Summary
Her rapporterer vi et enkelt og rimelig sølv flekker protokollen som krever bare tre reagenser og 7 min behandling, og er egnet for rask generasjon av høy kvalitet SSR data i genetisk analyse.
Abstract
Enkel sekvens gjenta (SSR) er en av de mest effektive markørene brukes i plante- og genetisk forskning og molekylære avlsprogram. Sølv flekker er en mye brukt metode for påvisning av SSR markører i en polyakrylamid gel. Men er konvensjonelle protokoller for sølv flekker teknisk krevende og tidkrevende. Som mange andre biologiske laboratorier har teknikker, sølv Fargeprotokoller stadig blitt optimalisert for å forbedre effektiviteten deteksjon. Her rapporterer vi et forenklet sølv flekker metode som betydelig reduserer reagens kostnader og forbedrer oppdagelsen oppløsning og klarhet. Den nye metoden krever to hovedtrinn (impregnering og utvikling) og tre reagenser (sølv nitrat, natriumhydroksid og formaldehyd), og bare 7 minutter behandling for en ikke-denaturing polyakrylamid gel. Sammenlignet med tidligere rapportert protokoller, denne nye metoden er enklere, raskere og bruker færre kjemiske reagenser til SSR gjenkjenning. Derfor fordelen denne enkel, rimelig og effektiv sølv flekker protokollen genetisk kartlegging og markør-assistert avl av en rask generasjon SSR markøren dataene.
Introduction
Utviklingen av PCR-baserte markører har revolusjonert vitenskapen om anlegget genetikk og avl1. Enkel sekvens gjenta (SSR) markører er blant de mest brukte og mest allsidige DNA-markørene. Deres bred genomet dekning, overflod, genomet spesifisitet og repeterbarhet er noen av fordelene ved SSR markører i tillegg til sin codominant arv for påvisning av heterozygote genotyper2. Flere studier har brukt SSR markører å undersøke genetisk mangfold, følge forfedre, konstruerer genetisk kobling kart og kart gener for økonomisk viktigste trekk3,4.
PCR produkter for SSR skilles vanligvis bruker agarose eller polyakrylamid gel geleelektroforese og deretter visualisert med sølv flekker eller under UV-lys etter farging med ethidium bromide. Sølv farging av DNA i polyakrylamid gels er mer følsomme enn andre flekker metoder5,6 og har vært mye brukt til å oppdage DNA fragmenter som SSR markører7.
Som mange biologiske laboratorier teknikker, har sølv flekker polyakrylamid gelé stadig økt siden sin første rapporteres som et fragment visualisering teknikk i 19798. Teknikken ble først endret for oppdagelsen av DNA fragmenter av Bassam et al. 6 i 1991 og deretter forbedret av Sanguinetti og kolleger9 i 1994. Metoden er blitt fremme optimert i de siste par tiår6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. men de fleste av disse oppdaterte versjoner av protokollene har fortsatt noen ulemper som høy teknisk etterspørsel og lenge saksbehandlingstid for fiksering og montering6, som begrenser anvendelsen av disse protokollene7, 11. En optimal protokoll som kombinerer lav pris med høy effektivitet av DNA fragment er et presserende behov for rutinemessig bruk av sølv flekker i biologisk forskning.
I tillegg polyakrylamid gel kan deles inn i denaturing og ikke-denaturing polyakrylamid gels, og begge kan brukes for påvisning av SSR markører bruker sølv flekker metoden. Effekten og oppløsning som avviker ikke i vesentlig, men ikke denaturing polyakrylamid gels er enklere å håndtere og ta mindre tid16.
Basert på den tidligere forskning15er målet med denne studien å beskrive en optimalisert sølv flekker protokollen for rask, enkel og rimelig påvisning av SSR markører i en ikke-denaturing polyakrylamid gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av PCR produkter av SSR markører
- Forberede alle kjemikalier og reagenser PCR reaksjoner inkludert mal DNA (30 ng/µL), 2 × PCR master mix (inneholder 2 × PCR buffer, 0.4 mM av hver dNTP, 3 mM MgCl2, 0.1 U/µL Taq DNA utvalg og fargestoffer), 10 µM hver vanlige og motsatte primere , og destillert eller vaskebuffer vann (dH2O).
Merk: SSR markører brukes studien var PT51333 (videresende primer sekvens: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' og omvendt primer rekkefølgen: 5 "- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3") og PT50903 (videresende primer sekvens: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3 og reversere primer sekvens: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ") for tobakk og CX-43 (videresende primer sekvens: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3" og reversere primer sekvens: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3 ") og CX-157 (videresende primer sekvens: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' og reversere primer sekvens: 5 "- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3") for blomstrende kinesisk kål. - Forberede 10 µL av PCR blanding for forsterkning ved å legge til 2 µL av DNA, 5 µL av 2 × PCR master mix, 0,2 µL av hver frem primer og omvendt primer og 2,6 µL av dH2O.
- Utføre PCR forsterkning reaksjon i en thermocycler med et første trinn av 94 ° C i 5 min, følger av 38 sykluser av 45 s på 94 ° C i rødsprit, 45 s ved 55 ° C for primer avspenning og 1 min ved 72 ° C for utvidelsen, og en endelig utvidelse trinn 10 min ved 72 ° C; deretter lagre PCR produkter på 4 ° C for senere bruk.
2. forberedelse av løsninger for polyakrylamid Gels støping
- Klargjør 1 L 5 × TBE buffer ved oppløsning 54 g Tris base og 27.5 g borsyre i dH2O, legge til 20 mL 0,5 M EDTA (pH 8.0) og justere løsningen på et endelig antall 1 000 mL med dH2O.
Merk: TBE bufferen kan lagres ved romtemperatur for måneder. - Forberede 2 L 0,5 × TBE bufferen ved å legge til 200 mL 5 × TBE buffer dH2O til en endelig mengde 2 L og lagre ved romtemperatur.
- Forberede en 6% ikke-denaturing polyakrylamid gel løsning ved å løse opp 29 g av molekylærbiologi klasse akrylamid og 1 g molekylærbiologi klasse N N'-methylenebisacrylamide 0,5 × TBE buffer til et endelig antall 500 mL. Dekk løsning flasken med aluminiumsfolie og butikk på 4 ° C for senere bruk.
Forsiktig: Akrylamid er ansett som en potent neurotoxin og bør behandles med forsiktighet. Alltid bruk hansker når veiing pulver og håndtering løsninger som inneholder den. - Forberede en 20% ammonium persulfate (APS) løsning ved å løse opp 2 g APS med dH2O til en endelig mengde 10 mL. Det kan lagres på 20 ° C i måneder.
Merk: For enkelhets skyld, 10 mL av 20% APS løsning kan være aliquoted i 1,5 mL eller 2 mL sentrifuge rør for lagring på 20 ° C. Tine og bland godt før bruk. - Forberede en utvannet bind-silane løsning ved å løse opp 3 µL av bind-silane i 0.997 mL av 95% etanol 0,5 prosent av eddiksyre. Det kan lagres på 4 ° C i uker.
Forsiktig: Bind-silane er giftige, bruk hansker når du håndterer løsningen og holde rommet ventilert.
3. forberedelse polyakrylamid gelé til geleelektroforese
- Vask ett sett av glassplater og avstandsstykker med vaskemiddel i vann fra springen, etterfulgt av en komplett skylling med dH2O. lufttørke platene ved å sette dem i en plate hjell.
- Spre 1 mL av bind-silane løsning på indre overflaten av en rektangulær glassplate, og tørt for 5 min.
Merk: Hvis bind-silane løsningen ikke er spredt jevnt på overflaten av platen, gel kan kobles under fargingen og føre en utilfredsstillende flekker effekt. - Spre 1 mL av frastøte-silane til overflatebehandling av en hakk glassplate med en vattpinne, tørke av overflødig frastøte-silane med papir og lufttørke i 5 min.
Merk: Hvis frastøtt-silane ikke coat overflaten av glassplaten jevnt, kan det skade gel ved delvis stripping. - Montere glassplater med avstandsstykker med hakk plate på toppen, og klemme begge sider av forsamlingen med støping klemmer.
- Hell riktig mengde (40 mL) 6% ikke-denaturing polyakrylamid gel løsning på et beger for settet med 33 cm bredde × 10 cm høyde og avstand tykkelse på 1,5 mm, legge til 20 µL av tetramethylethylenediamine (TEMED) og 200 µLfresh 20% APS og bland forsiktig.
Merk: Riktig mengde (40 mL) gel løsning beregnet fra indre volumet av to platene med en tykkelse på avstandsstykker (30 cm x 8,5 cm × 0,15 cm). Som for mengden av TEMED og APS for gel polymerisasjon er det standard forholdet gel løsning på TEMED og APS basert på referanse17. Gel løsningen beskrevet ovenfor lagres på 4° C. Hvis gel løsning lagres i romtemperatur, 20 µL av TEMED og 100 µL av 20% APS skal brukes. Forsiktig rør blandingen av gel løsning med et glass pinne å unngå luftbobler i løsningen. - Hell løsningen umiddelbart nøye til de sammensatte glassplater langs kanten av hakk plate, tomrommet nesten til toppen og sette inn kam. Legge en liten mengde gel løsning over kammen.
Merk: Hold glassplater horisontalt å hindre gel lekker. Fjern bobler med en boble krok, hvis nødvendig. - Tillate gel angi for 30 min ved romtemperatur.
Merk: Tiden for polymerisering kan endres med temperaturer gel løsning og miljø. - Etter gel er fullt polymerisasjon, fjerne avstøpning klemmer og posisjon i sett i geleelektroforese tank enheten med hakk plate vender mot øvre buffer reservoaret, og bruk store klemmer til å feste platen satt til tank enheten.
- Hell 1 L 0,5 × TBE buffer i hver av øvre og nedre kamrene. Fjern kammen og tømme alle brønnene grundig med buffer bruker en pipette eller sprøyten.
Merk: Kontroller at gel sandwich på bunnen av platen er helt gjennomvåt i buffer uten bobler.
4. kjører Gels
- Legg ca 1 µL av PCR produkt i hver brønn av polyakrylamid gel. Laste inn en DNA størrelse stige til begge sider av gel sammen med prøver av PCR produkter. Fastsette sikkerhet dekke til øvre buffer kammeret.
- Koble fører til strømforsyningen, matchende den fargekodede rød til rød og svart til svart. Kjør gel med en konstant spenning på 110 V til fargebad når en definert posisjon, normalt for ~ 70 min.
Merk: Spenning og kjører tid kan justeres avhengig av PCR produktene.
5. sølv flekker for å oppdage SSR markører i en ikke-polyakrylamid Gel
- Etter geleelektroforese, tømme bufferen fra den øvre kammeret i en stor kanne via ventilen. Koble siden klemmer, Fjern platene og apparater, nøye skille hakk glassplaten langs den ene siden med en slikkepott, og kontroller at gel restene knyttet til andre glassplate belagt med bind silane.
- Få 1 L frisk impregnering løsning ved å løse opp 1,5 g AgNO3 i 1 L av dH2O. forberede 1 L frisk utvikling løsning ved å løse opp 10 g av NaOH i 900 mL av dH2O, legger 1 mL av 37% formaldehyd , og Juster til et endelig antall 1 L bruker dH2O.
Merk: Bruk hansker og håndtere ovenfor kjemikalier og løsninger med forsiktighet. Det er ikke nødvendig å holde løsninger og tilsvarende trinnene med løsningene i mørket. - Nøye skyll av gel og glass plate med rikelig dH2O fjerner bufferen som geleelektroforese, deretter Plasser platen med gel vendt opp på en plast brett og senke gel i 1 L impregnering løsning. Sett skuffen på en shaker.
- Riste skuffen forsiktig på 60 r/min i 3-4 min.
Merk: Risting tid kan justeres i henhold til gel tykkelse og konsentrasjon av sølv nitrat i impregnering løsningen. - Flytt platen av impregnering løsning og si det på en annen skuff. Skyll den gjenværende impregnering løsningen av fra overflaten av platen og gel bruker rikelig dH2O to ganger for 3-5 s hver.
- Plasser platen med gel vendt opp på en annen skuff, senke platen i 1 L utviklingsløsning, deretter riste skuffen forsiktig på 50 r/min for ~ 3 min. skjermen utseendet på DNA fragmenter og stoppe utvikling når den høyeste forholdet av DNA fragmenter til støy i bakgrunnen er observert (dette trinnet tar ~ 3 minutter).
- Skyll platen og gel med rikelig dH2O to ganger, og tørke gel platen med en papir.
- Skanne gel bruker en passende skanner. En oppløsning på 300 dpi gir en tydelig visualisering av DNA. Gelen kan også bli fotografert bruker et kamera.
- Stripemønster av SSR merkene kan være scoret basert på DNA fragmenter i bildet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PCR-amplicons ble produsert ved hjelp av tilsvarende SSR primer parene i blomstrende kinesisk kål og tobakk. Etter geleelektroforese, var polyakrylamid geléer farget med over sølv flekker protokollen, som utvetydig oppdaget striper mønstre for SSR (figur 1).
For å sammenligne effektiviteten deteksjon av ulike sølv fargeprotokoller, PCR produkter av SSR markører i tobakk og blomstrende kinakål ble skilt ved hjelp av polyakrylamid gel geleelektroforese og visualisert ved hjelp av fem publiserte sølv flekker protokoller,9,,11,,12,,13,,14 og den nye protokollen. Alle seks protokoller oppdaget SSR striper mønstre for tobakk og blomstrende kinakål genotyper (figur 2), men nåværende protokollen hadde lavest bakgrunnsstøy og høyeste kontrasten av DNA fragmenter, slik at det produseres høyeste bildet klarhet for entydig screening av SSR polymorfismer. Kjøretiden og hovedtrinn og reagenser brukes til å fullføre sølv farging prosessen er oppført i tabell 1 for hver protokoll, den nye protokollen tar minst tid og krever færre kjemiske reagenser og prosesstrinn.
Figur 3 viser følsomheten til protokollen målt ved 50-2,000 bp DNA markør på en ikke-denaturing polyakrylamid gel.
Figur 1: påvisning av SSR striper mønstre. Påvisning av SSR striper mønstre for genotyper blomstrende kinesisk kål (A) og tobakk (B) bruke den nye sølv flekker protokollen. PCR produktene var atskilt på 6% ikke-denaturing polyakrylamid gels og farget pr over rapporterte sølv flekker protokollen. Lane M er DNA størrelse markør, baner 1 til 62 representerer amplicons av 62 genotyper forsterkes av SSR primer par "CX-157" (sekvenser av forover og bakover grunning er 5'-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3" og 5'- GGACAGCTTCACACATTTGC-3', henholdsvis) i blomstrende kinesisk kål (figur 1A) og "PT51333" (sekvenser av forover og bakover grunning er 5'- GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' og 5'- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3', henholdsvis) i tobakk (figur 1B). Pilene peker til målet SSR bandene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: sammenligning av effektiviteten deteksjon for SSR markører i tobakk og blomstrende kinakål genotyper bruker forskjellige sølv Fargeprotokoller. PCR produktene ble skilt i 6% av ikke-denaturing polyakrylamid gels og farget bruker fem publisert sølv flekker protokoller9,11,12,13,14 og den nye protokollen. Lane M er DNA størrelse markør. Baner 1 til 4 representerer amplicons i SSR primere av "PT50903" (sekvenser av forover og bakover grunning er 5'-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3 "og 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3" henholdsvis) i fire tobakk genotyper; baner 5 til 8 angir amplicons i SSR primere av "CX-43" (sekvenser av forover og bakover grunning er 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3 "og 5'-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3" henholdsvis) i fire blomstrende kinakål genotyper. Målet SSR bandene angis med piler. Dette tallet er endret fra figur 2 av Liu et al. 8 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: følsomheten av protokollen målt ved 50-2000 bp DNA markør på en ikke-denaturing polyakrylamid gel. Første kjørefelt var lastet med 1µL av DNA merket med fragment størrelser av 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 1000, 1500 og 2000 bp, hver på 10 ng/µL. Gjenværende prøvene var lastet med en 1:2 føljetong fortynning i foregående baner. Synlig minimumsbeløpet for protokollen var 9,8 pg i 11th kjørefelt (2,2 pg/mm2 i en 4,52 godt). Dette tallet er endret fra figur 1 av Liu et al. 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Element | Sanguinetti et al. 9 | Qu et al. 11 | En et al. 12 | Byun et al. 13 | Kumar et al. 14 | Ny protokoll |
| Kjøretiden (min) | 30 | 12-25 | 8 – 9 | 9 – 31 | 42 | 6 – 7 |
| Antall trinn | 5 | 4 | 3 | 3 | 3 | 2 |
| Antall reagenser | 5 | 6 | 6 | 5 | 7 | 3 |
Tabell 1: Kjøretiden, viktige trinn og reagenser brukes i ulike sølv Fargeprotokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vask av gel etter impregnering er kritiske. Utilstrekkelig vask kan tid og forårsake ufullstendig fjerning av impregnering løsning på overflaten av platen og gel, og føre til en mørk bakgrunn. Riktig utvikling tid er et viktig skritt, over-utvikling kan medføre mørkebrunt bakgrunn med lav kontrast bilde av DNA. I tillegg påvirker impregnering trinnet betydelig flekker effektiviteten av DNA. Selv om utvide impregnering tiden over 5 min eller øke AgNO3 beløpet i impregnering løsningen ikke betydelig bedre flekker kvaliteten, en redusere impregnering tid til mindre enn 3 minutter eller redusere mengden av AgNO3 ( < 1 g) kan føre til grå eller grunt svart DNA fragmenter.
En rask og enkel operasjon for effektiv påvisning av DNA er ønskelig for sølv flekker metoden. Den nye protokollen utviklet i denne studien unngår fastsetting, stoppe og flere vask trinnene beskrevet i andre protokoller6,9,10,11,12,13 , 14 uten virkning flekker (figur 1 og figur 2), og krever bare to enkle trinn impregnering og utvikling som ta 7 min. Derfor er den nye protokollen raskere enn alle de andre flekker protokoller gjeldende tilgjengelige6,7,9,10,11,12, 13,14. I tillegg krever den nye protokollen bare tre kjemikalier, dvs. AgNO3, formaldehyd og NaOH, på lignende beløp som brukes i andre protokoller6,7,9,10,11,12, 13,14, derfor den nye protokollen er mer økonomisk og genererer mindre kjemiske farer, som ikke bare reduserer kjemiske kostnadene, men også reduserer farlige materialhåndtering prosessen med ekstra kjemikalier i den laboratoriet.
Den nye protokollen produsert klare bilder med lav bakgrunnsstøy for entydig påvisning av SSR striper mønstre i tobakk og blomstrende kinakål genotyper (figur 1). Sammenlignet med andre protokoller, produsert den nye protokollen de beste flekker effekt med lavest bakgrunnsstøy og høyeste bildekontrast (figur 2). I størrelsesorden 50-500 bp, følsomheten til den nye protokollen for DNA gjenkjenning var mindre enn 19,5 pg/µL (4.3 pg / mm2) med en minimum konsentrasjon av 9,8 pg/µL (2,2 pg/mm2) (Figur 3), som er høyere enn i andre protokoller 7 , 12 , 13.
Selv om fluorescens-merking teknologier kan gi høy gjennomstrømning og oppløsning oppdagelsen av DNA amplicons, krever de spesialisert utstyr og dyrere reagenser som ikke kanskje er tilgjengelig for mange biologiske laboratorier, spesielt de i utviklingsland. Den nye fargeprotokoll er enkel og rask som kan skjermen ~ 800 DNA-prøver per person per dag, dermed, er et godt alternativ for disse laboratoriene utfører rutinemessig forskning.
Som konklusjon, den nye protokollen utviklet i denne studien er raskere prosess, enklere å implementere, billigere, og bruker bare tre reagenser-uten at oppdagelsen effekt eller bilde klarhet, enn alle andre eksisterende sølv flekker teknikker. Nye sølv flekker protokollen har vært brukt med hell i tobakk og blomstrende kinakål forskning og kan være et verdifullt verktøy for vellykket SSR genotyperingteknologi i andre arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Guangdong Natural Science Foundation i Kina (2015A030313500), provinsielle nøkkel International Cooperative Research plattformen og store vitenskapelig forskning prosjekt av Guangdong høyere utdanning (2015KGJHZ015), vitenskap og Teknologiplan Guangdong tobakk monopol administrasjon (201403, 201705), vitenskap og teknologiplan Guangdong i Kina (2016B020201001), National innovasjon treningsprosjektet for studenter (201711078001). Omtale av varemerker eller kommersielle produkter i denne publikasjonen er utelukkende å gi informasjon, og innebærer ikke anbefaling eller oppfordring av det oss Department of Agriculture. USDA er like muligheter leverandøren og arbeidsgiver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | - | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | - | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | - | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | - | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | - |
References
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, PMID:7840973 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).
