Summary
ويرد في هذه الورقة، طريقة لقياس استهلاك الأوكسجين باستخدام ريسبيروميتري عالية الدقة في ثوراكسيس بيرميبيليزيد من المورفولوجية. هذا الأسلوب يتطلب مقداراً قليلاً من الأنسجة مقارنة بتقنية عزل المتقدرية الكلاسيكية وما تحقق من النتائج ذات صلة أكثر فسيولوجيا.
Abstract
ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، يمثل نموذجا ناشئة لدراسة الأيض. في الواقع، المورفولوجية لها هياكل مثلى للأعضاء البشرية وامتلاك الأيضية العالية المصانة ولها عمر قصير نسبيا يسمح دراسة مختلف الآليات الأساسية في فترة قصيرة من الزمن. بيد أنه من المستغرب أن إحدى الآليات الأساسية الأيض الخلوية، التنفس المتقدرية، قد لم يتم دقة التحقيق في هذا النموذج. فمن المحتمل لأنه عادة ما يتطلب قياس التنفس المتقدرية في المورفولوجية عدد كبير جداً من الأفراد والنتائج التي تم الحصول عليها لا استنساخه بدرجة عالية. هنا، يتم وصف أسلوب يسمح للقياس الدقيق لاستهلاك الأكسجين الميتوكوندريا باستخدام كميات ضئيلة من نسيج المورفولوجية. في هذا الأسلوب، تشريح ثوراكسيس وبيرميبيليزيد على حد سواء مع الملقط حادة ميكانيكيا وكيميائيا صابونين، السماح لمركبات مختلفة عبر غشاء الخلية وتعدل التنفس المتقدرية. بعد بيرميبيليزيشن، يتم وضع بروتوكول لتقييم قدرة المجمعات المختلفة لنظام نقل الإلكترون (ETS) لأكسدة ركائز مختلفة، فضلا عن استجابتها أونكوبلير ومثبطات عديدة. ويعرض هذا الأسلوب العديد من المزايا مقارنة بأساليب استخدام العزلة المتقدرية، كما أنها ذات الصلة أكثر فسيولوجيا لأن الميتوكوندريا لا تزال تتفاعل مع المكونات الخلوية الأخرى وهو يحافظ مورفولوجية المتقدرية. وعلاوة على ذلك، نموذج الأعمال التحضيرية أسرع، والنتائج المتحصل عليها يتم استنساخه بدرجة عالية. عن طريق الجمع بين مزايا المورفولوجية كنموذج لدراسة الأيض مع تقييم التنفس المتقدرية، المهم رؤى جديدة يمكن كشف النقاب عنها، خاصة الذباب تشهد فيه مختلف البيئية أو الفيزيولوجية المرضية شروط.
Introduction
ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، قد استخدمت ككائن نموذج للبحوث الوراثية لعلى مدى قرن1. دراسة هذا الكائن لم يؤد فقط إلى المعرفة الأساسية الهامة حول الميراث المرتبطة2والطفرات معدل3، تطوير الجهاز العصبي و تحديد مصير الخلية4، لكنه برز أيضا في الآونة الأخيرة أداة قيمة لدراسة الآليات الكامنة للعديد من الأمراض مثل مرض الزهايمر وباركنسون5،6. وعلاوة على ذلك، نموذج شعبية لدراسة عملية الشيخوخة، كما أنها يمكن أن تثار في عدد كبير خلال فترة قصيرة من الزمن ولها عمر قصير. كما أنها تمتلك هياكل مثلى للأعضاء البشرية، مثل قلب، oenocytes (مثل تتمثل الخلايا)، وهيئات الدهون (أداء المثل الأنسجة الدهنية البيضاء والكبد)، الأنسولين المنتجة للخلايا (ما يعادل الخلايا β البنكرياس)، فضلا عن هيموليمف نقل نواتج الأيض (يناظر دم الفقاريات)7. وعلاوة على ذلك، وسط مسارات الأيض الوسيطة (بما في ذلك مسار الإشارات الشبيهة بالانسولين/يشبه الأنسولين عامل النمو ومسارات الهدف ربمسن-تور) هي أيضا عالية حفظت7. لهذه الأسباب، استغلوا مؤخرا المورفولوجية لوصف الآليات الأساسية التي تتحكم في التمثيل الغذائي، خاصة في الحالات المرضية الملازمة للبشرية من الأمراض الأيضية مثل مرض السكري8. هو مكون رئيسي من الأيض ميتوكندريا يدمج مسارات متعددة ويقوم بواحدة من أهم وظائف بيولوجية للحياة، إنتاج ATP، عبر عملية الفسفرة (أوكسفوس). نظراً لدورها المركزي في عملية التمثيل الغذائي للكائن، فمن غير المستغرب أن خلل mitochondrial يشاركون في العديد من الأمراض مثل باركنسون9 والزهايمر من الأمراض10، وكذلك في التصلب العضلي الجانبي 11 , 12-وهم أيضا المحددات الأساسية لعملية الشيخوخة. في الواقع، فهي المنتجة الرئيسية للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) في الخلية، والتي يمكن أن تكون ضارة للخلية عند تركيزات عالية من خلال الأضرار الأكسدة11. كما ارتبطت الشيخوخة إلى تراكم الحمض النووي mitochondrial التالفة أو تحور13، ميتوفاجي الاختلالات14،15 ، فضلا عن إعاقة نشوء حيوي المتقدرية16. الميتوكوندريا هي أيضا المحددات الرئيسية للتوازن للخلية كما يمكن الاستفادة من ركائز مختلفة لضبط العديد من الوظائف الخلوية حسب وفرة أو ندرة المغذيات الكبيرة17،18.
في الواقع، المواد الغذائية المختلفة في الوجبة الغذائية (الكربوهيدرات والدهون والبروتينات) هي هضمها واستيعابها وتنقل في الخلايا. أنهم ثم تتحول في سيتوسول، وينقلون ركائز المشتقة في مصفوفة الميتوكوندريا حيث تنتج مكافئات الحد، مثل NADH والقوات المسلحة الهايتية219. ثم تتأكسد هذه المكافئات مما يقلل من مختلف مجمعات الانزيمية منظومة نقل الإلكترون (ETS). يتم تضمين هذه المجمعات في الغشاء الداخلي المتقدرية، مثل مجمع الأول و "الثاني المعقدة". بالإضافة إلى ذلك، تمثل المجمعات الانزيمية الأخرى مثل نازعة والغليسيرول-3-الفوسفات mitochondrial ونازعه برولين طرق بديلة لدخول الإلكترونات في20،ETS21. هذه المجمعات 'بديل' تتسم بأهمية خاصة في الحشرات، وفقا للأنواع، وأنهم يمكن أن تشارك بنشاط زيادة التنفس20،،من2223،21. يتم نقل الإلكترونات من هذه الاختبارات تغذية النظم إلى أوبيكوينوني وفي وقت لاحق إلى "الثالث معقدة"، ثم إلى "الرابع المعقدة"، حتى يقبلون النهائي، الأوكسجين الجزيئي. نقل الإلكترون هذا يولد قوة دافع بروتون عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية القيادة الفسفرة ADP إلى ATP في "مجمع الخامس" (الشكل 1). نظراً للدور المركزي الميتوكوندريا في التوازن للخلية، دراسة الأيض المتقدرية يمثل melanogaster دال- نموذج ذات الصلة باستخدام أداة قوية لتحديد الآليات الكامنة وراء مختلف الفيزيولوجية المرضية الظروف أو تحت تؤكد الخلوية والبيئية. المثير للدهشة ومع ذلك، سوى عدد قليل من الدراسات فعلا قياس التنفس المتقدرية في المورفولوجية24،،من2526. وفي الواقع، تتطلب تجارب تهدف إلى تقييم استهلاك الأوكسجين المتقدرية عزلة الميتوكوندريا. على الرغم من فائدة لقياس وظائف المتقدرية مختلفة (مثل إنتاج روس أو نسبة P/O كعلامة لكفاءة الميتوكوندريا،من2728)، هذه العزلة عموما تتطلب كميات كبيرة بدلاً من ذلك الأنسجة من عدة أفراد24،29. هذا الشرط لكميات عالية من الأنسجة والأفراد عامل هام يحد، خاصة بالنظر إلى أن جميع الأفراد نفس السن، ويفضل أن تكون من نفس الجنس للتجارب، مما يجعل قياس التنفس في وقت مختلف يشير شاقة في أحسن الأحوال. وعلاوة على ذلك، بينما يمكن أن توفر العزلة المتقدرية كبير من التبصر في الآليات الأساسية التي تنظم الأيض المتقدرية، الأساليب المستخدمة لعزل الميتوكوندريا والعديد من العوائق مثل صعوبة الحصول على نتائج قابلة للتكرار ، تعطل شبكة الميتوكوندريا، وتحوير المتقدرية هيكل ووظيفة29،،من3031.
الهدف من هذه الدراسة تقديم بروتوكول قوية لقياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في المورفولوجية استخدام كمية ضئيلة فقط من الأنسجة من عدد قليل جداً من الأفراد. يتألف هذا البروتوكول من قياس الأوكسجين المتقدرية الاستهلاك في الموقع باستخدام ألياف العضلات بيرميبيليزيد29 من ثوراكسيس المورفولوجية في تركيبة مع ريسبيروميتري عالية الدقة32،33، 34 , 35-هذا الأسلوب له أيضا مزايا إضافية مقارنة بطريقة العزل المتقدرية الكلاسيكية نظراً للتفاعل مع العناصر الأخرى للخلية كما جيدا كما المتقدرية هيكل ووظيفة يتم الاحتفاظ أكثر في بيرميبيليزيد ألياف29،،من3136، مما يجعل هذا النهج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا. مع أحكام هذا البروتوكول، وظائف الميتوكوندريا يمكن دقة تقييم استخدام ريسبيروميتري عالية الدقة في ثوراكسيس ثلاثة فقط من المورفولوجية، مع ركائز يسمح تحديد استهلاك الأوكسجين في عدة خطوات مختلفة من ETS. ولذلك، يمكن أن يساعد هذا البروتوكول الإجابة على أسئلة رئيسية حول الآليات الأساسية التي تتحكم في عملية التمثيل الغذائي في سياق العديد من الظروف البيئية أو الفيزيولوجية المرضية بالاستفادة من نموذج المورفولوجية.
لقياس استهلاك الأوكسجين في عدة خطوات مختلفة ETS وتقييم ركائز مختلفة كيف تسهم التنفس، وركائز مختلفة (الشكل 1)، أونكوبلير، ومثبطات هي تستخدم30 بعد بيرميبيليزيشن من الأنسجة. على وجه التحديد، يتم إجراء إضافات متتالية من ركائز مختلفة لتحفيز دخول الإلكترونات عن طريق مجمعات مختلفة من ETS. أونكوبلير، السيانيد الكربونيل 4--(تريفلوروميثوكسي) فينيلهيدرازوني (فككب)، ثم يضاف بتركيز الأمثل لقياس التنفس غير مقترنة، أي حفز التنفس غير فوسفوريلاتينج لاستهلاك الأوكسجين القصوى. متسلسلة من الموانع من مجمعات ثم تتم الأول، والثاني، والثالث لمراقبة استهلاك الأكسجين المتبقي الذي سبب تفاعلات أكسدة غير ETS. أخيرا، يمكن تقييم القدرة القصوى التنفس الرابع المعقدة بحقن N, N, N '، N، p-ميثيل--فينيلينيدياميني (تمبد)، موفر إلكترون مصطنعة، واسكوربات. من المهم أن نلاحظ أن هذه التجارب تجري في 24 درجةمئوية حيث أنها درجة الحرارة التي تربى الذباب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الكواشف
- إعداد الحلول التالية للتشريح و permeabilization للأنسجة.
- يعد الحفاظ على الحل: 2.77 الكعكة2اجتا، 7.23 م ك2اجتا، مم 5.77 ATP، مم 6.56 مجكل2، التاورين، 20 مم 15 مم phosphocreatine2غ، غ2ايميدازول 20 مم، ديثيوثريتول 0.5 مم، و 50 ملم كمس، الأس الهيدروجيني 7.1 (يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية).
- إعداد حل صابونين: 5 ملغ صابونين في 1 مل من محلول الحفاظ عليها (إعداد يومية جديدة).
- إعداد الحلول التالية لقياس التنفس.
- إعداد متوسطة تنفس: 120 ملم بوكل، 5 مم خ2ص4، 3 مم حبيس، 1 مم عطا، مجكل 1 مم2، وجيش صرب البوسنة 0.2% (w/v)، الرقم الهيدروجيني 7.2.
- تعد ركائز، أونكوبلير، ومثبطات. حل جميع ركائز في ح2س، وحل أونكوبلير فككب فضلا عن مثبطات في الإيثانول المطلق (باستثناء مالوناتي الذي يتم تخفيفه في ح2س). تحييد معظم ركائز، فضلا عن مالوناتي (انظر الجدول للمواد). جميع التركيزات الواردة في البروتوكول تركيزات نهائية داخل الدوائر 2 مل.
2-إعداد ومعايرة ريسبيروميتير عالية الدقة.
- أغسل الدوائر، والقبعات، وسدادات من ريسبيروميتير ثلاث مرات مع الإيثانول 70% وثلاث مرات بماء مقطر.
- معايرة في تركيز الأكسجين صفر: بيبيت 2.3 مل متوسطة التنفس في الدوائر وإضافة 10 مغ من الصوديوم ديثيونيتي. على الرغم من أن حجم الدائرة القصوى 2 مل، تتم إضافة مل 2.3 لضمان أن يبقى لا فقاعة هواء تحت السدادة عند إغلاق الدوائر. إغلاق الدوائر مع السدادات وقياس تركيز الأكسجين عن 10-20 دقيقة معايرة أقطاب صفر تركيز الأكسجين بمعدل استهلاك الأوكسجين الناتج عن ذلك.
- تغسل الدوائر مع الماء ديستيلاتيد واحتضان في الإيثانول المطلقة لمدة 10 دقائق ثم شطف بالماء المقطر.
- معايرة في تشبع الهواء: بيبيت 2.3 مل متوسطة التنفس في الدوائر، وإدراج السدادات ونضح المتوسطة الزائدة على رأس السدادات وثم رفع السدادات مع فاصل. هو بيبيتيد المتوسطة التنفس الزائد في الدوائر (حجم إجمالي 2 مل) لتجنب وجود فقاعات الهواء بعد إغلاق الدوائر.
- مراقبة استهلاك الأكسجين لمدة 45 دقيقة إلى ساعة، حتى يتم تركيز الأكسجين (تتبع الأزرق) مستقرة حوالي 250 نيوتن متر عند 24 درجة مئوية.
3-تشريح الذباب و Permeabilization للأنسجة
- تأكد من أن يتم تنفيذ كافة الخطوات في الجليد.
- تخدير ستة الذباب الذكور من نفس السلالة، ونفس العمر والتي أثيرت بشأن النظام الغذائي نفسه على الجليد لتسهيل تشريح الذباب (البرية من نوع w1118، 15 يوما من العمر، يغذيها متوسطة دقيق الذرة).
- باستخدام مشرط وملقط الجميلة ذات الرؤوس، تشريح الذباب (إزالة رؤساء والبطن) الإبقاء فقط ثوراكسيس التي تحتوي على عضلات الطيران. يمكن إجراء هذه الخطوة بالعين المجردة. التعامل مع ثوراكسيس الناتجة بالملقط مقلوب الجميلة.
- نقل ثلاثة ثوراكسيس تشريح في 25 مم طبق بتري يحتوي على 2 مل من محلول الحفاظ على الجليد باستخدام الملقط.
- مع الملقط الجميلة ذات الرؤوس، ميكانيكيا بيرميبيليزي ثوراكسيس عن طريق إدراج تلميح الملقط إلى ثوراكسيس ومرارا وتكرارا تمزق الأنسجة للحصول على شبكة فضفاضة متصلة.
- في صفيحة 24-حسنا، ملء بئرين مع ميليلتر 12.5 الحل صابونين و 1 مل من محلول الحفاظ على الحصول على تركيز نهائية 62.5 ميكروغرام/مل من صابونين. سد الآبار المجاورة اثنين مع 1 مل متوسطة التنفس.
- مع الملقط الجميلة ذات الرؤوس، نقل ثلاثة ثوراكسيس بيرميبيليزيد في المحلول المخفف صابونين واحتضان مع الانفعالات خفيفة على شاكر مداري، على الجليد، لمدة 20 دقيقة.
- وبعد تفريخ هذه الأخيرة، نقل الألياف في الآبار المجاورة مليئة المتوسطة التنفس مع الانفعالات معتدل، على الجليد، لمدة 5 دقائق شطف صابونين.
4-تحديد الوزن الجاف
- جاف ثوراكسيس بيرميبيليزيد على سطح الامتصاص والوجه 3-4 مرات استخدام الملقط مقلوب غرامة للتأكد من إزالة كل الرطوبة.
- وزن ثوراكسيس الثلاثة معا في ميكروبالانسي. ملاحظة الوزن التي يتم الحصول عليها كما سيتم استخدامه لتطبيع معدلات استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا.
- نقل الأنسجة مباشرة في انخفاض متوسط التنفس على الجليد.
5-تحديد معدلات الاستهلاك الأكسجين
- فتح دوائر ريسبيروميتير (إزالة السدادات) وإضافة 10 مم من بيروفات و 2 مم من مالات في كل دائرة.
- إضافة أنسجة بيرميبيليزيد مباشرة في الدوائر مليئة بالمتوسط التنفس.
- استبدال سدادات تستخدم فاصل.
- مع حقنه 60 مل، جمع الأكسجين مباشرة من دبابة الأوكسجين وحقن 2-5 مل أكسجين من خلال شعري سداده لكل دائرة للتأكد من نشر الأوكسجين من خلال الأنسجة لن يحد من استهلاك الأوكسجين.
- إدراج المحاقن هاملتون في شعري من كل سداده للتأكد من ثوراكسيس البقاء في الدائرة.
- إغلاق الدوائر تماما عندما يكون تركيز الأكسجين حوالي 400 نانومتر، تحقيق مستويات الأوكسجين أعلاه تشبع الهواء (حوالي 160% هواء التشبع) داخل الدوائر.
- إيقاف وإعادة تشغيل النمامون للتحقق من وجود فقاعات الهواء في الدوائر.
- إدخال كتلة الأنسجة وزنه مسبقاً لتطبيع معدلات التنفس بكتلة من الأنسجة (ملغ)، عرض استهلاك الأوكسجين الخاصة بالكتلة (بمول س2 consumed.s-1.mg-1 من الأنسجة).
- مرة واحدة واستقرت استهلاك الأكسجين (تتبع الحمراء)، إضافة 5 مم ADP مع حقنه هاملتون.
- بعد كل حقن، الشطف الحقن بالماء المقطر، الإيثانول 70%، والماء المقطر مرة أخرى.
- بمجرد أن استهلاك الأكسجين مستقر مرة أخرى، حقن 5 ميليلتر من 4 مم ج الفسفرة.
- للانتقال إلى حقن متسلسلة من ركائز التالية لتقييم استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا في خطوات مختلفة ETS:
- إضافة 5 ميليلتر من برولين م 2.
- إضافة 10 ميليلتر من سوكسيناتي م 1.
- إضافة 30 ميليلتر من 1 م الجلسرين-3-الفوسفات.
- حقن أونكوبلير فككب بطريقة معايرة بخطوات 0.5-1 ميكرومتر (2 ميليلتر من حل 1 مم) حتى تركيز الأمثل الذي تم التوصل إليه، أي التركيز على تحقيق أعلى معدل استهلاك الأكسجين ممكن دون تثبيط (تنبيه: انظر الجدول المواد).
- حقن مثبطات التالي تسلسلياً تماما تحول دون تدفق الإلكترونات في ETS بغية قياس استهلاك الأوكسجين المتبقية (روكس) أي ردود غير الجهاز التنفسي مثل ردود الفعل أوكسيجيناسي بين أمور أخرى:
- أضف 1 ميليلتر من والروتينون 1 مم (تنبيه: انظر الجدول للمواد).
- إضافة 5 ميليلتر من مالوناتي م 2 (تنبيه: انظر الجدول للمواد).
- أضف 1 ميليلتر من أنتيميسين 5 مم أ (تنبيه: انظر الجدول للمواد).
- إضافة اسكوربات 0.2 مم و 0.5 مم تمبد تسلسلياً في الدوائر، بدءاً من اسكوربات لقياس استهلاك الأوكسجين الرابع المعقدة.
- إضافة 20 مم أزيد الصوديوم تمنع رابعا المعقدة (تنبيه: انظر الجدول للمواد).
- مجرد الإشارة مستقرة، فتح الدوائر مع فاصل وإعادة الأوكسجين الدوائر عن طريق حقن 2 مل أكسجين النقي وإغلاق الدوائر عندما يكون التركيز حول 250-300 nmol.mL-1.
- قياس الإشارات لمدة 10-15 دقيقة وحساب الخلفية الكيميائية، أي استهلاك الأكسجين بسبب أوتوكسيداتيون تمبد.
6-تنظيف ريسبيروميتير
- بعد القياسات، شطف الدوائر مع الماء المقطر مرة واحدة وشطف الدوائر ثلاث مرات في الإيثانول 70%.
- احتضان في الإيثانول المطلقة لمدة 10 دقيقة لإلغاء تنشيط الموانع.
- شطف ثلاث مرات بماء مقطر وملء الدوائر مع الإيثانول 70% واستبدالها السدادات والقبعات حتى الاستخدام التالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تتبع ممثل من استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا استخدام بروتوكول الموصوفة أعلاه يرد في الشكل 2. بيروفات ومآلات حقن في الدوائر جنبا إلى جنب مع ألياف العضلات بيرميبيليزيد ويشار إلى تنفس CI-تسرب، أيعند المجمع الأول من ETS هي تحفزها NADH إنتاج عن طريق أكسدة بيروفات ومآلات عبر دورة حمض تريكاربوكسيليك (CI). أثناء هذا معدل التنفس، والحفاظ على الأكسجين الميتوكوندريا أساسا للتعويض عن تسرب بروتون، أيالبروتونات عبور من الفضاء intermembrane إلى المصفوفة المتقدرية، عندما لا يكون ATP synthase النشطة (تسرب)30. عندما يضاف ADP، يتم تنشيط ATP synthase ويتم نقل الإلكترونات من المجمع الأول إلى الرابع المعقدة مع الفسفرة المتزامنة من ADP إلى ATP (CI-أوكسفوس)، مما أدى إلى زيادة استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا. وعادة ما تؤخذ كمؤشر جيد النوعية mitochondrial واقتران المتقدرية30نسبة اقتران أوكسفوس يحسب ك CI-أوكسفوس/CI-تسرب. وينبغي أن تتجاوز هذه النسبة على الأقل في المورفولوجية، 6.0 (الشكل 3). إذا كان أقل من هذه القيمة، فإنه يمكن أن يشير إلى وجود مشكلة مع إعداد الأنسجة أو من خلل mitochondrial. إضافة ج الفسفرة يسمح تصميم السلامة للغشاء الميتوكوندريا الخارجي، ويستخدم ذلك كمراقبة الجودة للإعداد (الشكل 4). في الواقع، الفسفرة ج فضفاضة ملزمة للغشاء الميتوكوندريا الداخلية وهو عادة جرفت إذا تلف الغشاء الميتوكوندريا الخارجي أثناء عملية بيرميبيليزيشن. نتيجة لذلك إضافة ج الفسفرة خارجية سوف زيادة كبيرة استهلاك الأوكسجين إذا تلف الغشاء الخارجي mitochondrial ويضيع ج الفسفرة الذاتية. وعادة ما يوضح زيادة أقل من 10-15 في المائة في استهلاك الأوكسجين (الشكل 4) السلامة المناسبة ل الغشاء الميتوكوندريا الخارجي29. في الشكل 3 و 4، وتم الحصول على آثار خضراء من بيرميبيليزيشن غير الكافية ومناولة العينات (مفرطة تمزق الأنسجة الرقم 3، ووزنه بعد وقتاً أطول على سطح ماص الرقم 4)، وفي حين آثار حمراء تمثل عينات كافية بيرميبيليزيد والتعامل معها. هذه النتائج تسلط الضوء على أن الظروف المناسبة بيرميبيليزيشن ذات أهمية حاسمة لتقييم موثوق لاستهلاك الأكسجين الميتوكوندريا.
ركائز التالية المستخدمة أثناء التجارب توفير الإلكترونات ubiquinone ويسمح بزيادة تدفق الإلكترونات في ETS. برولين من الأحماض الأمينية التي يمكن استخدامها كالركيزة الطاقة لا سيما في23من الحشرات، ولكن أيضا في الثدييات أثناء المجاعة الحادة أو الحالات المرضية37. إضافة برولين في الدوائر يسمح بتقييم إسهام نازعة برولين (ProDH) لتدفق الإلكترونات في ETS، عندما تتدفق من كل مجمع و ProDH الإلكترونات وهي المشاركة في عملية أوكسفوس (CI + ProDH-أوكسفوس). مع إضافة سوكسيناتي، ويمكن ملاحظة مساهمة الثاني المعقدة (نازعة succinate) إلى ETS (CI + ProDH + الاتحاد-أوكسفوس). حقن والغليسيرول-3-الفوسفات (G3P)، يزيد استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا كما تحفز هذه الركيزة نازعة والغليسيرول-3-فوسفات الميتوكوندريا (G3PDH) التي جزء من المكوك جليسيروفوسفاتي ونقل الإلكترونات في ETS (CI + ProDH + الاتحاد + G3PDH-أوكسفوس). كل ProDH و G3PDH أظهرت أن تكون ناشطة في عدة أنواع من الحشرات، وبالتالي فهي هامة في هذا البروتوكول مع المورفولوجية20،21،،من2223،32 .
عندما يتم الحصول على أونكوبلير يتم إضافة فككب، التنفس غير مقترنة (ETS الدولة)، أي، استهلاك الأكسجين الأقصى تمثل القدرة القصوى من ETS (CI + ProDH + الاتحاد + G3P-ETS). فككب هو بروتونوفوري الذي ينقل البروتونات من الفضاء intermembrane إلى المصفوفة المتقدرية دون المرور عبر الخامس المعقدة. وقد فككب أن عناية معاير، تركيزات أدناه النتيجة المثلى في استهلاك الأكسجين الأعلى غير ومعدلات التنفس غير مستقرة بينما التركيزات أعلاه النتيجة المثلى في تثبيط استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا (الشكل 5). حالما تتم إضافة ركائز وأونكوبلير، تنفيذ تثبيط مجمعات الأول والثاني والثالث يمكن أن يكون التسلسل باستخدام والروتينون، ومالوناتي، وأنتيميسين، على التوالي. مع كل مثبط المستخدمة، يلاحظ انخفاض في استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا، حتى وصلت إلى أدنى استهلاك الأوكسجين بعد إضافة أنتيميسين أ المعدل الذي تم التوصل إليه بعد إضافة جميع الموانع هو استهلاك الأكسجين المتبقي30. أنه يمثل استهلاك الأكسجين بسبب التفاعلات الأكسدة غير المتقدرية مثل إنتاج الأنواع المتفاعلة و oxygenase ردود فعل على سبيل المثال، وقد ذلك طرح من جميع المعدلات الأخرى قياس.
تمبد هو الناقل إلكترون اصطناعي الذي يوفر الإلكترونات مباشرة إلى الرابع المعقدة، وتجاوز جميع المجمعات المنبع، السماح لقياس القدرة القصوى التنفس الرابع المعقدة. هذه الركيزة غير المعرضة ل autoxidation، حيث اسكوربات يجب أن يكون إضافة السابقة إلى تمبد الحد ولكن ليس تماما تجنب هذا أوتوكسيديشن. أزيد الصوديوم المانع "الرابع المعقدة" لتصحيح أوتوكسيديشن المتبقية من تمبد، إضافة إلى الدوائر وثم يتم تسجيل استهلاك الأكسجين لمدة 10-15 دقيقة. ولذلك يمثل استهلاك الأكسجين هذه الخلفية الكيميائية، أو بعبارة أخرى أوتوكسيداتيون من تمبد التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار في حساب القدرة القصوى التنفس الرابع المعقدة.
الشكل 1 . التمثيل التخطيطي المتقدرية الإلكترون النقل من نظام نقل الإلكترون والفسفره في الغشاء الداخلي المتقدرية. الأول: مجمع الأول؛ ثانيا: ثانيا المعقدة؛ ثالثا: الثالث المعقدة؛ رابعا: رابعا المعقدة؛ خامسا: ATP synthase؛ أسيتيل: أسيتيل مرافق إنزيم أ؛ C: سيت السيتوكروم ج؛ ﻫ–: الإلكترون؛ G3P: الجلسرين-3-فوسفات؛ G3PDH: المتقدرية والغليسيرول-3-الفوسفات نازعة؛ ح+: بروتون؛ PRODH: نازعة برولين؛ TCA: دورة حمض تريكاربوكسيليك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : آثار الممثل لتركيز الأكسجين الميتوكوندريا (تتبع الأزرق) واستهلاك (تتبع الحمراء) في ثوراكسيس بيرميبيليزيد المورفولوجية. يتم تمثيل كل حقن مع سهم يشير إلى المجمع حقن (Pyr: بيروفات؛ والقانون النموذجي للتحكيم: مالات؛ شرطة؛ C: سيت السيتوكروم ج؛ للمحترفين: برولين؛ سوكك: سوكسيناتي؛ G3P: الجلسرين-3-فوسفات؛ فككب: سيانيد الكربونيل 4-(تريفلوروميثوكسي) فينيلهيدرازوني؛ تعفن: والروتينون؛ مالو: مالوناتي؛ النمل ج أنتيميسين أ؛ تمبد: N, N, N '، N، p-ميثيل--فينيلينيدياميني؛ الرابطة: اسكوربات؛ ساز: أزيد الصوديوم). تتم الإشارة إليها كل معدل استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا على الرسم البياني، عندما استقر استهلاك الأكسجين (تتبع أحمر). السيتوكروم ج أثر يدل على سلامة الغشاء الميتوكوندريا الخارجي (انظر النص للحصول على التفاصيل). استهلاك الأكسجين المتبقي يمثل استهلاك الأكسجين بسبب ردود فعل الجانب الأكسدة في الخلايا وطرح جميع المعدلات الأخرى قياسها. الخلفية الكيميائية يدل على استهلاك الأكسجين فقط بسبب أوتوكسيداتيون تمبد، ويجب أن تؤخذ في الاعتبار لحساب قدرة التنفس القصوى رابعا المعقدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : آثار الممثل لصالح (الأحمر تتبع، الدائرة A) وعدم كفاية (تتبع الخضراء، الدائرة ب) الردود على إضافة ADP. التتبع الحمراء يناظر الغرفة A والتتبع الأخضر يتوافق مع الدائرة ب، خلال التجربة بنفسه. وحصل من ثوراكسيس بيرميبيليزيد على نحو كاف في حين تتبع الأخضر تم الحصول عليها بعد مفرطة تمزق الأنسجة أثناء بيرميبيليزيشن التتبع الحمراء. عندما تتم إضافة ADP، يتوقع زيادة في استهلاك الأكسجين، مثل التتبع الحمراء. وترد في الرسم البياني أوكسفوس اقتران نسب وتحسب ك CI-أوكسفوس/CI-تسرب. يشير إلى وجود مشكلة في اقتران المتقدرية بنسبة أقل من 6.0 في المورفولوجية ومميزة تدهور عينة أو خلل mitochondrial ممثلة بالتتبع الخضراء. Pyr: بيروفات؛ القانون النموذجي للتحكيم: مالات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : آثار الممثل لصالح (الأحمر تتبع، الدائرة A) وعدم كفاية (تتبع الخضراء، الدائرة ب) الاستجابة لإضافة الفسفرة جيم التتبع الحمراء يناظر الغرفة A والتتبع الأخضر يتوافق مع الدائرة ب، خلال التجربة بنفسه. تم الحصول على تتبع الأحمر من ثوراكسيس بيرميبيليزيد على نحو كاف والتعامل معها، بينما تتبع الأخضر تم الحصول عليها بعد أن كانت عمدا المجففة ثوراكسيس لمدة أطول على سطح ماص قبل وزنها. ج الفسفرة لا عادة يزيد استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا، كما رأينا في التتبع الحمراء، تدل على أن الغشاء الميتوكوندريا الخارجي غير سليمة. إذا كان بيد إضافة ج الفسفرة خارجية يزيد بشكل كبير استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا لأكثر من 15%، كما رأينا في التتبع الخضراء، وتقترح أن تلف الغشاء الميتوكوندريا الخارجي ومن ثم أن العينة المتدهورة، وينبغي أن تجاهل. Pyr: بيروفات؛ القانون النموذجي للتحكيم: مالات؛ جيم: سيت جيم الفسفرة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : آثار الممثل من تركيز الأكسجين الميتوكوندريا (تتبع الأزرق) والاستهلاك (تتبع أحمر) بعد معايرة فككب- حقن مختلفة من فككب بتركيزات عدة يجب أن تتم بعناية لتحديد استهلاك الأوكسجين القصوى الناجمة عن هذا أونكوبلير. لا تسمح بتقييم استهلاك الأوكسجين القصوى تركيزات غير كافية وتتسم بمعدلات التنفس غير مستقرة، بينما فككب الزائد يحول دون استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا. سهام الدلالة حقن مختلفة من فككب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : معدلات إمكانية تكرار نتائج استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا خلال تجربة نموذجية التي تم الحصول عليها باستخدام مختلف مجلسي (تتبع أحمر، الدائرة A؛ الأخضر التتبع، الدائرة ب) ريسبيروميتير. التتبع الحمراء يناظر الغرفة A والتتبع الأخضر يتوافق مع الدائرة ب، خلال نفس تجربة استخدام المورفولوجية من نفس الفئة العمرية والجنس والسلالة والتي أثيرت بشأن النظام الغذائي نفسه، فضلا عن بروتوكول وصف. كلا عينات تم تطبيع مع كتلة الأنسجة الجافة وزنه كما هو موضح في البروتوكول (0.53 و 0.66 ملغم للدوائر A و B، على التوالي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويرد في هذه الدراسة، طريقة لإعداد نموذج قبل قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في المورفولوجية. تم تطوير هذا الأسلوب للتغلب على المشاكل المختلفة المتعلقة بالبروتوكولات المتقدرية العزلة، لا سيما من حيث المدة وعدد الأفراد المطلوب باستخدام. بدلاً من العمل مع العزلة المتقدرية عادة ما تتطلب كمية كبيرة من الأنسجة التي تم الحصول عليها من عدد من الأفراد، يتم إجراء هذه التجربة على ألياف العضلات بيرميبيليزيد من ثوراكسيس المورفولوجية القليلة. في هذا البروتوكول، يلزم سوى ثلاثة أشخاص لعرض النتائج المثلى. ولذلك، الممكن قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في نقاط زمنية مختلفة كما أكثر قابلة للتحقيق لمزامنة مجموعة أصغر من الذباب وبعد في نفس الفئة العمرية ومن نفس الجنس.
أولاً، من المهم استخدام المورفولوجية من نفس العمر والجنس والسلالة وأثارت في نفس الشروط للحصول على تباين منخفض في النتائج (الشكل 6)، كما يمكن تغيير التنفس مع العمر ونوع الجنس والنمط الوراثي والنظام الغذائي للذباب. أن الخطوة الأكثر أهمية في تنفيذ هذا البروتوكول هو إجراء بيرميبيليزيشن ثوراكسيس. من المهم جداً المضي قدما بسرعة لتجنب تدهور الأنسجة، ومن المهم أيضا التأكد من أن ثوراكسيس هي بيرميبيليزيد جيدا للمعدلات القصوى لاستهلاك الأوكسجين. للتأكد من أن تم أداؤه بيرميبيليزيشن بشكل صحيح وأن يتم الحفاظ على سلامة الميتوكوندريا الهيكلية والوظيفية بعد بيرميبيليزيشن، أوكسفوس اقتران نسبة (CI-أوكسفوس/CI-تسرب، الشكل 3)، فضلا عن استجابة إلى السيتوكروم c (الشكل 4) تستخدم كضوابط الجودة. وهناك المقايضة تأخذ في الاعتبار بين العمل بسرعة، والتأكد من بيرميبيليزيشن يتم تنفيذها بشكل جيد. من المهم أيضا يعمل دائماً على الجليد عند التعامل مع ثوراكسيس تشريح. من الضروري للحصول على نتائج أكثر استنساخه (الشكل 6)، permeabilization متجانسة وممارسة هذه التقنية ليساعد بيرميبيليزيشن للتأكد من أن يتم تكرار نفس الحركات. خطوة حاسمة أخرى هي تحديد الوزن الجاف للعينة. وفي الواقع، بعد ثوراكسيس هي المحتضنة، هم جداً حساسة وهشة ومعرضة للتدهور. ولذلك، وبالمثل إلى بيرميبيليزيشن، الشروع بسرعة في تحديد الوزن الجاف المهم. من ناحية أخرى، من المهم تحديد الوزن بدقة النتائج تطبيع بكتلة الأنسجة. يمكن أيضا أن يكون الأمثل كمية ثوراكسيس المستخدمة. البروتوكول يمكن تكييفها لاستخدامها الصدر واحد في الدائرة35، ولكن على مستوى معين من قرار يمكن أن تضيع في قياس استهلاك الأوكسجين بقدر في تحديد الوزن الجاف. ويمكن زيادة كمية ثوراكسيس إذا لزم الأمر، ولكن من المهم أن نلاحظ أن الميتوكوندريا أكثر في العينة، أعلى استهلاك الأوكسجين والدوائر سيتعين لذلك تكون ريوكسيجيناتيد. هذا ريوكسيجينيشن يمكن أن يتم عن طريق فتح الدوائر وضخ الأكسجين، بل أنها سوف تزيد من احتمال إدراج فقاعات الهواء في قاعة. ولذلك، إذا كان ذلك ممكناً، في محاولة لتجنب الاضطرار إلى ريوكسيجيناتي الدوائر (باستثناء عندما القدرة القصوى التنفس الرابع المعقدة قد يتقرر). قبل تشغيل هذه التجارب، أيضا الاستغلال الأمثل لتركيزات الركيزة اللازمة لتحقيق أعلى معدل استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا دون مراعاة الآثار المثبطة بسبب تركيز مفرط. أيضا يجب على الدوائر ريسبيروميتير يكون تنظيفها تفاديا للتلوث المحتملة. من المهم أن تبدأ عملية التنظيف مع الماء ديستيلاتيد، ومن ثم الإيثانول 70% للتخلص من الملوثات البيولوجية المحتملة. بعد هذا، حضانة في الإيثانول المطلقة لمدة 10 دقائق يوصي بتجنب تلوث مثبطات مسعور. أخيرا، سوف تجنب التلوث المحتملة الشطف الدوائر بالماء ديستيلاتيد وملئها مع الإيثانول 70% حتى استخدام المقبل.
يمكن بسهولة تعديل البروتوكول لدراسة تأثير الأخرى ركائز أو مثبطات مختلفة. على سبيل المثال، هو بروتين مثيرة لاهتمام لدراسة الناقل بيروفات الميتوكوندريا (MPC). دور هذا البروتين هو النقل بيروفات ولدت في سيتوسول في مصفوفة المتقدرية. في الآونة الأخيرة، اقترح أن تلعب دوراً هاما في تحوير الأيض أثناء الحالات المرضية كما هو الحال خلال نوع 2 من داء السكري38. لدراسة تأثير البروتين MPC في الأيض المتقدرية، أنها مفيدة للبدء الحقن مع بيروفات فقط بدلاً من بيروفات ومآلات في نفس الوقت. وهكذا، أثر بيروفات هو درس بشكل مستقل من تأثير مالات، كما يتم حقن هذه الأخيرة لدعم دورة حمض تريكاربوكسيليك فقط والتأكد من أن المواد الوسيطة لا تنضب. من الممكن أيضا استخدام مثبطات MPC39 لتقييم إذا كان القيد من هذا الناقل بدلاً من أكسدة بيروفات الملاحظ. ثم، سيكون من الممكن لمراقبة تحول محتملة في مصدر الوقود المفضل للتنفس40. من الممكن أيضا لحذف بعض ركائز لتبسيط البروتوكول إذا لم تكن ذات الصلة للدراسة. على سبيل المثال، لدراسة خلل في المجمع أنا فقط، ليس اللازمة لاستخدام كافة ركائز المعروضة في هذا البروتوكول.
ويقدم هذا البروتوكول بعض القيود التي تحول من الشروط في فيفو . وتسجل قياسات استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا عندما يكون المتوسط التنفس فوق الهواء، التشبع، كما يتم حقن الأكسجين النقي للحيلولة دون الحد انتشار الأكسجين داخل الأنسجة30. وعلاوة على ذلك، يتم حقن تركيزات ركائز في الزائدة، التي لا تعكس الظروف في فيفو . من المهم أيضا أن نلاحظ أن العمر والجنس، والإجهاد والنظام الغذائي من المورفولوجية يمكن أن تؤثر على النتائج. هذه المعلمات يتم ذلك أن تؤخذ في الاعتبار عند تفسير النتائج. هذا الأسلوب هو الشروط ولكن أقرب إلى الفيزيولوجية من أساليب استخدام العزلة المتقدرية لقياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية، كالتفاعل مع المكونات الخلوية الأخرى والسلامة الهيكلية الميتوكوندريا و مورفولوجيا هي مصانة31. من المهم أن نلاحظ أن العزلة المتقدرية المعلمات أكثر فائدة عند إضافية مثل إنتاج روس أو كفاءة الميتوكوندريا (نسبة ف/س) يجب أن تكون مدروسة27.
يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحقيق أهداف مختلفة، تتراوح من فهم خلل mitochondrial والآليات الأساسية للأمراض الأيضية، لاختبار تأثيرات مركبات مختلفة على وظائف الميتوكوندريا تحت المرضية شروط. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامه لمراقبة آثار العديد من الضغوط البيئية على الأيض المتقدرية، مثل التغيرات في النظام الغذائي أو درجة الحرارة. على سبيل المثال، من الممكن لدراسة كفاءة النشطة بيولوجيا الجزيئات الاصطناعية على وظائف الميتوكوندريا وفي معالجة الاختلالات المتقدرية. هذا الأسلوب هو أيضا أداة جيدة لدراسة مهام المتقدرية في نقاط زمنية مختلفة، مما يجعلها ذات الصلة جداً لدراسة الآليات الأساسية التي تتصل بعملية الشيخوخة. تقييم المتقدرية الأيض عن طريق استهلاك الأكسجين باستخدام ثوراكسيس بيرميبيليزيد سوف يساعد بالتأكيد إلى تحسين معرفتنا حول دور الأيض المتقدرية عند تعرض الخلية لظروف صعبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذه الدراسة من المنح المقدمة من العلوم الوطنية ومجلس البحوث الهندسية (مقدمة، منحة الاكتشاف) وجامعة دو مونكتون أن أرستها. لهب يود أن ينوه دعم تمويلي من المعهد الكندي للبحوث الصحية (استوفوا)، ومؤسسة الابتكار نيو برونزويك (نبيف)، وجامعة دو مونكتون. أعمال EHC معتمد من قبل جمعية الزهايمر لكندا، كندا الدماغ، مقدمة، والمؤسسة الكندية لسرطان الثدي، ومؤسسة الابتكار في نيو برونزويك، مؤسسة البحوث الصحية في نيو برونزويك وجامعة دو مونكتون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Fine-tipped antimagnetic forceps | VWR | 82027-400 | |
| Secura225D-1S-DQE | Sartorius AG, Goettingen, Germany | Semi-micro balance (distributed by several companies) |
|
| Drosophila melanogaster wild-type w1118 | Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA | Storage Condition: 24 °C |
|
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA Storage Condition: RT |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | Storage Condition: RT |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Storage Condition: -20 °C |
| MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | Storage Condition: RT |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Storage Condition: RT |
| Na2Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | Storage Condition: -20 °C |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | Storage Condition: RT |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Storage Condition: 2-8 °C |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | Storage Condition: RT |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 | Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily. |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Storage Condition: RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | Storage Condition: RT |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Storage Condition: RT |
| BSA | Sigma-Aldrich | 05470 | Storage Condition: 2-8 °C |
| Na2S2O4 | Sigma-Aldrich | 157953 | Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily. |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C. |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A5285 | ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C. |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C. |
| sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt | Sigma-Aldrich | G7886 | Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C. |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C. |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C. |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily. |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C. |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
References
- Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
- Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).
- Dobzhansky, T., Wright, S. Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura. Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).
- Zipursky, S. L., Rubin, G. M. Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).
- Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease. The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).
- Blandini, F., Armentero, M. T. Animal models of Parkinson's disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
- Baker, K. D., Thummel, C. S. Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila. Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).
- Morris, S. N. S., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).
- Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).
- Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T.
- Szibor, M., Holtz, J.
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. Mitochondrial biogenesis and healthy aging. Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).
- Muoio, D. M. Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock. Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).
- Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M.
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).
- McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. "Alternative" fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).
- Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production. PLOS ONE. 10 (3), e0120600 (2015).
- Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor. Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).
- Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333 (2016).
- Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster. The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).
- Miwa, S., Brand, M. D. The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).
- Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).
- Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria. Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).
- Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males. Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).
- Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies. Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways. Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).
- Bender, T., Martinou, J. C. The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- McCommis, K., et al. An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion. Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).
