Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

פרוטוקול נתיישב לייצר חלבונים Site-Specifically Acetylated Escherichia Coli

Published: December 9, 2017 doi: 10.3791/57061
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

Summary

הרחבת הקוד הגנטי מהווה כלי רב עוצמה כדי ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל חלבון acetylation. כאן אנחנו מדגימים פרוטוקול נתיישב לנצל בטכניקה זו ליצירת homogeneously acetylated חלבונים באתרים ספציפיים בתאים Escherichia coli .

Abstract

Post-translational שינויים שמתרחשים עמדות מסוימות של חלבונים הוכחו תפקיד חשוב במגוון רחב של תהליכים תאיים. ביניהם, ליזין הפיך acetylation הוא אחד הנפוצים ביותר מבוזר בכל התחומים של החיים. למרות acetylome מסה ספקטרומטר המבוסס על מחקרים רבים שנעשו, נוספות אפיון של מטרות אלה בשם acetylation הוגבלה. סיבה אפשרית אחת היא כי קשה לייצר חלבונים acetylated גרידא-עמדות הרצוי על-ידי רוב הגישות הביוכימי קלאסי. כדי להתגבר על האתגר הזה, הטכניקה הרחבת הקוד הגנטי הוחל להשתמש הזוג של variant המעביר pyrrolysyl הנדסה-tRNA, שלה tRNA cognate ממינים Methanosarcinaceae , לכוון שיתוף cotranslational של acetyllysine באתר ספציפי בהחלבון של עניין. לאחר היישום הראשון במחקר של acetylation היסטון, גישה זו הנחתה את acetylation מחקרים על מגוון רחב של חלבונים. בעבודה זאת, הפגנו פרוטוקול נתיישב לייצר חלבונים site-specifically acetylated באמצעות החיידק דגם Escherichia coli כמארח. בנויים דהידרוגנאז שימש דוגמה הפגנה בעבודה זו.

Introduction

שינויים post-translational (PTMs) של חלבונים להתרחש לאחר תהליך התרגום, נובעים קוולנטיות תוספת של קבוצות פונקציונליות כדי שאריות חומצה אמינית, משחק תפקידים חשובים כמעט כל התהליכים הביולוגיים, כולל גנים תמלול תגובת המתח, התמיינות, חילוף החומרים1,2,3. נכון להיום, כ 400 ייחודי PTMs היה מזוהה4. הפרטים. של הגנום, את פרוטאום מוגבר במידה רבה על ידי חלבון PTMs, כפי שהם לווסת את פעילות החלבון ולוקליזציה, משפיע על האינטראקציה עם מולקולות אחרות כגון חלבונים, חומצות גרעין, ליפידים, cofactors5.

חלבון acetylation כבר בחוד החנית של מחקרים PTMs האחרון שני עשורים6,7,8,9,10,11,12. ליזין acetylation התגלה לראשונה בשינויים היסטוניים לפני יותר מ 50 שנה13,14, בחן היטב, וידוע להתקיים יותר מ-80 גורמי שעתוק regulators, חלבונים שונים15, 16,17. מחקרים על חלבון acetylation יש לא רק סיפק לנו הבנה עמוקה יותר של מנגנוני רגולציה שלה, אלא מונחה גם טיפולים עבור מספר מחלות שנגרמות על ידי לקוי acetylation18,19, 20 , 21 , 22 , 23. האמינו ליזין acetylation מסרטים פרוקריוטים, אך מחקרים שנעשו לאחרונה הראו acetylation חלבון זה גם ממלא את תפקידי המפתח בפיזיולוגיה חיידקיים, כולל כימוטקסיס, התנגדות חומצה, הפעלה של ייצוב פתוגניות ואיי התקפה אלימה אחרים הקשורים חלבונים24,25,26,27,28,29.

שיטה נפוץ לאפיין מבחינה ביוכימית ליזין acetylation משתמש מוטגנזה. גלוטמין משמש חיקוי של acetyllysine בשל גודל דומה קוטביות. ארגינין הוא מנוצל כמו חיקוי ליזין שאינם acetylated, מאז זה משמר את מטען חיובי בתנאים פיזיולוגיים אבל לא יכול להיות acetylated. עם זאת, שניהם מחקה אינם isosteres האמיתי, לא תמיד יניבו את התוצאות הצפויות30. הגישה קפדני ביותר היא לייצר חלבונים homogeneously acetylated-שאריות ליזין ספציפי, וזה קשה או בלתי אפשרי עבור שיטות הכי קלאסי בשל סטויכיומטריה נמוכה של ליזין acetylation הטבע7,11. האתגר הזה יש כבר נפתר על ידי האסטרטגיה הרחבת הקוד הגנטי, אשר מעסיקה של המעביר pyrrolysyl הנדסה-tRNA variant ממינים Methanosarcinaceae לחייב tRNAPyl עם acetyllysine, מנצל את המארח מכונות translational לדכא את UAG קודון סיום ב- mRNA, ומביאה שילוב של acetyllysine במצב מעוצב של חלבון המטרה31. לאחרונה, אנו יש אופטימיזציה מערכת זו של tRNA EF-Tu-איגוד משופרת32 , של acetyllysyl משודרג-סינתזת המעביר33. יתר על כן, אנו החלת מערכת זו התאגדות משופרת במחקרים acetylation של בנויים דהידרוגנאז34 / tyrosyl-סינתזת המעביר35. במסמך זה, נדגים את הפרוטוקול ליצירת חלבונים acetylated גרידא של שיבוט מולקולרי כדי זיהוי הביוכימי באמצעות בנויים דהידרוגנאז (MDH), אשר אנו חקרו בהרחבה כדוגמה כינוי רמז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מוטגנזה של הגן היעד

הערה: MDH מבוטא תחת T7 יזם ב וקטור pCDF-1 עם המקור CloDF13 ומספר עותק של 20-4034.

  1. להציג את אמבר stop codon במיקום 140 בגן מאת תחל (קדימה פריימר: GGTGTTTATGACתגAACAAACTGTTCGGCG הפוכה פריימר: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), בעקבות ההוראה של ערכת מוטגנזה.
  2. להגביר את פלסמיד תבנית המכילה את הגן של dehydratase פראי-סוג בנויים והוסף את המוטציה stop codon מאת התגובה פולימראז תגובת שרשרת (PCR). בתערובת התגובה, כוללים µL 12.5 של 2 X DNA פולימראז אנזים מיקס, µL 1.25 של 10 מיקרומטר פריימר לפנים, µL 1.25 של 10 מיקרומטר פריימר הפוכה, µL 1 של תבנית ה-DNA (20 ng/µL) (המכילים את הגן של פראי-סוג MDH פלסמידpCDF-1 ), ו- µL 9 של נוקלאז ללא מים.
    1. השתמש בפרמטרים התגובה PCR כדלקמן: Îàé דנטורציה ב 98 ° C ל 30 s; 25 מחזורי 10 s ב 98 ° C, 30 s-55 ° C ו- 3 דקות ב-72 מעלות; הרחבה הסופי ב-72 מעלות למשך 3 דקות. לאחר PCR, הוסף את החומר מוגבר ישירות לתערובת אנזימים קינאז-ליגאז-DpnI הערכה לשעה בטמפרטורת החדר במשך circularization והסרת תבנית.
      הערה: תערובת התגובה מכילה 1 µL של PCR המוצר, 5 µL 2 X תגובת מאגר, µL 1 של 10 מיקס אנזים X קינאז-ליגאז-DpnI 3 µL של נוקלאז ללא מים.
  3. להוסיף 5 µL של המיקס התגובה על הצינור של 25 µL הקרת המוסמכת e. coli DH5α תאים הערכה. בזהירות קפיצי צינור כדי לערבב, מניחים את התערובת על קרח דק 30 הלם חום התערובת ב 42 ° C s 30, ואת המקום על קרח במשך 5 דקות נוספות.
    1. פיפטה 600 µL של טמפרטורת החדר מרק סופר אופטימלית עם Catabolite מדיה הדיכוי (SOC) הערכה לתוך התערובת, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ברעידות-250 סל"ד, להפיץ µL 100 על צלחת אגר lysogeny מרק (ליברות) עם האנטיביוטיקה המתאימה , דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-250 סל"ד.
  4. לבחור 4-6 מושבות יחיד לתוך המדיה LB טרי 6 מ עם האנטיביוטיקה המתאימה, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ברעידות-250 סל"ד. לחלץ פלסמידים מתרבות כל לילה על-ידי ערכת טיהור פלסמיד, בעקבות המדריך של היצרן ולאחר מכן שלח פלסמידים עבור רצפי DNA לפי הפרוטוקול של ספק השירות כדי לאשר את המוטציה stop codon על העמדות הנכונות.
  5. לאחסן את המתח עם הרצף הנכון ב-80 מעלות צלזיוס על ידי ערבוב µL 300-100% דימתיל סולפוקסיד ותרבות לילה 1 מ"ל.

2. הביטוי של החלבון Acetylated

  1. הוסף את הגנים של acetyllysyl אופטימיזציה-סינתזת המעביר33 וממוטב tRNAPyl 32 לתוך פלסמיד pTech . למקם את הגן המעביר tRNA תחת האמרגן מכוננת ל"י/נ . למקם את הגן tRNA תחת יזם קונסטיטוטיביות proK 34.
    1. שיתוף להפוך את וקטור ביטוי34 המכיל גן המכיל תגית מוטציה בנויים דהידרוגנאז, ו פלסמיד מחסה מערכת ההתאגדות acetyllysine ממוטבת, לתוך 25 µL המוסמכת המופשרים e. coli BL21(DE3) תאים על-ידי הלם החום 42 ° C s 10, ואת המקום על קרח במשך 5 דקות נוספות.
    2. פיפטה 600 µL של טמפרטורת החדר SOC מדיה לתוך התערובת דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ברעידות-סל ד 275, להפיץ µL 100 לצלחת עם סטרפטומיצין µg/mL 100 ו- 50 µg/mL כלורמפניקול, דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-275 סל ד.
  2. לאסוף את מושבה בודדת מהצלחת, לחסן לתוך המדיה LB טריים 15 מ"ל עם 100 סטרפטומיצין µg/mL ו µg 50/mL כלורמפניקול 50 מ ל צינור לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות במהירות של 250 סל"ד. העברת התרבות לילה 15 מ"ל למדיה LB טריים 300 מ עם אנטיביוטיקה בבקבוקון 1 ליטר, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-250 סל"ד.
  3. להמיס acetyllysine עם מים כדי ליצור פתרון מניות 100 מ מ, לאחסן ב 4 º C. להוסיף acetyllysine 5 מ מ, 20 מ מ nicotinamide (מעכב של deacetylases) למדיה צמיחה ספיגת מגיע ל 0.5 על 600 ננומטר.
    1. לגדל תאים עבור h 1 נוספים 37 ° C, רועדת-250 סל"ד, ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ מ IPTG ביטוי חלבון, ולגדול תאים 25 ° c בן לילה, ברעידות-180 סל ד.
      הערה: התנאים ביטוי ייתכן שיהיה עליך אופטימיזציה עבור חלבונים שונים.
  4. איסוף תאים על ידי צריך שתוציאו ב x 3000 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף תא כדורי עם פוספט באגירה מלוחים (PBS) המאגר (10 מ מ נה2HPO4, מ מ 1.8 ח'2PO4, מ מ 137 NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי). איסוף תאים שטף ב g 10,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ואחסן תא כדורי ב- 80 ° c

3. טיהור של החלבון Acetylated

  1. להפשיר את כדורי תא קפוא בקרח, וכן להשעות מחדש עם 15 מ"ל של מאגר פירוק (50 מ מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס) pH 7.8, 300 מ"מ NaCl imidazole 20 מ מ, 20 מ מ nicotinamide), 5 µL של β-mercaptoethanol, µL 1 Benzonase נוקלאז (250 יחידות).
  2. לשבור את התאים על ידי sonication 40 kHz-70% כוח פלט עם 10 מחזורים של 10 צרורות קצרים s, ואחריו במרווחים של 30 s לקירור כדי לחלץ גולמי טופס. צנטריפוגה גולמי לחלץ ב g x 20,000 עבור 25 דקות ב 4 º C. לסנן את תגובת שיקוע במסנן ממברנה של 0.45 מיקרומטר, לטעון לתוך עמודה המכילה 1 מ"ל של ניקל-nitrilotriacetic חומצה (Ni-נ) שרף equilibrated עם 20 מ של מים ו- 20 מ של פירוק מאגר.
    הערה: גם יכול להיות שבור תאים על ידי דטרגנטים קלים, אם sonication אינה זמינה.
  3. לשטוף את העמודה עם 20 מ של מאגר לשטוף (50 מ מ טריס pH 7.8, 300 מ"מ NaCl imidazole 50 מ מ, 20 מ מ nicotinamide) ולאחר מכן elute עם 2 מ"ל • תנאי מאגר (50 מ מ טריס pH 7.8, 300 מ"מ NaCl imidazole 150 מ מ, 20 מ מ nicotinamide).
  4. Desalt השבר • תנאי עם desalting מאגר (25 מ מ טריס pH 7.8 ו-10 מ"מ NaCl) לפי העמודה PD-10, בעקבות המדריך של היצרן. מודדים את ריכוז החלבון eluted על-ידי ביצוע ההוראה מהתרכובת assay חלבון ברדפורד. החלבון desalted מוכן לניסויים נוספים.
    הערה: להפוך את 50% מניות גליצרול של החלבון, ולשמור ב-80 מעלות לאחסון.

4. איפיון ביוכימי של החלבון Acetylated

  1. ניתוחים ספקטרומטר מרחביות-דף והמסה.
    1. Denature חלבונים עם נתרן dodecyl סולפט (מרחביות) דוגמת המאגר (5 µL חלבון דוגמה עם 2 µL 4 X מרחביות דוגמת המאגר) צינור 2 מ"ל ב 105 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, centrifuge את התערובת ב 2000 g x 10 s, עומס על גבי 4-20% נתרן dodecyl סולפט לזיהוי ג'ל electroph ג'ל oresis (מרחביות-עמוד), ריצה ב- 200 וולט למשך 30 דקות.
    2. לשטוף את הג'ל עם מים מזוקקים ומנערים בעדינות במשך 5 דקות, חזרה על התהליך 3 פעמים. למחוק את המים, מכתים את הג'ל עם כתם כחול Coomassie עבור h 1 ברעידות עדין. מבטל את מכתים את הג'ל עם מים מזוקקים, ללחוץ בעדינות במשך 30 דקות, ואני חוזר זה מבטל את כתם 3 פעמים.
    3. חותכים את הלהקה kDa 33 על Coomassie blue מוכתמת הג'ל מרחביות-דף, ולשלוח אותו ספקטרומטר מסה מתקנים או חברות כדי לאשר ש-acetyllysine סופחה במיקום מעוצב.
      הערה: הפרוטוקול של ספקטרומטר מסה ניתוח בעקבות הניסוי הקודם34.
  2. סופג המערבי
    1. הפעל את הג'ל מרחביות-דף עם הפרוטוקול באותו שלב 4.1. לאחר הג'ל לרוץ, משרים את הג'ל עם מאגר העברה (25 מ מ טריס, מ מ 192 גליצין, pH 8.3 ו 20% מתנול) למשך 15 דקות.
    2. הפעלה של 0.2 µm, 7 ס"מ 8.5 ס"מ polyvinylidene difluoride (PVDF) קרום עם מתנול עבור 1 דקות, ולשטוף עם מאגר העברה לפני הכנת הכריך העברה.
      הערה: מתנול הוא מסוכן במקרה של מגע עם העור, קשר עין, בליעה או שאיפה. חשיפת יתר חמורה יכולה לגרום למוות.
    3. להפוך את הכריך העברה מקטודה כדי אנודת (ספוג נייר סינון, עמודים מרחביות ג'ל, PVDF ממברנה, נייר סינון, ספוג). להכניס את המחסנית למיכל העברה, להפעיל זרם קבוע של 350 mA למשך 45 דקות.
      הערה: זמן ההעברה עשוי להזדקק אופטימיזציה.
    4. לשטוף את הקרום PVDF עם 25 מ ל באגירה טריס מלוחים, 0.1% Tween 20 (TBST) (137 מ מ NaCl, 20 מ מ. טריס, 0.1% Tween-20, pH 7.6) המאגר עבור חמש דקות עם טלטול עדין. לחסום את הקרום עם 5% שור אלבומין (BSA) במאגר TBST לשעה בטמפרטורת החדר.
    5. דגירה הקרום עם נוגדנים acetyllysine מצומדת HRP עם ריכוז סופי של 1 µg/mL מדולל עם 5% BSA ב- TBST ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם טלטול עדין.
      הערה: לקבלת תוצאות מהר יותר, שלב זה יכול להתבצע בטמפרטורת החדר מאובטח. הדילול של נוגדן עשוי להזדקק אופטימיזציה.
    6. לשטוף את הקרום עם 20 מ ל מאגר TBST עבור חמש דקות עם טלטולים עדינים, חוזרים על השלב 4 פעמים. להחיל את המצע chemiluminescence על הקרום לפי הוראות היצרן. ללכוד את האות עם imager המצלמה מבוסס תשלום מצמידים מכשיר (CCD).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התשואה של חלבון MDH acetylated היה 15 מ ג לכל תרבות 1 ליטר, בזמן זה של פראי-סוג MDH היה 31 מ ג 1 ליטר תרבות. חלבונים מטוהרים נותחו על ידי עמודים מרחביות, כפי שמוצג באיור1. MDH פראי-סוג שימש בקרה חיובית34. חלבון מטוהרים מתאי מסתירים את המערכת ההתאגדות acetyllysine (AcK) ואת הגן המוטנטי mdh , אך ללא אישור בתקשורת צמיחה, שימש פקד שלילי. ליזין acetylation של חלבונים מטוהרים זוהה על-ידי המערב סופג שימוש acetyllysine-הנוגדן כמוצג באיור2. Acetylation של השאריות ליזין 140 ב דהידרוגנאז בנויים אושר ע י ניתוח ספקטרומטר מסה טנדם, כפי שמוצג באיור3.

חלבון הרצף של חלבון MDH (השבר לניתוח MS טנדם היא באותיות מודגשות):

MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDAT
PALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAA
EVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGV
SFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAY
VEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK

חלבון רצף acetyllysyl אופטימיזציה-סינתזת המעביר33:

MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEISRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRPARAFRYHKY
RKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSEPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKAST
DTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRR
KKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKN
FCLRPMMAPNLLNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRE
NLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGF
GLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL

רצף גנים של tRNA ממוטבPyl 32:

GGAAACGTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGTGGGGTTAGATTCCCC
ACGTTTCCGCCA

Figure 1
איור 1 : Coomassie blue מוכתמת מרחביות-דף ג'ל של מטוהרים MDH באורך מלא, שלה משתנה המכיל AcK. אמצעי האחסון באותו • תנאי שברים היו טעונים אל הדף מרחביות-ג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : סופג המערבי של מטוהרים פראי-סוג MDH ו שלה משתנה המכיל AcK. אמצעי האחסון באותו • תנאי שברים היו טעון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : LC-MS/MS ניתוח של variant המכיל AcK MDH. טנדם המוני הספקטרום של פפטיד (שאריות 135-142) AGVYDKACNK מ variant MDH acetylated מטוהרים. KAC מציין ומונה ההתאגדות. ניתן לקרוא על רצף פפטיד המכיל את אישור חלקי המבואר b או y יון בסדרה. פסגות מתאימים היו בצבע אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שילוב גנטי של חומצות אמינו noncanonical (ncAAs) המבוסס על דיכוי codon שהוקצו, בעיקר אמבר stop codon UAG36,37,38,39, על ידי סינתזת טעון-ncAA המכילה את anticodon המתאים. כידוע, codon UAG מזוהה על-ידי שחרור הפקטור-1 (RF1) של חיידקים, זה ניתן גם לדכא מאת ליד tRNAs cognate ממחשבים מארחים הנגבים על ידי חומצות אמינו קאנוני (cAAs) כגון ליזין וטירוזין40,41. ? אז, היעילות של התאגדות המכללות-codon UAG תלוי התחרות בין tRNAs לבין RF1, טעון-ncAA בזמן הטוהר של התאגדות המכללות מסתמך על התחרות בין tRNAs טעון-ncAA, טעון לסי ליד cognate tRNAs. תשואה נמוכה וטוהר של החלבון היעד acetylated עלולה להיגרם על ידי יעילות נמוכה התאגדות של זוג אורתוגונלית הציג לתוך התאים מארח. ניתן לפתור בעיה זו על-ידי הגדלת ריכוז acetyllysine בתקשורת, שימוש לאחרונה ממוטב acetyllysine התאגדות מערכות, אשר גדל הדיכוי codon UAG 58 פעמים32,33, שניהם יעילות וטוהר התאגדות acetyllysine תהיה משופרת. באיור איור 1 , השוואת תשואות חלבון, היעילות של התאגדות acetyllysine היה כ-50%, ולא היה אין לזיהוי חלבונים מטוהרים מתאי מחסה המערכת התאגדות AcK, את גן המוטציה של MDH, אך ללא אישור ב מדיה צמיחה, אשר ציינו את טוהר גבוהה התאגדות acetyllysine. יתר על כן, ניתוח ספקטרומטר מסה גם לא הראה כל cAAs במיקום 140 של MDH, המציין את ההומוגניות של שיתוף acetyllysine.

קיימות שתי מגבלות העיקרי של גישה זו. ראשית, בגלל התחרות של tRNA טעון-acetyllysine עם שני RF1, טעון לסי בקרבת tRNAs cognate המתוארים לעיל, כיום, המספר המרבי של משקעים acetyllysine זה ניתן לשלב בו זמנית לתוך חלבון בודד הוא 3 33,42. שנית, תאים יש סוגים אחרים של deacetylases, אשר להתנגד nicotinamide, ייתכן deacetylate חלבונים יעד מסוימים. אז, אלה חלבונים לא יכול להגיע acetylation 100% באתרים ספציפיים. לאחרונה, הקמנו מערכת ההתאגדות thio-acetyllysine אשר יכול לשמש אנלוגי הלא-deacetylable של acetyllysine43, לכן מערכת זו יכולה להיות גישה אלטרנטיבית טובה במקרה הזה.

כפי שהוזכר קודם לכן, הגישה הקלאסית לאפיין מבחינה ביוכימית ליזין acetylation משתמש מוטגנזה. גלוטמין משמש חיקוי של acetyllysine, ארגינין מנוצל כמו חיקוי ליזין acetylated. עם זאת, שניהם מחקה אינם isosteres אמיתי, לא תמיד יניבו את התוצאות הצפויות30. אסטרטגיית הרחבת הקוד הגנטי יכול לייצר חלבונים homogeneously acetylated-ליזין ספציפי משקעים, וזו הדרך הכי קפדניות כדי לאפיין חלבונים acetylated.

מערכת התאגדות גנטי acetyllysine היה נגזר על זוג pyrrolysyl-סינתזת המעביר גרסאות ולאחר שלהם tRNA cognate מן Methanosarcinaceae מינים, אשר ידוע גם להיות אורתוגונלית ב פרוקריוטים44. מחקרים קודמים הראו כי מערכת זו יכול להיות מיושם בתרבית של תאים, חיות מסוימות עבור חלבון acetylation מחקרים39, ובכך בפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מורחבת בתרבית של תאים ובעלי אפילו עבור יישומים רחב יותר רפואי המחקר והתעשייה. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא גם בעיקרון באותו פרוטוקול המשמש כדי לשלב סוגים שונים של ncAAs, המחייב שינוי פשוט זוג אורתוגונלית הציג לתוך התאים מארח.

ליזין deacetylases (KDACs) הסר קבוצת אצטיל השאריות ליזין acetylated ב חלבונים45. הסוג sirtuin קוב הוא deacetylase ידועים רק ב e. coli, אשר יכול להיות מעוכבים על ידי nicotinamide27. אז, כדי למנוע את deacetylation של חלבון acetylated שנוצרו במהלך צמיחת תאים וטיהור חלבונים, 20 עד 50 מ"מ nicotinamide להוסיף מדיה צמיחה והן טיהור מאגרי. לאחר טיהור, acetylation של ליזין שאריות הוא יציב יחסית בגלל חוסר של deacetylase. שנית, כדי להוריד את הרקע של acetylation לא ספציפית על אחרים שאריות ליזין החלבון, BL21 המתח (DE3) שימש המתח ביטוי, בשל רמתו נמוך משמעותית של חלבון acetylation מאשר זנים K12-derived נפוץ46 . כפי שמוצג באיור2, MDH פראי-סוג ביטוי מתאי BL21(DE3) היה לא acetylation לזיהוי על-ידי סופג המערבי. זהו גורם חשוב אחר כדי להגדיל את הטוהר של acetylation חלבון המטרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH (AI119813), על הסטארט-אפ של אוניברסיטת ארקנסו, ופרס ממוסד החיים ארקנסו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford protein assay Bio-Rad 5000006 Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain Bio-Rad 1610786 SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel Bio-Rad 4561093 Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate) Cell Signaling 6952 Antibody
IPTG CHEM-IMPEX 194 Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine CHEM-IMPEX 5364 Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column GE Healthcare 17085101 Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit NEB E0554 Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells NEB C2527 Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Extracting plasmids
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 Affinity purification resin
nicotinamide Sigma-Aldrich N3376 Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent Sigma-Aldrich 70584 Breaking cells
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNase
ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 Chemiluminescence
Premixed LB Broth VWR 97064 Cell growth medium
Bovine serum albumin VWR 97061-416 western blots blocking

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
  2. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  3. Walsh, C. T. Posttranslational modification of proteins : expanding nature's inventory. , Roberts and Company Publishers. Englewood, Colorado. (2006).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
  5. Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
  6. Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
  7. Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science's STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42 (2004).
  8. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
  9. Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
  10. Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation? The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
  11. Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
  12. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
  13. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
  14. Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
  15. Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
  16. Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
  17. Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
  18. Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
  19. You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
  20. Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E. Histone acetylation in neuronal (dys)function. Biomol Concepts. 7 (2), 103-116 (2016).
  21. Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
  22. Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
  23. Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
  24. Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
  25. Jones, J. D., O'Connor, C. D. Protein acetylation in prokaryotes. Proteomics. 11 (15), 3012-3022 (2011).
  26. Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
  27. Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
  28. Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
  29. Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
  30. Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M. Autoacetylation of the histone acetyltransferase Rtt109. J Biol Chem. 286 (28), 24694-24701 (2011).
  31. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  32. Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156 (2015).
  33. Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
  34. Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
  35. Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
  36. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  37. Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D. Rewriting the Genetic Code. Annu Rev Microbiol. , (2017).
  38. O'Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
  39. Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
  40. O'Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
  41. Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O'Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).
  42. Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
  43. Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
  44. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  45. Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
  46. Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).

Tags

אימונולוגיה גיליון 130 חלבון acetylation השינוי post-translational הרחבת הקוד הגנטי חומצות אמינו noncanonical בנויים דהידרוגנאז ביולוגיה סינתטית
פרוטוקול נתיישב לייצר חלבונים Site-Specifically Acetylated <em>Escherichia Coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venkat, S., Gregory, C., Meng, K.,… More

Venkat, S., Gregory, C., Meng, K., Gan, Q., Fan, C. A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (130), e57061, doi:10.3791/57061 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter