Summary
高スループットと小さな抑制 RNA スクリーニングはより急速に化学角膜上皮傷害の分子機構を解明するために助けることができる重要なツールです。ここで、開発と露出モデルとフッ化水素とクロルピクリンによる角膜上皮障害の高スループット スクリーニング法の妥当性を提案します。
Abstract
化学物質を急速に重要な組織の損傷を与える可能性があるために、毒性物質による眼障害は真眼緊急です。毒性物質による角膜損傷の治療法は、これらの傷害を治療するために特定の治療法が存在しないため、一般に支持。トリートメントや露出の世話をする治療薬を開発する努力をこれらの傷害の分子・細胞メカニズムを理解する重要なことです。提案する高スループット小さな抑制 RNA (siRNA) スクリーニングの利用がより急速に化学角膜上皮傷害の分子機構を明らかにすることができる重要なツールをすることができます。siRNA は、二本鎖 RNA 分子長 19-25 のヌクレオチドと転写後サイレンシング mRNA を低下させる経路を利用、siRNA に相同性があります。特定の遺伝子の表現の結果の減少は、細胞に対して、毒性物質、遺伝子の機能を確認するために毒性物質の露出した細胞で研究できます。開発と検証暴露モデルの in vitroのハイスループットス クリーニング (HTS) フッ化水素 (HF) とクロルピクリン (CP) による眼損傷のための方法は、この記事で掲載されています。我々 はこれらの 2 つの有効成分を選択、私たちの方法は、毒性物質の曝露プロトコルに変更を加える他の有効成分の研究に適用されます。SV40 large T 抗原 SV40 HCEC は研究に選ばれたひと角膜上皮細胞ラインを不死化。細胞生存率及び il-8 産生は、スクリーニングのプロトコルのエンドポイントとして選択されました。毒性物質の暴露の開発に関連付けられているいくつかの課題、高温超伝導の研究に適した培養技術が表示されます。これらの毒性の高温超伝導モデルの確立化学眼傷害のための潜在的な治療のメカニズムやけがの画面を理解するそれ以上の調査が可能です。
Introduction
化学物質を急速に重要な組織の損傷を与える可能性があるために、毒性物質による眼障害は真眼緊急です。残念ながら、毒性物質による角膜損傷の治療法は、これらの傷害を治療するために特定の治療法が存在しないため、一般に支持のみです。現在の治療戦略は非特定、潤滑剤、抗生物質などの局所治療が主に含まれています、cycloplegics 続いて抗炎症薬 (例えばステロイド) 一度角膜1 を epithelialized、再 ,2。最高現在治療オプションは、にもかかわらず長期予後不良進歩的な角膜混濁と血管新生の2,の3のためであります。
動物モデルは、化学的毒性を調査し、傷害のメカニズムを理解する伝統的に使用されています。ただし、動物実験は時間がかかり、高価です。動物テストを削減する取り組みもあります。たとえば、欧州連合 REACH 規制 (EC 1907/2006 年) 動物実験を減らすため規定しています。規定には、動物テストおよび動物に提案するテストを実行する前に欧州化学物質庁から承認を得ることを避けるために、企業がデータを共有する要件が含まれます。リーチの規定の下で動物実験は最後の手段にする必要があります。また、動物で化粧品のテスト廃止欧州の化粧品規制 (EC 1223/2009) があります。3 r の原則に導かれるとき、動物実験が行われる (絞り込み、削減、および交換)、非動物の代わりを使用して、慈悲深い動物の研究を行って、使用する動物の数を減らすためのフレームワークを提供します。可能な限り。これらの理由から、毒物学の分野は、毒性の分子メカニズムに洞察力を提供することができますしより高いスループット4で行うことができますの in vitroアッセイを採用を求めています。これは機能的な毒物学アプローチの化学だけではなく機能別に毒性が定義されています。さらに、機能的な一歩を踏み出したトキシコゲノミクスを求める特定の遺伝子毒性5の効果を果たす役割を理解します。SiRNA 技術の応用、毒性物質を分子・細胞応答の遺伝子の機能を調べる画面を高スループットで行うことができます。siRNA は、長いポスト転写遺伝子サイレンシング経路すべて哺乳類セル6に存在する活用 19-25 のヌクレオチドは、二本鎖 RNA の分子です。これらは総合的作られて、特定の遺伝子をターゲットに設計されています。SiRNA は処理セルに導入されたとき、ガイド鎖一本鎖 RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) が読み込まれます。SiRNA は、mRNA 分子の相補的な領域に RISC を指示し、RISC の mRNA の低下します。これは特定の遺伝子の発現の減少の結果します。特定の遺伝子の表現の結果の減少は、細胞に対して、毒性物質、遺伝子の機能を確認するために毒性物質の露出した細胞で研究できます。このようなアプローチは、リシン感受性のメカニズムと CYP1A17,8の AHR 依存型誘導をさらに理解するために使用されています。
化学テロのリスク評価 (CTRA) リストおよび有毒工業化学物質 (TIC) のリストは、その毒性やテロ、戦争、または産業事故イベント9にリリースされる可能性に基づいて選択化学物質を明細が。SiRNA のハイスループットス クリーニング (HTS) トキシコゲノミクスでハイリスクのテロ事件で使用する識別されている CTRA リスト毒性の研究アプローチを適用しています。伝統的な毒性化学物質が生物に悪影響を理解しようとしています。しかし、我々 は通知におそらく、治療薬や治療法の開発を目的として傷害のメカニズムを理解しさらに願望を持っている分子治療の開発の対象にすることができますを発見します。いくつかの方法でこの努力は、siRNA スクリーニングおよび薬剤の発見プロセス10に基づくセルの試金の使用に類似した考慮されるかもしれない。主な違いは、我々 のアプローチでそれはやや毒性物質曝露の治療のため治療価値の高い特異なターゲットがあるだろうと考えにくいに対し、その創は通常治療探索対象が単数形を求めているでしょう。我々 は、毒性物質の露出のための効果的な治療法のパラダイムが高い治療価値を達成するために多面的なアプローチを必要とし、トキシコゲノミクス解析を用いたデータは極めて効果的な治療パラダイムを通知ことがあることを予測します。
ベンチトップ オートメーションは、医薬品やバイオ テクノロジー産業の外の所に高スループット方法論をもたらします。当研究所での in vitroの研究は歴史的に低スループット11,12,13である伝統的なアッセイをされています。過去数年間で私たちの研究室は、siRNA スクリーニングを実行する卓上型ロボットの使用に移行しています。ここで、眼細胞モデルの精緻化と体外の開発露出の手法を提示水素フッ化物 (HF) とクロルピクリン (CP) siRNA スクリーニングに適した。私たちの目標は、これらの毒性に対して細胞傷害を調節する分子を識別することです。我々 が選択した siRNA ライブラリのターゲットには、G タンパク質共役型受容体、蛋白質キナーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、イオン チャネル、および他の潜在的 druggable ターゲットが含まれます。HF および CP は蒸気暴露9,14を介して眼傷害の最大のリスクを提示する研究の産業事故の ToxNet レポート CTRA リスト エージェントを相互参照によって選ばれました。CP (化学式 Cl3CNO2、CAS 番号 76-06-2) もともと、第一次世界大戦15で催涙ガスとして使用されました。それは現在として殺虫剤、殺菌剤、殺16農業燻蒸と関数として使用されます。フッ化水素 (HF) は、石油精製所、17有機化合物の電気化学的フッ素化アルキル化を含むプロセスで使用されます。HF (化学式 HF、CAS 番号 62778-11-4) ガスであるが、形式で水溶液はフッ化水素酸 (HFA、CAS 番号 7664-39-3)。したがって、我々 は我々 の細胞で HFA を使用する選出露出モデル。SV40 large T 抗原 SV40 HCEC は研究に選ばれたひと角膜上皮細胞ラインを不死化。細胞死および炎症性応答の細胞傷害に関与している目標を反映する必要がありますので、細胞生存率及び炎症性マーカー IL 8 はエンドポイントとして選択されました。具体的には、ターゲットは、毒性物質の露出の保護の役割を果たすことが、細胞死および炎症性サイトカイン産生増やす必要があります対象式は、siRNA によって阻害されるとき。否定的な役割を果たす目標の真反対のでしょう。また、露出、および細胞死経路への介入が向上臨床2,18後角膜病理学の役割を果たすに慢性的な炎症が表示されます。
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Protocol
1. セルの文化の維持
- 成長セル行 SV40 HCEC 37 ° C、5% CO215% ウシ胎児血清 (FBS)、DMEM F 12 の 90% 湿度 1 %l-グルタミン、10 μ g/L 上皮成長因子 (EGF)、5 mg/L インスリン。
- 密度が決して文化保守中に 80% を超えていることを確認する細胞株 (播種) によってすべての 3 〜 4 日の通路します。
- 37 ° C で 8 分以上の剥離液 (14 mL すべて 150 cm2フラスコ) と潜伏を使用してフラスコから細胞をデタッチします。
- 細胞培養液の等量と剥離ソリューションを中和し、160 x g で 7 分間の遠心分離で 50 mL の円錐管の細胞のペレットします。
- 再中 (すべて 150 cm2フラスコ 20 mL) 細胞ペレットを中断します。
- 自動化されたハンドヘルド携帯カウンターと種子が 3 〜 4 日の 80% の confluency を超えることがなく成長することができます密度で新しいフラスコでセルをカウントします。
2. プレート細胞実験のため
- その密度を確保するため位相差光顕微鏡による SV40 HCECs のフラスコは 80% 以上と一般的な細胞の健康を評価するために以下を確認してください。
- デタッチし、ペレット、再懸濁します、細胞文化維持の手順 1.3 〜 1.6 でフラスコから SV40 HCECs を数えます。SV40 HCEC 培 0.5 μ g/mL ヒドロコルチゾン (HCORT 中) を使って、細胞を再懸濁します。
- 使い捨ての中瓶で中に予め温めておいた HCORT 17,857 細胞/ml の SV40 HCECs の懸濁液を準備します。
- シード処理する板の数の細胞懸濁液の十分な量を準備します。
- 14 x 96 ウェル プレートを検討する siRNA ライブラリ磯野のセルの最小値をシードします。
- 均等にセルを中断、細胞懸濁液の十分な量を注ぎ、自動液体ハンドラーの軌道シェーカー巣に貯蔵所および格納セルめっき中にプレートを温暖化、37 ° C の細胞懸濁液の入ったボトルにボトルを旋回します。プロセス。
- 自動液体ハンドラーを使用して、70 μ L/ウェルの 96 ウェル プレート培地で 1000 細胞/ウェル (5000 セル/cm2) の密度でプレートにセルを追加します。50 μ L/s を使用して、すべてのステップのピペッティング速度。
- シード処理中に常に 100 rpm で軌道のシェーカーを実行します。
- (140 μ L ミックス ボリューム) 回 3 細胞懸濁液をミックス自動液体ハンドラーを使用します。
- 140 μ L の細胞懸濁液を吸引し、2 つの細胞培養プレートの各ウェルに 70 μ L を分配します。
- 2.5.3 と 2.5.4 の手順を繰り返して、すべてのプレートは、細胞にシードされています。
- シード処理中に必要に応じて、細胞懸濁液の貯蔵所を補充します。
- プレートは、シードされている後自動液体ハンドラーから削除し、細胞文化のインキュベーターに転送する前に室温で 30 分間インキュベートします。
- 各プレートの各ウェルの細胞密度を評価する細胞文化のインキュベーターに収容されて、任意の板を 15% 22% の合流からではないインテリアの井戸のある研究から除外自動イメージング システムを使用して次の朝。
3. siRNA を細胞を transfect します。
- SiRNA ライブラリ プレート プレートごと 80 siRNA のターゲットを含む構成済みベンダーを取得 (図 4を参照)、1 から 12 の列を持つ空のまま。
- 製造元の手順19によると siRNA の各ウェルの 2 pmol/μ L の最終的な集中に siRNA バッファーと siRNA ライブラリ プレートを再構築します。
- SiRNA の 4 pmol/まあ、トランスフェクション試薬の 0.3 μ L/ウェル播種後 24 時間のセルを transfect します。トランスフェクション試薬製造元のプロトコルに従ってすべての手順を実行します (プレート レイアウト図 4を参照)20。
- すべての自動液体ハンドラーを使用 transfections を実行して、25 μ L/s ピペッティング速度のすべてのステップ。トランスフェクションが井戸のみに対処するのに事前に構成されたヒント ボックスを使用します。
- 「トップ プレート セット」と呼ばれる六つのレプリケート プレートのセット使ってライブラリ プレートの半分 top を使用して (siRNA、n あたり複製 6 = 6).
- 「下部プレート セット」と呼ばれる六つの複製板の異なるセットを使ってライブラリ プレートの半分下の使用 (siRNA、n あたり複製 6 = 6).
- 「フル プレート セット」という言葉を使用すると、ライブラリの siRNA を導入されて 12 のセル板を記述します。
- すべての上部と下部のプレート セットのライブラリ siRNA されてにトランスフェクトした後否定的なプールの siRNA とフル プレート セットすべての版の井戸 B2 B6 を transfect します。
- また transfect 井戸 B2 B6 別の 2 枚の板をライブラリ siRNA を受け取りません、負プール siRNA と未露光のコントロール (トップ プレート セット 1) と下部プレート セットのいずれかとなります。
- 穏やかなすべての時間をタップして 4 時間すべてトランスフェクション混合物が追加された後とミックス携帯文化のインキュベーターですべてのセル版を孵化させなさい。
- 予め温めておいた HCORT の中で 2 回プレートのすべてのウェルを洗浄する自動液体ハンドラーを使用希釈 PBS で 1:5。50 μ L/s を使用して、すべてのステップのピペッティング速度。
- 各ウェルから 100 μ L を吸引し、廃棄物の貯留層にそれを破棄します。
- 各も 100 μ L/ウェルに追加に予め温めておいた HCORT 培地希釈 1:5 の PBS プレート数のための十分な量の異なる貯水池に含まれています。
- 各プレートの 3.5.1、3.5.2 の手順を繰り返します。
- 必要に応じては、廃棄物のタンクを空にします。
- 詰替用 HCORT 培地で希釈に応じて PBS で 1:5。
- 各ウェルから 100 μ L を吸引し、廃棄物の貯蔵所にそれを破棄します。
- プレートの数のための媒体の十分な量の異なる貯水池に含まれているこの 100 μ L/ウェルに予め温めておいた HCORT 媒体でプレートのすべての井戸を再フィードします。
- 必要に応じて培地で貯水池を補充します。
- 非 transfected コントロールとして井戸 C2 ・ C6 全てのプレートを使用します。
- 井戸 B7 B11 と毒性物質の暴露の薬物および車両のコントロールとして使用する導入したすべての板の C7 C11 を維持します。
4. 再フィード セル次の日
- 自動液体ハンドラーを使用して、プレートのすべての井戸を再フィードします。50 μ L/s を使用して、すべてのステップのピペッティング速度。
- 各ウェルから 100 μ L を吸引し、廃棄物の貯留層にそれを破棄します。
- それぞれ 100 μ L/ウェルに予め温めておいた HCORT 媒体別貯水池に含まれており、, 再給餌する板の数のための媒体の十分な量と再フィードします。
- 4.1.1 と 4.1.2 すべてのセル板を再フィードする必要に応じて手順を繰り返します。
- 必要に応じては、廃棄物のタンクを空にします。
- 必要に応じて培地で貯水池を補充します。
5 肯定的なコントロールの追加
- トランスフェクション後、露出の前に 2 時間の 2 日間は、HFA のエクスポー ジャーに使用し 8 行希釈タンクの行 B に追加 HCORT 媒体の肯定的な制御 cardamonin 62.5 μ M 溶液を準備します。
- CP 露出準備し、SKF 86002 の 25 μ M のソリューションを使用します。
- 肯定的な制御テストする板の数のための十分な量を準備します。
- HCORT 中 (車両管理) DMSO の 0.625% 溶液を調製し、同じ油層の C 行に追加します。
- CP 露出準備し、DMSO 0.5% 溶液を使用します。
- 車両制御テストする板の数のための十分な量を準備します。
- すべてのステップに井戸 B7 B11 と各セル板の C7 C11 に正と車両コントロールを追加し、50 μ L/s ピペッティングを使用自動液体ハンドラーの速度を使用します。事前に構成されたヒント ボックスを使用すると、正と車両コントロールが表示されます井戸のみに対応します。
- B7 B11 と各セル板の C7 C11 の井戸から媒体の 10 μ L を取り外して、G および H 8 行希釈タンクの行にそれを廃棄します。
- これらの井戸に正と車両コントロールの 10 μ L を転送し、3 回をミックスします。
- これらのセル板をインキュベーターに戻ります。
- 5.3 5.4 にすべてのセル板が肯定的な受信するまでの手順と車両のコントロールを繰り返します。
6 培養細胞の HF 露出
注意: HFA は腐食性と急性毒性です。
- 安全メガネ、使い捨てポリエチレン スリーブ プロテクター研究室コート ダブル ニトリル手袋を身に着けている化学発煙のフードで化学物質の暴露のすべての操作を実行します。
- 48% 溶液として HFA を取得します。
- HFA を純水で 1% に希釈し、安全を改善するために 10 mL 肉厚ポリエチレン バイアル 5 mL 因数で格納します。
- ピペット チップと接触して HFA と 2.5% グルコン酸カルシウム有害廃棄物ストリームで処分する前に、任意の残りの液体 HFA 貯水池を消毒します。
- 各 siRNA の図書館調査中板、1% の 288 μ L を追加することによって 0.0036 %hfa メディア ソリューションの準備を予め温めておいた HCORT 150 mL ボトル中の 80 mL HFA。
- 渦巻き模様のボトルと 10 分の化学発煙のフード 37 ° C の定温器で希薄 HFA を孵化させなさい。
- ボトルを旋回で再び HFA 培地溶液を混合し、HFA メディア ソリューションを試薬槽暖かいプレート上に追加します。
- タンデムで働く 2 つの技術者と露出を実行します。
- 12 チャンネル pipettor を使用して細胞板の内部の井戸のそれぞれから正しい吸引 100 μ L の技術者を有し、技術者に左側に板を渡します。
- HFA の中規模ソリューションのウェルあたり 100 μ L を追加左の技術者があります。
- 毒性物質にさらされることは、すべてのセル板 6.4.1 と 6.4.2 の手順を繰り返します。
- また HFA メディア ソリューションではなく新鮮な HCORT 媒体を活用した、非公開の制御板は、6.4.1 と 6.4.2 手順を繰り返します。
- 20 分の化学発煙のフード インキュベーターでプレートを配置し、携帯文化のインキュベーターにそれらを返します。
- 以前にしたらすべてのプレートをさらされ、細胞文化のインキュベーターに返されるを示す肯定的な制御の追加ステップ (ステップ 5.5 5.1) を繰り返します。
7 培養細胞の CP 露出
注意: CP は急性毒性と刺激です。
- 安全メガネ、使い捨てポリエチレン スリーブ プロテクター研究室コート ダブル ニトリル手袋を身に着けている化学発煙のフードで化学物質の暴露のすべての操作を実行します。
- CP を獲得します。
- 5 %dmso で CP を希釈し、安全を改善するために 10 mL シンチレーション バイアル 10 mL の因数で保存します。
- ピペット チップと接触して CP と亜硫酸水素ナトリウム 2.5% 有害廃棄物ストリームで処分する前に、残った液体 CP 貯水池を消毒します。
- 予め温めておいた HCORT 培 x ペン/連鎖球菌とプレートの数のために予め温めておいた PBS を公開する 1 の十分な量を準備します。
- トップ プレートのセットまたは底板セットごとに 5% の 8.04 μ L を追加に予め温めておいた HCORT 培地および 0.0008% の最終的な CP の集中のためによくミックスの 50 mL の約数に DMSO の CP。しっかりとチューブをキャップし、1 h の化学発煙のフード 37 ° C の定温器でソリューションを孵化させなさい。
- 媒体の 50 mL の因数を CP に追加を時間トップ プレート セットさらされて、CP が媒体の 50 mL の約数に追加された後に毒性物質正確 1 h を受け取ります底板を設定します。
- 細胞文化のインキュベーターからトップ プレート セットと 1 非公開コントロール プレートを削除し、潜伏期間の終わりの近くの化学発煙のフードで配置します。
- チューブを反転で CP ソリューションをミックスし、1 時間の潜伏期間の終わりに試薬リザーバーをデカントします。
- タンデムで働く 2 つの技術者と露出を実行します。
- 12 チャンネル pipettor を使用して細胞板の内部の井戸のそれぞれから正しい吸引 100 μ L の技術者を有し、技術者に左側に板を渡します。
- CP 中規模ソリューションのウェルあたり 100 μ L を追加左の技術者があります。
- 毒性物質にさらされるトップ プレート セットのすべてのセル板 7.6.1 と 7.6.2 の手順を繰り返します。
- また CP 中規模のソリューションではなく新鮮な HCORT 媒体を活用した、非公開の制御板は、手順 7.6.1 と 7.6.2 を繰り返します。
- 10 分の化学発煙のフード 37 ° C の定温器にプレートを配置します。
- 1 を含む PBS および HCORT 媒体の十分な量を追加 10 分潜伏期間の終わりの近くの試薬リザーバーにペン/連鎖球菌性 x。
- 12 チャンネル pipettor を用いたセル板から CP ソリューションを削除し、10 分潜伏期間の終わりに PBS のウェルあたり 100 μ L でそれを置き換えます。
- すぐに PBS セル板から取り外して交換するそれの HCORT 培 1 ウェルあたり 100 μ L でペン/連鎖球菌 x。
- また非公開の制御板の手順 7.9 と 7.10 を繰り返します。
- セル板を標準細胞文化のインキュベーターに戻ります。
- 下部プレートのセット手順 7.12 に 7.3 を繰り返します。
- 前述したようにしたらすべてのプレートをさらされ、細胞文化のインキュベーターに返される肯定的な制御追加ステップ (ステップ 5.5 5.1) を繰り返します。
8. サンプルの収集とセル実行可能性の試金
- 24 時間暴露後ブドウ糖 10 g/L を含む PBS で 0.5 mg/mL MTT 基板のソリューションの準備し、37 ° C21に暖かい。試金する各プレート用基板の 10 mL を準備します。
- 試金する枚数、自動液体ハンドラーで貯蔵所に MTT 基板の解決の十分な量を追加します。
- すべての手順のサンプルを収集し、50 μ L/s ピペッティングを用いた MTT 基板を追加する自動液体ハンドラー速度を使用します。試金する井戸だけそれらに対処するためのヒント ボックスを事前に構成します。
- セル板と 2 つのストレージ ・ 384 ウェル プレートの各預金 42.5 μ L の内側 60 井戸から吸引 95年 μ L の培地。
- すぐにセル板に MTT 基板の解決のウェルあたり 100 μ L を追加し、1.5 h の携帯文化のインキュベーターで 37 ° C でそれらを孵化させなさい。
- MTT 基板ソリューションに応じて貯蔵所を補充します。
- 1 h の携帯文化のインキュベーターで 37 ° C でセル版を孵化させなさい。
- ストレージ ・ 384 ウェル プレートをシールし、その後の分析-80 ° C で保存します。
- すべて上部と下部プレートのセットと関連付けられた非公開コントロールの 8.3 から 8.5 の手順を繰り返します。
- 洗って MTT 基板の解決とプレート間の切り替え設定しますを追加するときは、複製間のヒントを再利用します。
- 1 時間培養後自動液体ハンドラーで貯蔵所に DMSO の十分な量を追加します。
- すべてのステップに DMSO を追加し、50 μ L/s ピペッティングを使用自動液体ハンドラーの速度を使用します。
- 各セル板の内側の井戸から 100 μ L を吸引し、廃棄物の貯留層に MTT 基板ソリューションを破棄します。
- 必要に応じては、廃棄物のタンクを空にします。
- 100 μ L の DMSO の各ウェルをオーバーレイします。
- 必要に応じてに DMSO 貯水池を補充します。
- 各セル板の内側の井戸から 100 μ L を吸引し、廃棄物の貯留層に MTT 基板ソリューションを破棄します。
- 3 分間プレート シェーカーでプレートを振る。
- 570 と 690 nm プレート分光光度計を使用して吸光度を測定します。
- 背景を減算し、未露光のコントロールによって公開された吸光度値で割って % 細胞生存率を計算します。平均非公開負プール siRNA コントロールを使用して、すべてのターゲット % 細胞生存率を計算します。
9. メジャー IL 8 濃度細胞培養上清中
- IL 8 のいいえを使用して細胞培養上清中の濃度は、製造元の手順22によるとビーズ アッセイを洗います。サンプルと標準曲線に対応するアッセイ プレート レイアウトを作成します。
- -80 ° C のフリーザーからストレージ ・ 384 ウェル プレートを取り、室温で解凍、簡潔に井戸の底にサンプルを収集するためにプレートを遠心します。
- 実行するアッセイ プレート数、キットに付属するアッセイバッファー中抗 IL 8 アクセプター ビーズ、ビオチン化抗 IL 8 抗体の十分な量を作る。アンチ IL8 アクセプター ビーズの 50 μ L とビオチン化抗 IL8 抗体アッセイバッファー 9.9 mL に 50 μ L の比率を使用します。
- マルチ チャンネルの pipettor を使用して、黒の 384 ウェル保存プレートにビーズ/抗体の混合物を追加します。
- サンプルとアッセイ プレート レイアウトに従って標準曲線の使用のために指定の井戸にアクセプター ビーズ/抗体を追加します。
- よく実行するアッセイ プレート数のためにつき十分な量を追加します。
- マルチ チャンネルの pipettor を使用して、黒の 384 ウェル保存プレートにビーズ/抗体の混合物を追加します。
- IL-8 標準 1000 pg/mL 354 μ M を含む細胞培養培地を使用するを再構成塩化ナトリウム。実行するアッセイ プレート数のための十分な量を作る。
- 標準曲線の 8 つの二重のシリアル希薄を作る。
- アッセイ プレート レイアウトによると黒の 384 ウェル保存プレートの適切な井戸に 3 通標準曲線を追加します。よく実行するアッセイ プレート数のためにつき十分な量を追加します。
- 354 μ M を含む細胞培養液を同様に、追加のバック グラウンド測定なしの IL - 8 塩化ナトリウム。
- 自動液体ハンドラーを使用すると、分析を実行できます。事前に構成されたヒント ボックスを使用すると、アッセイ プレート レイアウト指定井戸のみに対応します。50 μ L/s を使用して、すべてのステップのピペッティング速度。
- アクセプター ビーズ抗体の混合物の 8 μ L を白の 384 ウェル浅いよくアッセイ プレートの井戸に転送します。
- サンプルとアッセイ プレート レイアウトに従って標準曲線の指定井戸にのみ追加します。
- 2 μ L の標準曲線をアッセイ プレート レイアウトによると浅いよくアッセイ プレートの適切な井戸に転送します。
- 3.54 M NaCl 溶液を調製し、自動液体ハンドラーの浅部貯留層に試金する板の数のための十分な量を追加します。
- 4.5 μ L の NaCl 水溶液をストレージ ・ 384 ウェル ブラック プレートのサンプルに転送することによって標準の曲線と一致するサンプルの塩濃度を調整します。
- 3 回 30 μ L の混合量を使用してサンプルをミックスし、浅い白サンプルの転送 2 μ L よくアッセイ プレート アッセイ プレート レイアウトによると。
- サンプル プレートの間にヒントを変更します。
- 室温で暗闇の中で 1 時間インキュベートします。
- 実行するアッセイ プレート数、アッセイバッファーでアクセプター ビーズの十分な量を作る。アッセイバッファー 12.3 mL にセカンダリ アクセプター ビーズを 200 μ l 添加の割合を使用します。
- マルチ チャンネルの pipettor を使用して、黒の 384 ウェル保存プレートにセカンダリ ビーズを追加します。
- サンプルとアッセイ プレート レイアウトに従って標準曲線の使用のために指定の井戸にセカンダリ ビーズを追加します。
- よく実行するアッセイ プレート数のためにつき十分な量を追加します。
- 自動液体ハンドラーを使用すると、白の 384 ウェル浅いよくアッセイ プレートの井戸にセカンダリのビーズの 10 μ L を転送します。
- サンプルとアッセイ プレート レイアウトに従って標準曲線を受けた井戸にのみを追加し、各プレート間ヒントを洗浄します。
- 室温で暗闇の中で別の時間孵化させなさい。
- アクセプター ビーズ抗体の混合物の 8 μ L を白の 384 ウェル浅いよくアッセイ プレートの井戸に転送します。
- アッセイ プレート プレート シールをオフし、アッセイと互換性のあるプレート リーダーを使用してスキャンをシールします。スキャンに 550 ms 測定時 180 ms 励磁時間と検出器プレート間 0.2 mm を使用します。
- IL 8 試金から raw データをスプレッドシートにインポートします。
- IL 8 の試金の標準曲線の自動曲線を使用し、pg/mL 各サンプルのために生データを変換します。
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Representative Results
露光法の開発
私たちは洗練され、ひと角膜上皮細胞線 SV40 HCEC 高温超伝導の研究で使用するための適合性を評価します。SV40 HCEC SV 40 大 T 抗原を用いた不死化された層から発掘 Pal23からの贈り物だった.簡潔にここに提示する露出方法論開発の検討も多くの変数があった、だから、信じて我々 の調査結果のいくつかのサンプルはより広範に適用される可能性がありますだけに複数の有害物質が表示されます。
スパイクまたは媒体の交換によって毒性物質の暴露
我々 は当初媒体最終曝露濃度を達成するために 96 ウェル プレートでのセルの各ウェルにすでに現在の 95 μ L に希釈水、生理食塩水、または媒体の毒性物質の作業濃度 5 μ L スパイキングして細胞を公開しようと思う。SV40 HCEC は 1 X LD50 HFA の 24 h のための方法論を公開/再フィードこのスパイクを使用して公開された (1 X LD50 = 0.02 %hfa スパイクは培地で希釈したときにこのメソッドで HFA)、ウェルズが新鮮な培地 10 分後, 再給餌と。24 h 後のセルは、セル実行可能性の試金のため上記のように、MTT 基板で覆われていた。画像は、顕微鏡撮影前に DMSO を塩結晶の可溶化によって捕獲されました。井戸の精査の結果, 細胞死の大部分が 1 つの場所に限局し、これはプレートが 15 の動揺したにも関わらず、直後にスパイク s は全体のプレート (図 1 a) に追加されました。スパイクがよくまたは追加されるメニスカスで下部に追加されたこの現象が観察されました。細胞の位相コントラストを示していますを使用してこの領域の高倍率画像は MTT (図 1 b) によって無染色領域で保持されています。また公開/再フィード方法論 HFA の 1 X LD50を含む細胞培養液に置き換え、井戸から媒体を取り外したメディア交換をテストした (1 X LD50 0.035% を = このメソッドによって HFA) 井戸が新鮮な培地 10 分給あとで。24 h 後のセルは、前述のように、MTT 基板で覆われていた。このメソッドは、どうやらよりも細胞死応答 (図 1 c と 1 d) 各ウェル内のセルを達成しました。非公開のコントロールは参照に提供され、細胞死 (図 1e と 1 f) のローカライズされた領域は表示されません。CP のエクスポー ジャー、スパイク メソッドされませんでした; 各ウェル内の 1 つの場所にローカライズされた細胞死の大部分しかし、細胞死応答はより一貫性のある 1 つのイテレーションから次にメディア交換露出メソッド (データは示されていない) を使用します。
図 1: 細胞死によるスパイクとメディア交換露出方法。すべての画像は、MTT 基板の付加の後でキャプチャされた 1.5 h をだった。(A) パネルは、SV40 HCEC 方法論を公開/再フィード HFA スパイクにさらされるの明視野イメージです。パネル (b) は (a) パネルで同じ井戸の倍率が高いほど位相を使用しています。パネル (c) は、メディアの交換の方法論を公開/再フィードによって公開される SV40 HCEC の明視野イメージです。(D) パネルは、パネル (c) 位相コントラストを使用して同じ井戸の高倍率です。パネル (e) と (f) は、それぞれよく非公開、明るいフィールドおよび位相コントラスト高倍率からです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
中の毒性物質の安定性
培地で希釈、HF と CP の見かけの毒性変化し、安定が観察されました。HFA は 0.0036% 培地で希釈され、37 ° C、上記のように SV40 HCECs を公開する前に 1 60 分インキュベートすること。HFA、細胞毒性は HFA 培地で希釈されて、ため安定し、少なくとも時間 (図 2 a) 最初の 5 分以内で増加します。一方通行 ANOVA · ダネットの多重比較検定が続くその % セル実行可能性を示したすべての時点は 1 分時点と大きく異なっていました。時間ポイント 2.5 に 60 分間に有意差がないです。CP は有機、最初 DMSO で 5% に希釈しています。0.0008% の培地で希釈し、, 前述のように SV40 HCECs を公開する前に 5 120 分の 37 ° C でを許可されました。培地で希釈、一度 CP の細胞毒性は 60 分以上を減少し、次の時間 (図 2 b) 少なくとも、安定します。· ダネットの多重比較検定が続く分散分析を示したその % セル実行可能性すべての時間ポイントする 1 つの方法は、5 分時点と大きく異なっていました。時間ポイントを 60 〜 120 分間に有意差がないです。
図 2: 培地の希釈液の細胞毒性の毒性物質の損失。データはパーセント生存率 ± SD の平均値として表されます (n = 6)。(A) パネルは、0.0036 %hfa 細胞培地で希釈し、前述のように SV40 HCECs を公開する前に 1 60 分間室温でインキュベートするときの安定性を示しています。(B) パネルは、0.0008 %cp 細胞培地で希釈し、, 前述のように SV40 HCECs を公開する前に 5 120 分の 37 ° C でを許可するときの安定性を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
公開/再フィードまたは公開のみ
露出方法論を検討する別の要因だったかどうか: A) 10 分、洗浄、再フィード、化学の発煙のフードからプレートを削除するために毒性物質を追加し、標準細胞文化のインキュベーター (公開/再フィード メソッド) で 24 時間インキュベートまたは B) 毒性物質を追加、それを残して、化学の発煙のフードからプレートを削除、標準細胞文化のインキュベーター (公開唯一の方法) で 24 h を孵化させなさい。安全性が重要なので、毒性物質は、ガスをオフし公開人事化学発煙のフードからの希薄化後の毒性物質が含まれているセルのプレートを削除する許容できない場合があります。関連考察があります詳細板以来の時点で公開する板の数、大きいボリューム毒ガス攻撃があります。当社の高温超電導メソッド、特定の調査日に 48 × 96 ウェルのプレートを公開します。密封された袋に露出した細胞培養皿をされ CP と HF 毒ガス露出板から評価する比色定量ガス検知管を使用します。わかった、HFA の LD50 x 1 48 板を公開されませんでした、検出可能な HF 毒ガス (データは示されていない)。CP 露光のため十分な CP 毒ガス攻撃、少なくともいくつかの安全性の懸念 (データは示されていない) を提示する LD50 x 1 にさらされる 48 の版からがあったことがわかった。公開/再フィードと公開メソッドのみが HFA エクスポー ジャーについて検討しました。SV40 HCEC 細胞は HFA にさらされた、生存率は暴露後 MTT の試金 24 h によって評価されました。線量応答イテレーションを別の日に行った。公開の唯一の方法がより一貫性のある細胞生存率測定結果 (図 3 b) を制作公開/再フィード メソッド (図 3 a) と比較して、わかった。したがって、このメソッドは、最終的な露出方法論の一部として選ばれました。Cp、セル実行可能性の試金結果の一貫性の 2 つの異なる露出の方法論の違いを評価できませんでしたので安全性の懸念を排除で 24 時間培養の化学発煙のフードから公開される CP プレートを取り外し、標準細胞文化のインキュベーター。
図 3: 公開/再フィードと露出の一貫性およびメソッドだけを公開します。データはパーセント生存率 ± SD の平均値として表されます (n = 6)。() HFA 培地で希釈し、10 分間室温でインキュベート、細胞を公開する公開/再フィード メソッドによって使用されます。(b) HFA 培地で希釈し、10 分間室温でインキュベート、公開のみによる SV40 HCEC を公開する使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
洗練された細胞モデル
培地成分
私たちは通路やこれらの細胞株のメンテナンスのため元の調査官によって確立された文化の条件に付着ただし、我々 は実験で細胞のそれらを変更しました。SV40 HCEC セルの元の調査官によって規定する細胞培養培地は、ヒドロコルチゾンを含みませんが、サイトカイン産生で時折スパイクを抑制する露出研究中にヒドロコルチゾン (0.5 μ g/mL) の低レベルを利用素朴な SV40-HCEC (データは示されていない) に見られるに悪影響洗練の研究中に次に 1 つのイテレーションからのデータ分析。
表現型の安定性
私たち細胞モデル洗練された研究の中に我々 は発見した SV40 HCEC 通路数 60 (データは示されていない) ごろから毒性物質の露出への応答におけるサイトカイン産生が減少し始めます。このため、低通過細胞の cryostocks を維持、通路番号 60、下のセルを使用してすべての研究を実行し、サイトカイン産生審査の過程を監視します。
プレート レイアウト
高スループット研究における実験的変動の重要な源は、ウェル プレートのエッジ効果です。我々 は、エッジ井戸細胞のサイトカイン応答に一致してなかったまたは両方の内部の井戸に相当 HFA と CP 研究 (データは示されていない) を発見します。データ、データ セットにエッジ効果を最小限に抑えるために使用される統計的な運動の中央ポーランドは (データは示されていない) 問題を十分に解決しなかった。したがって、細胞板エッジ井戸使用されなかった実験またはコントロール (図 4)。
図 4: ライブラリと細胞板のレイアウト。ライブラリ プレート レイアウトの灰色の影の部分では、siRNA を含む井戸を表しています。白井が空です。図書館板行 A ~ D から 40 のターゲットは「トップ プレート セット」に使用され、ライブラリ プレート行数 E H から 40 のターゲット「下部プレート セット」で使用されています。井戸 B2 B6 は、否定的なプールの siRNA のコントロールに使用されます。井戸 C2 ・ C6 が非 transfected です。井戸 B7 B11 cardamonin または前述のように、SKF 86002 陽性対照薬の使用し、井戸 C7 C11 は DMSO 車両制御に使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
高温超伝導の生体外モデルの検証
Z を用いて「HTS24のアッセイの品質を決定するこの検定が使用される SV40 HCEC の高温超伝導研究で使用するための適合性を決定するための要因分析。HF z ' 要因分析、103細胞/ウェル、否定的なプールの siRNA (前述) をトランスフェクトした x 1.25 細胞を播種, 播種後 24 h と 0.0036% にトランスフェクション後露出の 48 h HFA (LD50x 1)、n = 3。CP z ' 要因分析、細胞播種した前述のように、トランスフェクションし、0.0008% にトランスフェクション後 48 h を公開 CP (LD50x 1)、n = 5。大きい n は、この露出モデルの大きな変動により CP 研究に使われました。Z' IL 8 式 CP と HFA の露光のため細胞対公開露出されていない非公開対公開セルおよび否定的なプール siRNA トランスフェクションからデータの係数を計算しました。また、siRNA トランスフェクションによるアッセイ品質に影響があったかを決定するための非トランスフェクト細胞を分析しました。Z を最大化するために露出とその培養条件を精製しながら検証研究の多くのイテレーションを行った ' 結果の要因。SV40 HCEC に合格せず、ほとんど反復いた Z' 0.50 HF エクスポー ジャー (表 1) と CP エクスポー ジャー (表 2) より大きい値の要因。これらのテーブルのそれぞれの複製は、細胞が別の日にメッキからだった。
| 露出グループ | Z'-因子分析 | ||
| 議員 # 1 | 議員 # 2 | 議員 # 3 | |
| 非公開のネガティブ コントロールと HF 公開ネガティブ コントロール | 0.68 | 0.5 | 0.56 |
| 素朴な対 HF 公開 | 0.4 | 0.68 | 0.56 |
表 1: SV40 HCEC HFA 露出 Z' IL 8 の要因分析
| 露出グループ | Z'-因子分析 | ||
| 議員 # 1 | 議員 # 2 | 議員 # 3 | |
| 非公開のネガティブ コントロール対 CP 公開ネガティブ コントロール | 0.6 | 0.18 | 0.46 |
| 素朴な対 CP 公開 | 0.42 | 0.29 | 0.42 |
表 2: SV40 HCEC CP 露出 Z' IL 8 の要因分析
主な siRNA の HFA 負傷細胞スクリーニング結果
検診前にトランスフェクション最適化研究を行った、サイクロフィリン b をターゲットとする siRNA がこれらの研究のために使用されました。その場でRNA 検出アッセイは、サイクロフィリン b の mRNA のレベルを測定する使用され、高いコンテンツ アナライザーだった結果を定量化するために使用します。サイクロフィリン b の打撃および 4 pmol の siRNA/ウェルと 0.3 μ L/ウェル トランスフェクション試薬 (データは示されていない) で 5-10% セル損失以上は通常の 90% 近くを達成しました。SiRNA の多量は実際に貧しいサイクロフィリン b ノックダウン (データは示されていない) で起因しました。ノックダウンの同じようなレベルを実現した siRNA と 0.09 μ L/ウェル トランスフェクション試薬の 1.2 pmol/ウェルが私たちに効果的な打撃を達成するために siRNA の大きい量が必要になる目標を対処するために、ウェルあたり 4 pmol を使用する選んだ。ターゲット ノックダウン速度も評価を行い、そのターゲット ノックダウンされた最大 2 日後トランスフェクション (データは示されていない) で観察されました。ターゲット プレート間ノックダウン整合性も検証 (データは示されていない) だった。抗炎症薬 cardamonin と SKF 86002 用ポジティブ コントロールとして HFA と CP の露出のためのサイトカイン産生の抑制それぞれ。これらは、露出した細胞で様々 な既知の抗炎症特性をもつ化合物のテストによって選ばれました。スクリーニングに関する研究に利用されている線量は、線量応答最適化スタディによって選ばれました。
スクリーニング戦略利用高スループット siRNA は業界標準と 3 つの主要な手順: 1) 一次審査、2) ライブラリ デコンボリューション、3) ターゲットの検証。一次審査は、各遺伝子を対象とする単一試薬として別の siRNA 配列の混合物を利用した各ターゲットの表現が評価されます。ターゲットがダウン選択ライブラリ デコンボリューションになります。この手順で一次審査において各遺伝子を対象とするプールが異なる siRNA 配列のそれぞれが個別にテストされます。ターゲットは、薬、表現型の復元、および/または他のベンダーによる siRNA のターゲット表現型を確認したターゲットの検証に別のダウン選択を受けます。私たちの主な画面の我々 は経済という理由からゲノム ワイド スクリーンよりもむしろ焦点を当てたサブ ゲノム スクリーンを実行に選出されました。HF と CP からのマイクロ アレイ データ負傷マウス角膜と創意工夫経路解析 (IPA) を用いて一次スクリーン (原稿準備) のためのターゲット ライブラリに焦点を当てます。簡単に言えば、マウス角膜は前述方法25に似て蒸気カップを使用して毒性物質の蒸気にさらされました。露出した角膜ボタンとコントロールがポイント投稿露出様々 な時間で収穫されました。RNA が分離され、品質と RNA の量を監視します。すべてのマイクロ アレイの実験は、26製造元のプロトコルに従って行われました。生の信号強度は正規化され、主成分分析 (PCA)、データの変動の重要な原因を判断する分析します。遺伝子は、統計的有意性の順のランクだった。データは採掘され、事前に構成された siRNA ライブラリーの遺伝子リストと比較しています。これらの遺伝子のリストから 3120 スクリーニング対象を選択しました。SiRNA ライブラリーは、SV40 HCEC 細胞 (一次スクリーンのための高温超伝導プロトコルのフロー ・ チャート図 5を参照) で上映されました。エンドポイント評価には、細胞培養液中の IL 8 レベルには MTT の試金によって無洗米ビーズ アッセイと細胞生存率が含まれています。セルは、LD50x 約 1 である 0.0036%HFA、前述のようにさらされました。細胞生存率は MTT の試金 24 h で露出後に評価されました。厳密に標準化された平均値の差 (SSMD)27を使用して各プレートの露出負プール平均を基準にして統計的有意性 siRNA プールごとの細胞生存率に及ぼす影響を調べた。SSMD と細胞生存率倍変更のデュアル懐中電灯プロットを図 6に示します。悪化して細胞死や細胞生存率を改善するターゲットの選択ヒット選択しきい値は、それぞれ SSMD ≤-1.28 SSMD ≥ 1.28 で。
図 5: プライマリ画面 HTS プロトコルのフロー チャート。このフロー ・ チャートは、毎日高温超電導プロトコルで実行される基本的な手順を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: Cell Viability of HFA-Exposed SV40 HCEC 細胞に及ぼす siRNA のデュアル懐中電灯プロットします。ターゲットごとに示されている結果、六つの複製の平均 (n = 6)。細胞生存率のデータは公開されている否定的なプールのコントロール siRNA を基準にしてフォールドの変更として表されます、統計的有意性は SSMD によって分析しました。SSMD ≤-1.28 または ≥ 1.28 があったターゲット ヒットしました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
各プレートの露出否定的なプールの平均を基準にして統計的な有意性 siRNA の各プールの HFA 誘起 il-8 産生に及ぼす影響を調べた。IL-8 細胞培養上清中には曝露後評価分析 24 h だったSSMD と IL-8 倍変更のデュアル懐中電灯のプロットは図 7に示します。Il-8 産生の減少ターゲットの選択ヒット選択しきい値は 40% 減と SSMD ≤-1.0 だったIl-8 産生を増加目標のため 5 倍増加、SSMD を選ばれたヒット選択しきい値 > 1.28。
図 7: HFA-Exposed SV40 HCEC 細胞の il-8 産生に及ぼす影響 siRNA のデュアル懐中電灯プロットします。結果は六つの複製の平均 (n = 6)。IL 8 式レベルのデータは公開されている否定的なプール siRNA を基準にしてフォールドの変更として表されます、統計的有意性は SSMD によって分析しました。ヒットは、40% があったターゲット減少 IL 8 レベルと SSMD ≤-1.0、または IL-8 レベルや SSMD の 5 倍の増加として定義されて > 1.28。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここ HF および CP の傷害の研究のためのモデルをスクリーニングする高スループット角膜上皮細胞の開発に、私たちの方法と結果を述べる。HF 傷害の主な siRNA 画面から結果を提案する.TIC の傷害の研究のための高温超伝導モデルの開発に多くの課題があった。我々 は細胞培養モデルの HF、HFA または CP の研究に関連する文献で見つけることができる方法は、少しの助けのだった。フッ化物イオンのほとんどの in vitro研究口腔細胞と (例についてを参照してください28,29) HF や HFA ではなく、フッ化ナトリウムを利用します。Pesonenらによる気道上皮細胞の体外露出 CP へのいくつかの方法論を公開されています。30します。 最終的には、我々 の特定のメソッドに見つかりません HF、HFA または CP の高温超伝導研究と課題と必要な高温超伝導体開発でこれらの有効成分の研究に関連した変数の大半に関連文献。時間と成功した高温超伝導研究に必要な多数のスクリーニング プレート間で高度に露出の一貫性を達成するために特に注意を払った。
1 種類のチャレンジが発生毒性物質の細胞培養システムへの応用に関連していた。いくつかの毒性と反応または水溶液中で不安定です。我々 は研究のため選択毒性はこれらの不安定性の問題があるとはみなされない。CP の photohydrolysis を調査農業研究水の CP の 0.001 M 溶液が 10 日間、12 時間日31あたり 1100 ルクス キセノン ライト ソース (曇りの日の太陽光強度) に露出されたとき 31.1 h の半減期を持っていたことを示した。ソリューションが暗闇の中に格納されていたとき同じの 10 日間にわたって測定可能な加水分解はありませんでした。HFA のプロトンとフッ化物イオンは明らかに水で安定しています。しかし、細胞培養液の毒性物質の希釈について追加の安定性の考慮事項があります。有害物質は、短時間後安定細胞培養培地で希釈された最初ある程度細胞毒性の初期変化があったことがわかった。毒性物質のバインディングまたは錯形成培地に含まれる成分が原因であると考えています。細胞用培地には、カルシウム、マグネシウム、タンパク質、フッ化物イオン32,33と対話する知られているなどが含まれています。CP は生物のチオール基の酸化反応知られているが、それは DNA、タンパク質、および他の求核剤34,35バインド可能性がありますも。これらの反応と相互作用が完了または平衡に達して後、利用可能な毒性物質の量を安定化し、こうして明らかな毒性を安定化させます。我々 は当初用露光作業希釈培地成分と毒性物質の相互作用を避けるために株式を働いているのため毒性の生理食塩水と水の希釈液の使用を検討しました。生理食塩水使用中の exchange によって実行されたエクスポー ジャーの HFA 傷害の酸成分も維持されます。水や生理食塩水の希釈液の毒性物質に細胞死応答あったメディア交換 (データは示されていない) で細胞培養培地の希釈液を使用する方法よりも多くの変数であることがわかった。HFA とスパイクの露出方法、についての利用できるフッ化物イオンの中の成分と競合する携帯電話のターゲットにもつながるで様のスパイクで矛盾変動可能性があります。HFA 生理食塩水希釈でメディアの交換によって HFA エクスポー ジャーの変動の理由は完全に明確ではないです。任意のイベントでは、HFA の生理食塩水の希釈を使用して露出方法は放棄し、ない CP のために探検されました。私たちの HFA 希釈培地での毒性は、おそらく密接に細胞培地私たち HFA 希薄で無料のプロトンをバッファーするためにフッ化ナトリウムを用いた研究を模倣します。
我々 が遭遇した他の課題 HTS. 用細胞培養モデルの改良に関連していた具体的にはヒドロコルチゾンと抗生物質の実験で細胞の細胞培養培地成分の変更が必要だとわかった。我々 は素朴な SV40 HCEC に見られるサイトカイン生産で時折スパイクを抑制する露出研究中にヒドロコルチゾン (0.5 μ g/mL) の低レベルを利用しました。この低金額ヒドロコルチゾンの毒性物質に対する細胞の反応に悪影響を及ぼさないし、覚醒剤36,37に応えて培養細胞のサイトカイン産生を抑制する通常使用されるレベルの下にあった。なぜナイーブ SV40 HCEC 細胞は時折過剰なサイトカインを生産する正確な理由は知られていないが、セルが必ず継とめっきセル中に発生する軽微なストレスに敏感であることが可能です。多くのラボにはで日常的に抗生物質が含まれて細胞維持培でもいくつかの抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質が特に、角膜上皮細胞38を含む培養細胞に対する抗炎症効果を示すよう示されています。一般に、当研究室は、これらは潜在的研究を混同することができますので可能な限り抗生物質の使用を回避できます。私たち培養細胞の複数箇所を表現型のドリフトを調べた。それ複数箇所を遺伝的および/または表現型のドリフトを受ける不死化細胞のために共通が維持されていない場合指数段階の confluency に到達する許可されている場合、または特定環境ストレス39,40 に公開 ,41。したがって、細胞は適切に維持され、画面が完了すると知られている表現型の応答を維持する細胞の通路番号を使用して高スループット画面中に重要です。ウェル プレート エッジ効果は、しばしばウェル プレートの外周の井戸で育った細胞が同じ応答しないまたは整合性のとれたインテリアで育った細胞として同一井戸42現象です。統計演習、中央ポーランド語、データ セット43のエッジ効果を最小限に抑えるために利用できるなどがあります。ただし、特定のターゲットまたはコントロールのエッジ効果をなくすことができる場合、それは常にエッジだけでテストしターゲットを移動する複製間プレート レイアウトを変化またはエッジ井戸からコントロールがロジスティック統計の練習はありません。実用的または効果的なコストです。細胞を用いた HTS アッセイにエッジの井戸の使用を含めるかどうかは慎重にすべきである私たちの意見です。エッジ コントロールとターゲットの井戸で育った細胞の排除に必要だとわかった。
HF 傷害の in vitroのため私たち HTS 細胞モデルと露出方法は 3120 ターゲットのプライマリ siRNA 画面を正常に完了する使用されました。SSMD は、コントロールと siRNA27の差の大きさを測定するために具体的に提案されたので、ヒットの選択に使われました。セル実行可能性のデュアル懐中電灯プロット SSMD とフォールド-の変更を事実上すべてのターゲットとの間に線形関係があったことが分かった。このため、このエンドポイントのヒットの選択の SSMD の 1 つの基準を使用しました。IL 8 データで違い強いが、矛盾した効果を示した他の人にいくつかのターゲットが弱いが、一貫性のある効果を持っていた。したがって、このエンドポイントのヒットの選択基準のため、フォールドの変更と SSMD の両方を使いました。SSMD 値は、両方の細胞の生存率のヒットの選択に使われ、低偽の発見と非検出率441 と 1.645 (または-1 と-1.65) のヒューズを達成するので、IL-8 データが選ばれました。細胞生存率と IL-8 データの両方でヒットしたいくつかのターゲットがあった。これらのケースでデコンボリューション ライブラリに含めることのための好み (改良された生存率と減少の IL-8) の全体的な健康の改善または傷害を悪化させるのと同じ方向での影響を及ぼすそれらのターゲットに与えられた (細胞死が増加し、増加 IL-8)。全体的に、我々 はセル実行可能性および HF 傷害のデコンボリューション ライブラリを構成する IL 8 エンドポイント間で 250 のターゲットの合計を選択しました。体外CP 傷害の主な画面は、進行中です。
要約すると、HF と CP による眼障害の高温超伝導研究に適した露出と文化の条件を開発しました。モデルは Z で高温超伝導研究のために適していることが検証されて、露出とその培養条件で複数の変数が洗練された、最適化、' 要因分析。我々 はさらに HF モデルでの siRNA ライブラリーのプライマリ画面を完了することによってこれらのモデルの有用性を証明しています。多くのけがやないのは、病気があるか、医薬品やバイオ テクノロジー産業 CP と含まれて、HF による毒性物質の障害に限られた興味と卓上型ロボットの出現を容易にけがや病気のあらゆる研究室での高温超伝導研究.セットは、けがや病気により効率的に焦点を助けることができる特定の遺伝子の役割の理解に大きく貢献できる高いスループット ゲノムデータに生体外でまたは生体内での研究に従ってください。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
免責事項: この記事の見解は、著者の軍隊の部門、国防省、または米国政府の公式な方針を反映していません。この研究は NIH/NIAID と USAMRICD、間の省庁間の契約によってサポートされ、一部オークによって管理される大学院の研究参加プログラムで米国陸軍医療研究所の化学防衛する予定でリッジ米国エネルギー省と USAMRMC 間の省庁間協定により教育研究所。
Acknowledgments
この研究によって、国家機関の健康対抗プログラム省庁間契約 # AOD13015-001 に対応しました。我々 は彼らの努力と映像制作に関する専門知識のステファニー Froberg とピーター ・ ハーストを感謝したいです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bravo liquid handing platform | Agilent or equivalent | G5409A | |
| Bravo plate shaker | Agilent or equivalent | Option 159 | |
| Bravo 96LT disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 178 | 96-channel large tip pipetting head unit |
| Bravo 96ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 177 | 96-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 384ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 179 | 384-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 96 250 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19477-022 | |
| Bravo 384 30 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| Bravo 384 70 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| EnSpire multimode plate reader | Perkin Elmer or equivalent | 2300-0000 | AlphaLISA assay detector with high power laser excitation |
| IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit | Perkin Elmer or equivalent | AL224F | no-wash bead-based assay |
| ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates | Perkin Elmer or equivalent | 6008359 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen or equivalent | 13778500 | Transfection reagent |
| Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium | Invitrogen or equivalent | 31985070 | |
| TrypLE Express | Gibco or equivalent | 12605010 | Cell detachment solution |
| IncuCyte Zoom | Essen Instruments or equivalent | ESSEN BIOSCI 4473 | Incubator-housed automated microscope |
| Chloropicrin | Trinity Manufacturing or equivalent | N/A | Acute toxicity and irritant |
| DMEM-F12 cell culture medium | Invitrogen or equivalent | 11330-057 | Contains HEPES |
| Fetal bovine serum | Invitrogen or equivalent | 1891471 | |
| Human epidermal growth factor (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | E9644-.2MG | |
| Recombinant human insulin (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 12585-014 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 15140122 | |
| Hydrocortisone (cell culture grade) | Sigma or equivalent | H0888-10G | |
| Glucose (cell culture grade) | Sigma or equivalent | G7021 | |
| PBS (cell culture grade) | Sigma or equivalent | P5493 | |
| siRNA | Dharmacon or equivalent | various | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | Sigma or equivalent | M5655 | MTT assay substrate |
| siRNA buffer | Thermo or equivalent | B002000 | |
| 96-well cell culture plates | Corning or equivalent | CLS3595 | |
| T150 cell culture flasks | Corning or equivalent | CLS430825 | |
| BSL-2 cell culture hood | Nuaire or equivalent | NU-540 | |
| 300 mL robotic reservoirs | Thermo or equivalent | 12-565-572 | |
| 96 baffled automation reservoirs | Thermo or equivalent | 1064-15-8 | |
| 500 mL sterile disposable storage bottles | Corning or equivalent | CLS430282 | |
| Microplate heat sealer | Thermo or equivalent | AB-1443A | |
| Microplate heat sealing foil | Thermo or equivalent | AB-0475 | |
| Cardamonin | Tocris or equivalent | 2509 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| SKF 86002 | Tocris or equivalent | 2008 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| DMSO | Sigma or equivalent | D8418 | |
| 48% hydrofluoric acid | Sigma or equivalent | 339261 | Corrosive and acute toxicity |
| 1000 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014382 | |
| 200 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014391 | |
| 20 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014392 | |
| 1000 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014497 | |
| 200 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013810 | |
| 20 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013808 | |
| Pipettor tips 1000 μL | Rainin or equivalent | 17002920 | |
| Pipettor tips 200 μL | Rainin or equivalent | 17014294 | |
| Pipettor tips 20 μL | Rainin or equivalent | 17002928 | |
| Chemical fume hood | Jamestown Metal Products | MHCO_229 | |
| 384-well sample storage plates | Thermo or equivalent | 262261 | |
| Sodium chloride | Sigma or equivalent | S6191 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo or equivalent | 14-959-49A | |
| Serological pipettes 50 mL | Corning or equivalent | 07-200-576 | |
| Serological pipettes 25 mL | Corning or equivalent | 07-200-575 | |
| Serological pipettes 10 mL | Corning or equivalent | 07-200-574 | |
| Serological pipettes 5 mL | Corning or equivalent | 07-200-573 | |
| SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells | N/A | N/A | These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article |
| Sceptor Handheld Automated Cell Counter | Millipore or equivalent | PHCC20060 | |
| GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument | Affymetrix or equivalent | 00-0372 | |
| Affymetrix 24- and 96-array plates | Affymetrix or equivalent | 901257; 901434 | |
| Draegger tube HF | Draeger or equivalent | 8103251 | |
| Draegger tube CP | Draeger or equivalent | 8103421 | |
| Draegger pump | Draeger or equivalent | 6400000 | |
| Clear Plate seals | Resesarch Products International or Equivalent | 202502 | |
| Reagent reservoirs | VistaLab Technologies or equivalent | 3054-1000 | |
| Xlfit | IDBS or equivalent | N/A | Excel add-in used for automated curve fitting |
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