Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Легковесные протокол для создания Site-Specifically ацетилированный белков в Escherichia Coli

Published: December 9, 2017 doi: 10.3791/57061
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

Summary

Генетический код расширения служит мощным инструментом для изучения широкий спектр биологических процессов, включая белка ацетилирования. Здесь мы демонстрируем, что снисходительный протокол использовать этот метод для генерации однородно ацетилированные белков в конкретных местах в клетках Escherichia coli .

Abstract

Показано, что столб-поступательные изменения, которые происходят в определенных позициях белков, играют важную роль в различных клеточных процессов. Среди них реверсивные лизин ацетилирования является одним из наиболее широко распространены во всех сферах жизни. Хотя были проведены многочисленные исследования acetylome массы на основе спектрометрии, далее характеристика этих целей предполагаемого ацетилирования был ограниченным. Одна из возможных причин является, что это трудно создать чисто ацетилированный белков в желаемой позиции, большинство классических биохимических подходов. Для преодоления этой проблемы, был применен метод расширения генетического кода использовать пары инженерии pyrrolysyl ТРНК синтетазы вариант и его родственных tRNA из Methanosarcinaceae видов, для прямого включения cotranslational из acetyllysine на конкретной площадке в протеина интереса. После первого применения в исследовании ацетилирование гистонов этот подход способствовал ацетилирования исследования на различных белков. В этой работе мы продемонстрировали снисходительный протокол производить site-specifically ацетилированный белки, используя модель бактерией Escherichia coli в качестве принимающей страны. Дегидрогеназа малат был использован как демонстрационный пример в этой работе.

Introduction

Столб-поступательные изменения (PTMs) белков происходят после процесса перевода и возникают от ковалентных добавления функциональных групп аминокислотных остатков, играя важную роль в почти всех биологических процессов, в том числе ген Транскрипция, реакции на стресс, клеточной дифференцировки и метаболизм1,2,3. На сегодняшний день, около 400 отличительные PTMs были определены4. Замысловатость генома и протеома в значительной степени усугубляется белка PTMs, как они регулируют активность белка и локализации и влияет на взаимодействие с другими молекул, таких как белки, нуклеиновые кислоты, липиды и кофакторы5.

Белка ацетилирования был на переднем крае PTMs исследований в последние два десятилетия6,,78,9,10,11,12. Лизин ацетилирования был впервые обнаружен в гистонами более чем 50 лет назад13,14, были хорошо изучены и как известно, существуют в более чем 80 факторов транскрипции, регуляторы и различных белков15, 16,17. Исследования на ацетилирование белка не только предоставили нам более глубокое понимание ее механизмов регулирования, но также руководствуется лечения целого ряда заболеваний, вызванных неблагополучных ацетилирования18,19, 20 , 21 , 22 , 23. считалось, что лизин ацетилирования происходит только в клетках эукариот: у, но недавние исследования показали, что белки ацетилирования также играет ключевую роль в бактериальных физиологии, в том числе хемотаксис, кислотоустойчивость, активации и стабилизации острова патогенности и другие вирулентности связанных белков24,25,26,27,,2829.

Часто используемый метод биохимически характеризовать ацетилирования лизин является использование сайта Направленный мутагенез. Глютамин используется как имитировать acetyllysine из-за его аналогичного размера и полярности. Аргинин используется как лизин ацетилированные мнемосхемы, поскольку она сохраняет свой положительный заряд в физиологических условиях, но не может быть ацетилированные. Однако оба имитирует не реальная isosteres и не всегда дают ожидаемые результаты30. Наиболее строгий подход заключается в создании однородно ацетилированный белков в конкретных лизин остатков, который является трудным или невозможным для самых классических методов из-за низкой стехиометрии ацетилирования лизина в природе7,11. Эта задача была разгадана, стратегия расширения генетического кода, который использует инженерии pyrrolysyl тРНКГлу-синтетаза вариант от Methanosarcinaceae видов для зарядки tRNAпыль с acetyllysine, использует принимающей трансляционная техника для подавления UAG остановить кодон в мРНК и направляет включение acetyllysine в положение целевого белка31. Недавно мы оптимизировали этой системы с улучшение EF-ту привязки tRNA32 и модернизированный acetyllysyl ТРНК синтетазы33. Кроме того мы применили этой системы расширения включения в исследования ацетилирования малат дегидрогеназа34 и тирозил тРНК синтетазы35. Здесь мы демонстрируем протокол для генерации чисто ацетилированный белки от молекулярного клонирования для биохимической идентификации с помощью малат дегидрогеназа (MDH), который мы тщательно изучили как яркий пример.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. сайт Направленный мутагенез целевого гена

Примечание: MDH выражается под T7 промоутер в векторе ПХДФ-1 с CloDF13 происхождения и копировать количество 20-40-34.

  1. Ввести янтаря стоп кодон в позиции 140 гена грунтовки (вперед грунтовка: GGTGTTTATGACтегAACAAACTGTTCGGCG и обратить вспять грунтовка: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), следуя инструкциям сайта Направленный мутагенез комплекта.
  2. Усилить плазмида шаблон, содержащий Джин одичал тип малат дегидратазы и вставьте стоп кодон мутации полимеразной цепной реакции (ПЦР) реакции. В реакционной смеси, включают 12,5 мкл 2 X ДНК полимераза фермент смесь, 1,25 мкл 10 мкм вперед грунт, 1,25 мкл 10 мкм обратный грунт, 1 мкл шаблона ДНК (20 нг/мкл) (ПХДФ-1 плазмида, содержащие ген MDH одичал типа) и 9 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
    1. Используйте параметры реакции PCR следующим: первоначальный денатурации на 98 ° C за 30 сек; 25 циклов 10 s на 98 ° C, 30 сек при 55 ° C и 3 мин при 72 ° C; окончательное расширение при 72 ° C на 3 мин. После ПЦР добавьте усиленный материал непосредственно к смеси фермента протеинкиназы-лигаза-ДПНИ из комплекта за 1 ч при комнатной температуре для удаления рецензий и шаблон.
      Примечание: Реакционную смесь содержит 1 мкл ПЦР продукта, 5 мкл 2 X буфер реакции, 1 мкл 10 X киназы-лигаза-ДПНИ смеси ферментов, и 3 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
  3. Добавить 5 мкл реакция смеси для трубки 25 мкл талой сведущее Escherichia coli DH5α клеток из комплекта. Тщательно проведите трубки смешивать и поместите смесь на льду на 30 мин теплового шока смесь при 42 ° C 30 s, и место на льду для дополнительных 5 мин.
    1. Пипетка 600 мкл комнатной температуры Супер Оптимал бульон с Catabolite репрессий (SOC) СМИ из комплекта в смесь, инкубации при 37 ° C 60 мин с встряхивания на 250 об/мин, распространение 100 мкл на lysogeny бульон (LB) агар пластину с соответствующими антибиотиками и инкубировать на ночь при 37 ° C при встряхивании в 250 об/мин.
  4. Выбрать 4-6 единого колоний в 6 мл свежего LB СМИ с соответствующими антибиотиками и проинкубируйте при 37 ° C ночь с встряхивания на 250 об/мин. Извлечь плазмид из каждой ночи культуры, комплект очистки плазмида, после руководство производителя, а затем отправить плазмиды для секвенирования ДНК согласно протоколу поставщика услуг для подтверждения остановки кодон мутации в правильной позиции.
  5. Храните штамма с правильной последовательности при температуре-80 ° C, смешивая 1 мл ночь культуры и 300 мкл 100% ДМСО.

2. выражение ацетилированный белка

  1. Вставьте гены оптимизированный acetyllysyl ТРНК синтетазы33 и оптимизированный tRNA 32 пыль в плазмиду pTech . Место tRNA синтетаза гена под учредительного lpp промоутер. Место tRNA гена под учредительный прок промоутер34.
    1. Совместное преобразование вектора выражения34 , содержащие мутировавших генов TAG-содержащих малат дегидрогеназы, и плазмиды, укрывательство включение системы оптимизированного acetyllysine, в 25 мкл талой компетентным E. coli BL21(DE3) клетки теплового шока при 42 ° C 10 s, и место на льду для дополнительных 5 мин.
    2. Пипетка 600 мкл комнатной температуре SOC СМИ в смесь, инкубации при 37 ° C 60 мин при встряхивании в 275 об/мин, распространение 100 мкл на тарелку с 100 мкг/мл стрептомицина и 50 мкг/мл хлорамфеникола и инкубировать на ночь при 37 ° C при встряхивании в 275 об/мин.
  2. Возьмите одной колонии от плиты и инокуляции в 15 мл свежего LB СМИ с 100 мкг/мл стрептомицина и хлорамфеникол 50 мкг/мл в 50 мл трубки на ночь при 37 ° C при встряхивании со скоростью 250 об/мин. Передача на ночь культуры 15 мл 300 мл свежего LB СМИ с антибиотиками в колбе 1 Л и инкубировать при 37 ° C с встряхивания на 250 об/мин.
  3. Растворяют acetyllysine с водой, чтобы сделать Стоковый раствор 100 мм, хранить при 4 ° C. Добавить acetyllysine 5 мм и 20 мм никотинамид (ингибитор комплексы) в СМИ роста когда поглощения достигает 0,5 на 600 Нм.
    1. Расти клеток для дополнительного 1 ч при 37 ° C, тряски на 250 об/мин, затем добавить 0,5 мм ИПТГ для выражения протеина и расти клеток при 25 ° C на ночь, с встряхивания на 180 об/мин.
      Примечание: Выражения условий может потребоваться оптимизация для различных белков.
  4. Собрать клетки центрифугированием в 3000 x g при 4 ° C на 15 мин, отбросить супернатанта и мыть ячейки окатышей с фосфат амортизированное физиологический (PBS) буфера (10 мм Na2HPO4, 1.8 мм х2PO4, 137 мм NaCl, 2.7 KCl). Собирать вымыть клетки на 10000 x g при 4 ° C за 5 мин, удалить супернатант и хранить клетки окатышей на-80 ° C.

3. Очистка ацетилированный белка

  1. Оттепель замороженных клеток окатышей на льду и вновь приостановить с 15 мл буфера lysis (50 мм трис (гидроксиметил) aminomethane (Tris) рН 7,8, 300 мм NaCl, имидазола 20 мм и 20 мм никотинамид), 5 мкл β-меркаптоэтанол и 1 мкл Benzonase Нуклеаза (250 единиц).
  2. Разбить ячейки на sonication 40 кГц на 70% мощности с 10 циклов 10 коротких очередей s, а затем каждые 30 s для охлаждения в виде сырой экстракт. Центрифуга сырой экстракт на 20000 x g 25 мин при 4 ° C. Фильтр супернатант с 0,45 мкм мембранный фильтр и загрузить в столбец, содержащий 1 мл никель Нитрилотриуксусная кислота (Ni-НТА) смолы достижение равновесного уровня с 20 мл воды и 20 мл буфера lysis.
    Примечание: Клетки также может быть нарушена мягкими моющими средствами, если sonication не доступен.
  3. Промойте колонку с 20 мл буфера мытья (имидазола 50 мм, 50 мм трис рН 7,8, 300 мм NaCl и никотинамид 20 мм), а затем элюировать с 2 мл буфера (50 мм трис рН 7,8, 300 мм NaCl, имидазола 150 мм и 20 мм никотинамид).
  4. Опреснения элюции дроби с обессоливания буфера (25 мм трис pH 7,8 и 10 мм NaCl) в столбце адаптер PD-10, следуя инструкцией производителя. Измерьте концентрацию eluted белка, следуя инструкции реагента assay протеина Брэдфорд. Обессоленной белок готова для дальнейших экспериментов.
    Примечание: Сделайте запас глицерина 50% белка и храните в-80 ° C для хранения.

4. биохимическая характеристика ацетилированный белка

  1. SDS-PAGE и масс спектрометрии анализы.
    1. Денатурировать белки с натрия Додециловый сульфат (SDS) буфер образца (5 мкл белка образца с 2 мкл 4 X буфер образца SDS) в 2-мл пробирку при 105 ° C за 5 мин, центрифуга смеси на 2000 x g 10 s, нагрузка на 4-20% натрия Додециловый сульфат полиакриламидный гель electroph гель oresis (SDS-PAGE) и запустить на 200 V за 30 мин.
    2. Промойте гель с дистиллированной водой и поколебать мягко в течение 5 минут, повторяя этот процесс 3 раза. Слейте воду и пятно гель с Кумасси синий пятно за 1 час с нежным встряхивания. Де краситель гель с дистиллированной водой, слегка встряхните 30 мин, и повторите, это снять пятно 3 раза.
    3. Вырезать группу на 33 кДа на Кумасси синим окрашенных геля SDS-PAGE и отправить его в масс-спектрометрии зал или компании, чтобы убедиться, что acetyllysine была включена в положение.
      Примечание: В протоколе анализа масс-спектрометрии вслед за предыдущий эксперимент34.
  2. Западный Blotting
    1. Запустите геля SDS-PAGE для одного протокола на шаге 4.1. После запуска гель Замочите гель с буфера передачи (25 мм трис, 192 мм глицин, pH 8.3 и 20% метанола) за 15 мин.
    2. Активировать 0,2 мкм, 7 x 8.5 см винилидена фторид (PVDF) мембраны с метанолом за 1 мин и промыть передачи буфера перед подготовкой передачи сэндвич.
      Примечание: Метанол является опасным в случае контакта с кожей, зрительный контакт, при приеме внутрь или ингаляции. Тяжелые чрезмерное воздействие может привести к смерти.
    3. Сделайте бутерброд передачи от катода к аноду (Губка, Бумага фильтровальная, SDS-PAGE гель, PVDF мембрану, фильтровальная бумага и Губка). Поместить в стек в передаче танк, на постоянный ток 350 мА по 45 мин.
      Примечание: Время переноса может потребоваться оптимизация.
    4. Вымойте PVDF мембрану с 25 мл трис буфер солевой, 0.1% 20 анимации (TBST) (137 мм NaCl, 20 мм трис, 0,1% Tween-20, pH 7,6) буфер для 5 мин с нежным встряхивания. Блокировать мембраны с 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в TBST буфер для 1 ч при комнатной температуре.
    5. Проинкубируйте мембрану с ПХ конъюгированных acetyllysine антитела с конечной концентрации 1 мкг/мл разбавляют 5% BSA в TBST на 4 ° C на ночь с нежным встряхивания.
      Примечание: Для быстрых результатов этот шаг может быть выполнена в комнатной температуре в течение 1 ч. Разбавления антитела может потребоваться оптимизация.
    6. Вымойте мембраны с буфером TBST 20 мл на 5 мин с нежно тряска, повторив шаг 4 раза. Применить хемилюминесценции субстрата к мембране, следуя инструкциям производителя. Захват сигнала с зарядовой (связью ПЗС) на основе камеры тепловизор.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Доходность ацетилированный MDH белка был 15 мг на 1 Л культуры, в то время как одичал тип MDH-31 мг на 1 Л культуры. Очищенные белки были проанализированы на SDS-PAGE, как показано на рисунке 1. MDH одичал тип использовался в качестве позитивного управления34. Белка, очищенного от клетки укрывательство включение системы acetyllysine (AcK) и ген мутанта mdh , но без AcK в СМИ роста, использовался в качестве отрицательного контроля. Лизин ацетилирования очищенных белков был обнаружен с помощью западных blotting антитела acetyllysine, как показано на рисунке 2. Ацетилирование остатков лизина 140 в малат дегидрогеназа был подтвержден тандемные масс-спектрометрии анализа как показано на рисунке 3.

Белка последовательность MDH белка (фрагмент тандем MS анализа является полужирным шрифтом):

MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDAT
PALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAA
EVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGV
SFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAY
VEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK

Белка последовательность оптимизированный acetyllysyl ТРНК синтетазы33:

MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEISRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRPARAFRYHKY
RKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSEPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKAST
DTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRR
KKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKN
FCLRPMMAPNLLNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRE
NLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGF
GLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL

Последовательность гена оптимизированный tRNAPyl 32:

GGAAACGTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGTGGGGTTAGATTCCCC
ACGTTTCCGCCA

Figure 1
Рисунок 1 : Кумасси синим окрашенных геля SDS-PAGE очищенный полнометражного MDH и его AcK содержащих вариант. Же объемы элюции фракций были загружены на SDS-PAGE гель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Западный blotting очищенный MDH одичал тип и вариант его AcK содержащих. Же объемы элюции фракций были загружены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : LC-MS/MS анализ вариант AcK содержащих MDH. Тандем массовых спектр пептида (остатки 135-142) AGVYDKACНК из очищенного ацетилированный MDH вариант. KAC обозначает AcK инкорпорации. Частичная последовательность пептид, содержащие AcK можно прочитать из аннотированной b или y Ион серии. Соответствием пики были красного цвета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Генетических включение канонические аминокислот (ncAAs) основана на подавление назначенного кодон, главным образом янтаря стоп кодон UAG36,37,38,39, ncAA заряженные tRNA содержащие соответствующие антикодон. Как известно, UAG кодон признается выпуска фактор-1 (RF1) бактерий, и это может также быть подавлено вблизи родственных tRNAs от узлов, взимаемые канонические аминокислоты (cAAs) как лизин и тирозина40,41. Таким образом эффективность ncAA включение в UAG кодон зависит от конкуренции между ncAA заряженные tRNAs и RF1, в то время как чистота ncAA включение зависит от конкуренции между ncAA заряженные tRNAs и УГА заряженные вблизи родственных tRNAs. Низкая урожайность и чистоту целевого ацетилированные белка может быть вызвано низким включение эффективность ортогональных пары, введены в клетки хозяина. Эта проблема может быть решена путем увеличения концентрации acetyllysine в средствах массовой информации, и с помощью недавно оптимизированный acetyllysine включения систем, которые увеличились подавления кодон UAG 58 раз32,33, оба повысится эффективность и чистоту acetyllysine включения. Как показано на рисунке 1 и сравнивая урожайность белка эффективность acetyllysine включения был около 50% и там было не обнаружено белка, очищенного от клетки укрывательство системы включения AcK и мутантный ген MDH, но без AcK в рост СМИ, который указал высокой чистоты acetyllysine включения. Кроме того масс-спектрометрия анализ также не показывают любой угас в позиции 140 MDH, указывающее однородности acetyllysine включения.

Существует два основных ограничения такого подхода. Во-первых, из-за конкуренции acetyllysine заряженные tRNA с обеих RF1 и УГА заряженные вблизи родственных tRNAs, описанных выше, в настоящее время, максимальное количество acetyllysine остатков, которые могут быть одновременно включены в один белок-три 33,42. Во-вторых клетки имеют другие комплексы, которые сопротивляются никотинамид и может deacetylate определенных целевых белков. Таким образом эти белки не может достичь 100% ацетилирования на определенных сайтах. Недавно мы создали Тио acetyllysine включения системы, которая может использоваться в качестве не deacetylable аналог acetyllysine43, таким образом эта система может быть хорошим альтернативным подходом в этом случае.

Как упоминалось ранее, классический подход к биохимически характеризуют лизин ацетилирования использует сайт Направленный мутагенез. Глютамин используется как имитировать acetyllysine, и аргинин используется как лизин ацетилированные мнемосхемы. Однако оба имитирует не являются реальным isosteres и не всегда дают ожидаемые результаты30. Стратегия расширения генетического кода может генерировать однородно ацетилированный белков в конкретных лизин остатков, который является самым строгим способом охарактеризовать ацетилированный белков.

Генетическая включение системы для acetyllysine взята из пары pyrrolysyl ТРНК синтетазы вариантов и их родственных tRNA от Methanosarcinaceae вида, который также известен быть ортогональным эукариоты44. Предыдущие исследования показали, что эта система могла бы применяться в mammalian клетках и некоторых животных белков ацетилирования исследования39, таким образом настоящий Протокол может быть расширена для mammalian клеток и даже животных для более широкого применения в медицинской исследования и промышленность. Кроме того этот протокол также является по сути тот же протокол, используемый для включения различных видов ncAAs, требуя простое изменение ортогональных пара, введены в клетки хозяина.

Лизин комплексы (KDACs) удалите ацетильную группу из остатков ацетилированный лизина в белки45. Sirtuin тип Кобб является только известных деацетилаз в E. coli, который может быть ингибируется никотинамид27. Таким образом чтобы предотвратить диацетилморфина ацетилированный белка, созданные во время роста клеток и очищение протеина, никотинамид 20 до 50 мм следует добавить рост СМИ и очистки буферов. Как только очищенный, ацетилирования остатков лизина является относительно стабильным из-за недостатка гистонов. Во-вторых чтобы снизить на фоне неспецифического ацетилирования в других остатков лизина в протеине, BL21 штамм (DE3) был использован в качестве выражение напряжение, из-за его значительно ниже уровня белка ацетилирования часто используемых штаммов K12-производные46 . Как показано на рисунке 2, одичал тип MDH, выразил от BL21(DE3) клеток была не обнаружено ацетилирования Западный blotting. Это еще один важный фактор для повышения чистоты ацетилирования в целевого белка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH (AI119813), запуск из университета Арканзас и награда от Институт бионауки Арканзас.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford protein assay Bio-Rad 5000006 Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain Bio-Rad 1610786 SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel Bio-Rad 4561093 Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate) Cell Signaling 6952 Antibody
IPTG CHEM-IMPEX 194 Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine CHEM-IMPEX 5364 Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column GE Healthcare 17085101 Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit NEB E0554 Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells NEB C2527 Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Extracting plasmids
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 Affinity purification resin
nicotinamide Sigma-Aldrich N3376 Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent Sigma-Aldrich 70584 Breaking cells
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNase
ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 Chemiluminescence
Premixed LB Broth VWR 97064 Cell growth medium
Bovine serum albumin VWR 97061-416 western blots blocking

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
  2. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  3. Walsh, C. T. Posttranslational modification of proteins : expanding nature's inventory. , Roberts and Company Publishers. Englewood, Colorado. (2006).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
  5. Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
  6. Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
  7. Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science's STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42 (2004).
  8. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
  9. Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
  10. Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation? The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
  11. Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
  12. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
  13. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
  14. Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
  15. Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
  16. Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
  17. Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
  18. Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
  19. You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
  20. Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E. Histone acetylation in neuronal (dys)function. Biomol Concepts. 7 (2), 103-116 (2016).
  21. Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
  22. Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
  23. Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
  24. Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
  25. Jones, J. D., O'Connor, C. D. Protein acetylation in prokaryotes. Proteomics. 11 (15), 3012-3022 (2011).
  26. Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
  27. Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
  28. Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
  29. Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
  30. Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M. Autoacetylation of the histone acetyltransferase Rtt109. J Biol Chem. 286 (28), 24694-24701 (2011).
  31. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  32. Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156 (2015).
  33. Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
  34. Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
  35. Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
  36. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  37. Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D. Rewriting the Genetic Code. Annu Rev Microbiol. , (2017).
  38. O'Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
  39. Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
  40. O'Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
  41. Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O'Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).
  42. Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
  43. Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
  44. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  45. Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
  46. Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).

Tags

Иммунология выпуск 130 белка ацетилирования столб-поступательные изменения генетический код расширения канонические аминокислоты малат дегидрогеназа синтетической биологии
Легковесные протокол для создания Site-Specifically ацетилированный белков в <em>Escherichia Coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venkat, S., Gregory, C., Meng, K.,… More

Venkat, S., Gregory, C., Meng, K., Gan, Q., Fan, C. A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (130), e57061, doi:10.3791/57061 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter