Summary
Здесь мы используем двумерных полу денатурируя геля агарозы для подтверждения наличия волокон амилоида как гетерогенной размера и исключить возможность того, что размер неоднородность является диссоциации волокон амилоида при гель Запуск процесса.
Abstract
Амилоида или амилоид как волокна были связаны с многих заболеваний человека и теперь обнаруживаются имеет важное значение для многих сигнальных путей. Способность легко обнаруживать формирования этих волокон различных экспериментальных условиях существенно важное значение для понимания их потенциальные функции. Многие методы были использованы для обнаружения волокна, но не без некоторых недостатков. К примеру электронной микроскопии (EM), или окрашивание с Конго красный или Тиофлавин Т часто требует очистки волокон. С другой стороны, полу денатурируя стиральный порошок очки геля агарозы (SDD-возраст) позволяет обнаруживать SDS-устойчивостью волокон амилоида как в клеточных экстрактов без очистки. Кроме того он позволяет Сравнение размера разницы волокон. Что еще более важно она может использоваться для выявления специфических белков внутри волокон, Западный blotting. Это менее затратным по времени и более доступными для более широкого числа лабораторий. SDD-возраст результаты часто показывают переменной степени неоднородности. Это поднимает вопрос, ли частью неоднородность результатов от диссоциация комплекса во время электрофорез SDS в присутствии белка. По этой причине мы использовали второй аспект SDD-возраста, чтобы определить размер неоднородность, видели в SDD-возраст действительно результат волокна гетерогенность в естественных условиях и не в результате деградации или диссоциации некоторых белков во время электрофорез. Этот метод позволяет быстрый, качественный подтверждение, что волокон амилоида или амилоид как не отделения частично во время процесса SDD-возраста.
Introduction
Формировании амилоидных волокон благодаря сворачиванию белков уже давно известен играть определенную роль в патологических условиях, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона1. Совсем недавно формирования волокон амилоида или амилоид как было показано, быть частью сигнальных путей в организме человека, в том числе во время анти-вирусные врожденный иммунный ответ2 и necroptosis3,4и в нижней организмов такие дрожжи5,6. Таким образом способность обнаруживать эти волокна в лаборатории имеет важное значение. В настоящее время, существует три основных способа для обнаружения амилоид и волокон амилоида как: использование красителей, EM и SDD-возраста.
Использование красителей, таких как красный Конго или Тиофлавин Т, предлагает преимущество быстро и легко обнаружить с помощью микроскопии и спектроскопии7. Однако обнаружение по микроскопии, в случае Конго красный, обеспечивает не специфика, о котором белки составляют волокна, или размер волокон. Аналогично использование спектроскопии для обнаружения Конго красный или Тиофлавин Т привязки белковых комплексов обеспечивает только положительный или отрицательный результат.
ЕТ предоставляет убедительные доказательства наличия волокон, а также количественной информации о волокна длиной и диаметром8. Однако этот метод требует очень строгие очистки. Кроме того EM-это специализированная техника, которая использует дорогостоящего оборудования.
SDD-возраст был использован для обнаружения SDS-устойчивостью мега Далтон белковых комплексов, включая амилоида или амилоид как волокна. Она имеет много преимуществ. Во-первых он не требует очистки волокон и легко peform9. Во-вторых она обеспечивает качественную информацию о размере волокон, включая относительный размер и количество волокна heterogenicity. И наконец потому что Западный blotting может выполняться после электрофореза, это легко обнаружить присутствие любого белка, для которого есть антитела, хотя следует отметить, что потому что SDD-возраст полу денатурируя, некоторые epitopes могут оставаться скрытым который усложняет обнаружение антителом.
Недавно формы волокон амилоида поступало рецептор взаимодействующих киназу 1 (RIPK1) и 3 (RIPK3) в качестве сигнализации платформ во время necroptosis, форму запрограммированного некроза3. Изучая эти волокна, наши лаборатории показали, что другой necroptosis связанные белком, смешанные линии киназы домена как (MLKL), также формируется амилоид как волокна4. Однако после осмотра с SDD-возраст, размер MLKL волокон появился отличаются от RIPK1 и RIPK3 волокон, которые появились идентичны друг к другу (рис. 1). Это было неожиданным, потому что хорошо известно, что MLKL привязан к RIPK1/RIPK3, сформировать necroptosis сигнализации комплекс под названием necrosome10.
Существует по крайней мере два объяснения. Во-первых два совершенно различных волокон амилоида как может образоваться во время necroptosis, один содержащие RIPK1/RIPK3 и других содержащих MLKL. Во-вторых только один тип волокон амилоида как, содержащие RIPK1/RIPK3/MLKL может образовываться при necroptosis, но Ассоциация MLKL с другими белками является достаточно слабый, которые он разъединяет эпоху SDD.
Для решения этой проблемы, мы предлагаем выполнение двухмерный (2D) SDD-возраст. Амилоид SDD-возраст stable или волокон амилоида как будут иметь один и тот же шаблон миграции во время первой и второй аспект электрофореза. Это будет обнаружить после передачи белки мембраны и проведении западную помарку. Стабильные волокна представят резкий диагональной последовательности. Любое отклонение от этого хотел бы предложить, что волокна претерпевают изменения вследствие SDS-электрофорез.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка образцов
- Амилоид6 культура 2 x 10, производящ клетки рака толстой кишки HT-29 в 10 см ткани культуры блюдо в 10 мл из Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) содержащий 10% плода бычьим сывороточным и пенициллина и стрептомицина. Культура клетки ночь в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2.
- После того, как клетки растут до 80% confluency, вымойте клетки с 10 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS). Добавить 3 мл раствора трипсина и инкубировать при 37 ° C на 3 мин.
- После того, как клетки полностью диссоциированных от блюдо, добавляют 10 мл питательной среды и передаче клетки с пипеткой 10 мл 15 мл Конические трубки. Центрифуга клетки на 1000 g x 3 мин при комнатной температуре. Аспирационная среды, Ресуспензируйте клетки в 5 мл питательной среды и подсчитать ячейки, используя счетчик соматических клеток. Пластина 2 х 106 клеток в каждом из двух блюд 10-см.
- Позволяют клеткам присоединиться и восстановить всю ночь в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2. Применить лечение к одно блюдо, чтобы вызвать образование Амилоиды с 20 нг/мл фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), 100 Нм Смак подражательный и 20 мкм Пан caspase ингибитор Z-Вад-FMK11. Сочетание сокращенно ВЗБ. Лечить другие блюдо с транспортного средства, как элемент управления.
- После соответствующей продолжительности времени обычно 6 h, урожай lysate клетки.
- Скрип клетки от пластины с пластиковый скребок и для передачи в 15 мл Конические трубки используйте пипетки 10-мл. Центрифуга клетки на 1000 g x 3 мин при 4 ° C.
- Вымыть клетки 2 раза resuspending в 10 мл холодного льда PBS и центрифугирование в 1000 g x 3 мин при 4 ° C. Аспирационная PBS решения.
Примечание: Этот процесс может быть приостановлена здесь путем замораживания Пелле клеток в жидком азоте и хранения в ˗80 ° C сроком до 1 месяца. - Передача ячейки Пелле microcentrifuge 1,5 мл пробирку и инкубировать в 0,3 мл буфера lysis для 30 мин на льду. Центрифуга на 20000 x g 15 мин при 4 ° C. Супернатант является весь lysate клетки.
Примечание: Этот процесс может быть приостановлена здесь, сохраняя образца при-20 ° C до нескольких месяцев. - Измерьте концентрацию белка assay Брадфорд согласно протоколу от производителя. Добавьте 4 x SDD-возраст загрузки буфера подготовить 20 мкл 3 мкг/мкл пример и инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.
2. подготовить и запустить гели
- Добавьте 2 g агарозы в 200 мл буфера Tris ацетат 1 x (ТЭ) в стеклянный стакан и тепла в микроволновую печь для плавления агарозы. Добавьте 1 мл 20% SDS для конечной концентрации 0,1% SDS. Тщательно взболтать. Старайтесь не создавать пузыри после добавления SDS.
- Залейте раствор агарозы в slab гель 15 x 14 см. Используйте 1-ОД пипетки для устранения любые пузыри. Поместите один 20-ну гребень на вершине.
- Первый аспект: Пипетки 60 мкг клеточных lysate в полосу ультраправых. Побегите гель на 60 V для около 4 часов (до тех пор, пока краска фронт является около ¾ через гель) с использованием ТЭ, содержащие 0,1% SDS как идущий буфер.
- Второй аспект: тщательно поворота 90° по часовой стрелке (рисA) гель. Побегите гель на 60 V для приблизительно 4 ч.
Примечание: Общее состояние работает-4 V/см Длина гель. Важно, что выполнение условия одинаковы для первого и второго измерения.
3. Передача прав
- Используйте метод капиллярного передачи для передачи белки винилидена фторид (PVDF) мембраны (рис. 2B).
- Добавьте 500 мл буфера передачи примерно на 20 см х 20 см контейнера. Сделайте 5-cm высокий стек бумажных полотенец рядом с контейнером. Площадь поверхности в верхней части стека должна быть больше, чем размеры гель.
- Замочите фильтр бумага 14 x 15 см в буфер передачи и место на вершине стека бумажных полотенец. Позаботьтесь, чтобы разместить на бумаге без морщин и пузырей. Повторите с другой кусок фильтровальной бумаги.
- Активировать 14 см х 15 см PVDF мембрану в метаноле 30 s затем слоя на фильтровальной бумаге, заботясь, чтобы использовать валик, чтобы удалить все пузырьки. Промойте гель с передачи буфера и слой поверх мембраны, снова выкатывания любые пузыри.
- Обложка край полотенца бумажные, ближайший к контейнеру передачи буфера с пластиковой пленкой. Важно, что бумага мост, построенный на следующем шаге не вступают в непосредственный контакт с стопку бумаги полотенце.
- Пропитать кусок фильтровальной бумаги 15 см x 35 см в буфер передачи и поместите его так, что один конец закрывает всю верхнюю часть геля и на другом конце находится в контейнере передачи буфера. Повторите с другой мост.
- Покрыть контейнер с полиэтиленовой пленкой и оставить на ночь при комнатной температуре.
4. западный Blotting обнаружения
- Промойте мембрану с 50 мл PBS, содержащие 0,05% Tween-20 (PBST) в контейнере 20 × 20 см. Добавьте 20 мл 5% молока в PBST. Рок при комнатной температуре за 30 минут, чтобы заблокировать.
- Пипетка 10 мкл антител анти MLKL кролика в 20 мл 5% молока в PBST и добавить в контейнер. Инкубируйте на рокер на ночь при 4 ° C.
- Вымойте мембраны в 20 мл PBST для 5 минут Повторите 5 раз.
- Пипетка 4 мкл анти-rabbit-ПХ в 20 мл 5% молока в PBST и добавить в контейнер. Инкубируйте на рокер при комнатной температуре в течение 2 ч.
- Вымойте мембраны в 20 мл PBST для 5 минут Повторите 5 раз.
- Добавьте увеличенная хемолюминесценция субстрата (ЭСЛ) и подвергать рентгеновских снимков, по словам производителя протокол.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После индукции necroptosis RIPK1 и RIPK3 показали практически идентичны амилоид подобных моделей (дорожки 2 и 4, рис. 1). Однако MLKL волокон более неоднородны и, казалось, быть меньше чем RIPK1/RIPK3 волокна (переулок 6, рис. 1). Это побудило нас к разработке метода 2D SDD-возраст для устранения возможности MLKL формы RIPK1/RIPK3-независимые волокон или MLKL просто отделяет от крупных волокон RIPK1/RIPK3/MLKL эпоху SDD.
Общая схема процедуры электрофореза и передачи показано на рисунке 2. Во время первого измерения SDD-возраст волокон амилоида или амилоид как будет демонстрировать характерные мазок, как показано на рисунке 3A. После выполнения второго измерения SDD-возраст, есть два возможных исхода. В случае не деградации или диссоциации во время запуска процесса гель волокна перенесет одинаково во время второго выполнения, как они это делали в первом запуске. В этом случае западную помарку представят диагональной последовательности на мембране под углом в 45°, как показано на рисунке 3B. Если волокна отмежеваться во время процесса SDD-возраст, меньше волокон перенесет быстрее во время второго электрофореза. В этом случае западную помарку представят вертикальных полос ниже диагональной линии, как показано на рис. 3C.
В случае MLKL волокон, видели во время necroptosis они показывают характерную мазок во время первого измерения SDD-возраст (рис. 4A). Когда те же волокна были подвергнуты 2D SDD-возраст, они выставлены резкий диагональной линии с не вертикальных полос (Рисунок 4B). С этого доказательства был сделан вывод, что MLKL не было отделения из волокон во время процесса SDD-возраст и что действительно отличаются от волокна RIPK1/RIPK3 MLKL-содержащих волокна, показан на рисунке 1 . Кроме того когда RIPK3 было, иммуно истощены от lysates клетки, MLKL волокна остаются нетронутыми4, подтверждающий, что MLKL волокна и RIPK1/RIPK3 волокна являются действительно отдельными образованиями.
Рисунок 1 . Экспертиза волокон амилоида как во время necroptosis. Весь lysates клетки были собрано из клетки проходят TNF-индуцированной necroptosis и подвергается SDD-возраста. Западных помарках были выполнены RIPK1, RIPK3 и MLKL. MLKL-содержащие волокна выставлены шаблон собственный миграции от RIPK1/RIPK3-содержащих волокна. MLKL мономеров едва видна под это условие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Экспериментальный протокол. (A) схема двумерных полу денатурируя стирального геля агарозы (2D SDD-возраст). Начните с загрузки образца в правой полосе большинство, помечены красным цветом. После окончания первого измерения потока поверните гель 90° по часовой стрелке. Запуск второй аспект электрофореза. Твердых стрелка указывает направление первого измерения запуска, пунктирная стрелка указывает направление выполнения второго измерения. (B) схемы передачи капиллярных действий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Возможные результаты. Шаблон (A) ожидаемых миграции волокон амилоида или амилоид как после первого измерения SDD-возраста. Твердых стрелка указывает направление миграции. (B) ожидаемых миграции шаблон SDD-возраст stable (без деградации или диссоциации) амилоид или волокон амилоида как после 2D SDD-возраста. Твердых стрелка указывает направление первого измерения SDD-возраст. Пунктирная стрелка указывает направление второго измерения SDD-возраст. (C) ожидаемый миграции структура амилоида SDD-возраст нестабильным или волокон амилоида как. Твердых стрелка указывает направление первого измерения SDD-возраст. Пунктирная стрелка указывает направление второго измерения SDD-возраст. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Миграция MLKL-содержащих волокна во время 1D и 2D SDD-AGE. (A) весь lysates клетки были собраны из клеток стимулируется с ВЗБ пройти necroptosis. Лизатов были подвергнуты SDD-возраст, и Западная помарка была выполнена MLKL. Наблюдалось характерной мазка. Весь lysates клетки (B) были собраны из клеток стимулируется с ВЗБ пройти necroptosis. Лизатов были подвергнуты 2D SDD-возраст и Западная помарка была выполнена MLKL. Было отмечено резкое линии под углом 45°, указав, что волокна не проходят диссоциации эпоху SDD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важным аспектом SDD эпохи-2D является, что электрофорез условия одинаковы для первого и второго измерения. Способность обнаруживать, что резкий диагональной линии под углом 45 ° (показывая, что произошла не диссоциации или деградации) зависит от волокна, миграции идентичным образом во время оба электрофореза. С помощью различных условий, например изменение напряжения или длина время выполнения, скроет эти результаты. Кроме того как в случае традиционных 1D SDD-возраст, кипения образца следует избегать, как это будет нарушать амилоид и амилоид как волокна. Как и в случае всех переводов, следует позаботиться чтобы избежать пузырей между слоями фильтровальная бумага, мембраны и гель. Наконец на этапе передачи, важно, что мост не спада и напрямую связаться с стопку бумаги полотенце. Надежный способ избежать этого заключается в использовании небольшой кусок полиэтиленовой пленкой для покрытия края бумажные полотенца.
Выполнения условий, предусмотренных в протоколе (60 V за 4 ч) может быть скорректирована. Например в этом протоколе, геля агарозы был 14 см х 15 см. Если используется меньше гель, напряжение (4 V/см Длина гель) и во время выполнения должна быть скорректирована пропорционально. Два образца могут быть проанализированы сразу с помощью двух Расчески, при подготовке геля. Образцы должны быть загружены в правом наиболее хорошо для каждого гребня. В этом случае время выполнения снова быть укорочены, чтобы верхний пример не будет работать в нижней половине геля. Если время корректируется для одного измерения геля, важно, что другое измерение корректируется для соответствия.
В отличие от SDS-PAGE 1 D и 2D SDD-возраст полу денатурируя. Потому что волокна остаются неповрежденными, некоторые epitopes могут остаются недоступными. Это может ограничить определение некоторых антителами. 2D SDD-возраст ограничен в его способность определить точный размер волокон амилоида или амилоид как. Однако может производиться сравнение относительных размеров.
Все комплексы протеина подвергаются деградации эпоху SDD или диссоциации, и поэтому качественные результаты могут быть трудно интерпретировать. Использование 2D SDD-возраст позволяет подтверждение того, что размер неоднородность видели во время SDD-возраст не является диссоциации SDS-зависимых во время электрофореза. 2D SDD-возраста целесообразно использовать в любом контексте, где используется традиционный 1 D SDD-возраст. 2D SDD-возраст особенно полезен, когда размер неоднородность наблюдается в 1 D SDD-AGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается стипендий для с.х.-A. из низ/NCATS (TL1TR001104) Фонд Уэлч Грант (I-1827), и R01 грант от NIGMS (RGM120502A) к Z.W. Z.W. — Вирджиния Мерчисон Linthicum ученый в медицинских исследований и профилактики рака и исследований Института Техас ученый (R1222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
- Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
- Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Methods in Enzymology. 412, Academic Press. 33-48 (2006).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
