸化センサーで直接対話する異物の可能性です。RoGFP2 の直接酸化は、酸化還元リレーの各ポイントをプロービング roGFP2 信号への影響を評価することにより決定できます。この技術を刺激としてオゾンを用いた事例ギブス フローノイら 35研究で明らかです。
H2O2センサーの実験、上記の懸念は酸化還元リレーを介してではなく、関連性の高いハイパーの OxyR1 ドメインは H2O2を直接感覚としてではなく。しかし、roGFP2 とは異なり、H2O2センサーは実験中に H2O2に帰属しない蛍光の変化を引き起こすことができる pH の変化に敏感。このため、適切にバッファーされたメディアの使用目的の温度、車両のコントロールの使用を維持するために環境室は H2O2センサーを利用した実験に不可欠です。さらに、特にモニター pH、赤のチャンネルに蛍光を発するともハイパー45を発現する細胞の共発現することができます pHRed などする蛍光センサーが開発されました。H2O2センサーの理想的な pH コントロールがレンダリングできません意味 H2O2単一の点突然変異は、ph 応答性を残しつつ H2O2センサーのバージョンであるサイファー46しますまた、H2O2センサーを発現する細胞が平衡、インキュベーターから分析、その中に彼らの経験のサイトに輸送されて、特に後に長いベースライン期間を必要とする、観察されている。メディア温度や pH のわずかな変化は。任意の露出を開始する前に、ベースラインが安定した後、少なくとも 5 つのデータ点を取得することをお勧めします。
このメソッド、roGFP2 とハイパーで説明したセンサーは、毒物学の分野でさまざまな応用技術を持っている多くの蛍光センサーの 2 つです。これだけでなく EGSHと H2O2パーオキシ ナイト ライト47, を検出するセンサーが含まれています一酸化48,49, ともオゾン50。これらのセンサーは生きている細胞イメージング研究において具体的に活用できるし、敏感に関心の酸化種を監視します。スペクトル分離などの技術の進歩とも共同と同様のスペクトル特性を持つ 2 つのセンサーを表現する可能です (5 内でお互いの nm) 同じセル、および別の各センサー51 によって放出される蛍光の割合.この手法は、彼らは同じ波長で発光と励起を伴う roGFP2 のハイパー、特に関心の。簡単に説明ここでは、特定のセンサーを対象にできますミトコンドリア、酸化のイベントを観察するなど、特定の細胞内コンパートメント。これらの新興のセンサーやテクニックでこのメソッドの範囲を超えている読者によって賃金や同僚の52レビューなどの細胞内レドックス センサーのトピックに関するいくつかの最近出版物呼ばれます。住セルイメージ投射を遺伝子にコードされた蛍光センサーの使用は、毒性学的評価の際の酸化反応の監視のための強力なツールです。
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Disclosures
この資料に記載されている研究と国立健康環境影響研究所、米国環境保護庁によってレビューおよび承認します。この資料の内容は、機関のポリシーを表すものではありませんもは商号や商品の言及を構成する承認または使用のための推薦。
Acknowledgments
著者らは、実験的なデザインと原稿編集支援のケイトリン Lavrich を感謝したいです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
| HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |
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