Summary
Her bruger vi to-dimensionelle semi-denaturering Agarosen gelelektroforese at bekræfte tilstedeværelsen af amyloid-lignende fibre af heterogene størrelse og udelukke muligheden for, at størrelse heterogenitet skyldes dissociation af amyloid fibre under gel kørende proces.
Abstract
Amyloid eller amyloid-lignende fibre har været forbundet med mange menneskelige sygdomme, og nu bliver opdaget at være vigtig for mange signaling veje. Evnen til at let påvise dannelsen af disse fibre under forskellige forsøgsbetingelser er afgørende for at forstå deres potentielle funktion. Mange metoder har været anvendt til at opdage fibre, men ikke uden ulemper. For eksempel, kræver elektronmikroskopi (EM) eller farvning med Congo rød eller Thioflavin T ofte rensning af fibrene. På den anden side tillader semi-denaturering vaskemiddel Agarosen gelelektroforese (SDD-alder) detektering af SDS-resistente amyloid-lignende fibre i celle ekstrakter uden rensning. Desuden, det giver mulighed for sammenligning af størrelse forskellen af fibre. Vigtigere er, kan det bruges til at identificere specifikke proteiner i fibrene af Western blotting. Det er mindre tidskrævende og mere let tilgængelige for en bredere række labs. SDD-alder resultater viser ofte variable graden af heterogenitet. Det rejser spørgsmålet om en del af heterogenitet resultater fra dissociation af protein kompleks under elektroforese i overværelse af SDS. Derfor har vi ansat en anden dimension af SDD-alder til at bestemme, hvis størrelse heterogenitet set i SDD-alder er virkelig et resultat af fiber heterogenitet i vivo og ikke et resultat af enten nedbrydning eller dissociation af nogle af proteinerne under elektroforese. Denne metode giver mulighed for hurtig, kvalitativ bekræftelse af, at den amyloid eller amyloid-lignende fibre ikke delvis adskilles under SDD-alder-processen.
Introduction
Dannelsen af amyloid fibre på grund af protein misfoldning har længe været kendt at spille en rolle i patologiske tilstande som Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom og Huntingtons sygdom1. Senere, dannelsen af amyloid eller amyloid-lignende fibre har vist sig at være en del af signaling veje hos mennesker, herunder under anti-viral medfødte immunrespons2 og necroptosis3,4, og i lavere organismer som gær5,6. Derfor, evnen til at opdage disse fibre i laboratoriet er vigtigt. I øjeblikket, er der tre måder at opdage amyloid og amyloid-lignende fibre: brugen af farvestoffer, EM og SDD-alder.
Brugen af farvestoffer, som Congo rød eller Thioflavin T, tilbyder fordelen at være hurtig og let kan påvises ved hjælp af enten mikroskopi eller spektroskopi7. Påvisning af mikroskopi, i tilfælde af Congo rød, giver imidlertid ingen specificitet som proteiner består af fibrene, eller størrelsen af fibrene. Ligeledes giver brugen af spektroskopi til at opdage Congo rød eller Thioflavin T binding til proteinkomplekser kun et positivt eller negativt resultat.
EM giver afgørende beviser for tilstedeværelsen af fibre og ligeledes kvantitative oplysninger om fiber længde og diameter8. Denne metode kræver imidlertid meget strenge rensning. Derudover er EM en specialiseret teknik, der bruger dyrt udstyr.
SDD-alder er blevet brugt til at registrere SDS-resistente mega Dalton proteinkomplekser herunder amyloid eller amyloid-lignende fibre. Det giver mange fordele. Først, det kræver ikke rensning af fibre og er let at peform9. For det andet giver det kvalitative oplysninger om størrelsen af de fibre, herunder relative størrelse og mængde af fiber heterogenicity. Endelig fordi Western blotting kan udføres efter elektroforese, er det let at påvise tilstedeværelsen af et protein, der er et antistof, selvom det skal bemærkes, at fordi SDD-alder er semi-denaturering, nogle epitoper kan forblive skjult som komplicerer påvisning af antistof.
For nylig, receptor interagerende protein kinase 1 (RIPK1) og 3 (RIPK3) er blevet rapporteret til form amyloid fibre til at tjene som signalering platforme under necroptosis, en programmeret form af nekrose3. Mens de studerer disse fibre, viste vores lab, at en anden necroptosis-forbundet protein, blandet lineage kinase domæne-lignende (MLKL), også dannet amyloid-lignende fibre4. Men efter undersøgelse med SDD-alder, størrelsen af MLKL fibrene syntes adskiller sig fra den RIPK1 og RIPK3 fibre, der syntes identisk med hinanden (figur 1). Dette var uventet, fordi det er velkendt, at MLKL binder sig til RIPK1/RIPK3 til at danne den necroptosis signalering komplekse kaldet necrosome10.
Der er mindst to forklaringer. Første to helt adskilte amyloid-lignende fibre kan danne under necroptosis, en indeholdende RIPK1/RIPK3 og de andre indeholder MLKL. For det andet er kun én type af amyloid-lignende fibre indeholdende RIPK1/RIPK3/MLKL kan dannes under necroptosis, men sammenslutningen af MLKL med de andre proteiner svage nok, som det tager under SDD-alder.
For at løse dette, foreslår vi udfører et todimensionelt (2D) SDD-alder. SDD-alder-stabil amyloid eller amyloid-lignende fibre vil have den samme migration mønster under første og anden dimension elektroforese. Dette vil kunne påvises efter overførsel af proteiner på en membran og udfører en vestlige skamplet. Stabil fibre vil udstille en skarp diagonal mønster. Enhver afvigelse fra dette tyder på, at fibrene undergå ændringer som følge af SDS-elektroforese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberede prøverne
- Kultur 2 x 106 amyloid producerer HT-29 tyktarmskræft celler i en 10-cm vævskultur parabol i 10 mL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) som indeholder 10% føtal bovint serum og penicillin-streptomycin. Kultur celler natten over i et 37 ° C kuvøse med 5% CO2.
- Efter cellerne vokser til 80% confluency, vaske cellerne med 10 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Tilsættes 3 mL Trypsin og inkuberes ved 37 ° C i 3 min.
- Når cellerne er helt adskilt fra fadet, der tilsættes 10 mL af næringssubstratet og overføre celler med en 10-mL pipette til en 15 mL konisk slange. Der centrifugeres celler ved 1.000 x g i 3 min ved stuetemperatur. Opsug mediet, resuspend celler i 5 mL af næringssubstratet og tælle de celler ved hjælp af en celle counter. Plade 2 x 106 celler i hver af to 10-cm retter.
- Tillad cellerne til at overholde og genoprette natten over i et 37 ° C kuvøse med 5% CO2. Gælde behandling for en parabol til at inducere dannelse af amyloids med 20 ng/mL Tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α), 100 nM Smac-mimetiske, og 20 µM pan-caspase hæmmer Z-VAD-FMK11. Kombinationen er forkortet TSZ. Behandle andre fadet med køretøjet som en kontrol.
- Efter i passende længde af tid, normalt 6 h, høste cellen lysate.
- Skrab celler fra pladen med en plastik skraber og bruge en 10-mL pipette til at overføre til en 15 mL konisk slange. Centrifugeres celler ved 1.000 x g i 3 min. ved 4 ° C.
- Cellerne vaskes 2 gange af resuspending i 10 mL af is kold PBS og centrifugering ved 1.000 x g i 3 min. ved 4 ° C. Opsug PBS løsning.
Bemærk: Processen kan være standset her ved frysning celle pellet i flydende nitrogen og lagring ved ˗80 ° C i op til 1 måned. - Overføre celle pellet til en 1,5 mL microcentrifuge tube og Inkuber i 0,3 mL af lysisbuffer for 30 min på is. Der centrifugeres ved 20.000 x g i 15 min. ved 4 ° C. Supernatanten er hele cellen lysate.
Bemærk: Processen kan være standset her ved at gemme prøven ved-20 ° C i op til flere måneder. - Måle proteinkoncentration af Bradford assay efter producentens protokol. Tilføj 4 x SDD-alder loading bufferen at forberede 20 µL af 3 µg/µL prøve og inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
2. forberede og køre geler
- Tilsættes 2 g Agarosen til 200 mL 1 x Tris-acetat buffer (TAE) i et glas bægerglas og varme i en mikrobølgeovn til at smelte agarosegelelektroforese. Der tilsættes 1 mL af 20% SDS til en endelig koncentration på 0,1% SDS. Omhyggeligt swirl for at blande. Passe på ikke for at generere bobler efter SDS tilsætning.
- Hæld Agarosen løsning i et 15 cm x 14 cm gel slab. Brug 1 mL pipette til at fjerne eventuelle bobler. Placer en 20-godt kam øverst.
- Første dimension: Pipette 60 µg af hele cellen lysate i den yderste højre vognbane. Kør gelen på 60 V for omkring 4 h (indtil farvestof front er ca ¾ gennem gel) ved hjælp af TAE der indeholder 0,1% SDS som kører bufferen.
- Anden dimension: omhyggeligt rotere gel 90° mod uret (figur 2A). Kør gelen på 60 V for omkring 4 timer.
Bemærk: Den kører almentilstand er 4 V/cm gel længde. Det er vigtigt, at de kørende betingelser er præcis den samme for de første og anden dimensioner.
3. overførsel
- Bruge overførselsmetoden kapillær til at overføre proteinerne til en polyvinylidene xenondifluorid (PVDF) membran (figur 2B).
- Der tilsættes 500 mL overførsel buffer til en ca 20 cm x 20 cm container. Gøre en 5-cm høj stak papir håndklæder ved siden af containeren. Areal på toppen af stakken skal være større end gel dimensioner.
- Sættetid en 14 cm x 15 cm filterpapir i overførsel buffer og sted på toppen af håndklæde papirstakken. Sørge for at placere på papir uden rynker eller bobler. Gentag med endnu et stykke filtrerpapir.
- Aktivere en 14 cm x 15 cm PVDF membran i methanol til 30 s derefter lag det på filtrerpapir pasning til at bruge en rulle til at fjerne alle bobler. Skyl gel med overførsel buffer og lag det oven på membranen, igen rullende ud nogen bobler.
- Dække kanten af papirhåndklæder tættest på beholderen for overførsel buffer med plastfolie. Det er vigtigt at papir bro bygget i det næste trin ikke kommer i direkte kontakt med håndklæde papirstakken.
- Soak et stykke af 15 cm x 35 cm filterpapir i overførsel buffer og placere det så ene ende dækker toppen af gelen og anden enden er i beholderen for overførsel buffer. Gentag med en anden bro.
- Dække beholderen med plastfolie og lad natten ved stuetemperatur.
4. Western Blotting påvisning
- Skyl membran med 50 mL PBS, som indeholder 0,05% Tween-20 (PBST) i en beholder, 20 cm × 20 cm. Der tilsættes 20 mL 5% mælk i PBST. Rock ved stuetemperatur i 30 min til at blokere.
- Tilsæt 10 µL af kanin anti-MLKL antistoffer i 20 mL 5% mælk i PBST og tilføje til objektbeholderen. Ruger på rocker natten over ved 4 ° C.
- Vask membranen i 20 mL af PBST for 5 min. Gentag 5 gange.
- Tilsæt 4 µL af anti-rabbit-HRP til 20 mL 5% mælk i PBST og tilføje til objektbeholderen. Ruger på rocker ved stuetemperatur i 2 timer.
- Vask membranen i 20 mL af PBST for 5 min. Gentag 5 gange.
- Tilføj forbedret kemiluminescens substrat (ECL) og udsætte for X-ray film efter producentens protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter necroptosis induktion viste RIPK1 og RIPK3 næsten identisk amyloid-lignende mønstre (baner 2 og 4, figur 1). Dog MLKL fibre blev mere heterogene og syntes at være mindre end RIPK1/RIPK3 fibre (lane 6, figur 1). Der foranledigede os til at udvikle metoden 2D SDD-alder for at behandle muligheden om MLKL danner RIPK1/RIPK3-uafhængige fibre eller MLKL blot tager fra de store RIPK1/RIPK3/MLKL fibre under SDD-alder.
En generel skematisk af proceduren elektroforese og overførsel er vist i figur 2. Under den første dimension SDD-alder, vil amyloid eller amyloid-lignende fibre udstille en karakteristisk smøre, som det ses i fig. 3A. På løb den anden dimension SDD-alder, er der to mulige udfald. Ingen nedbrydning eller dissociation under gel kører processen, vil fibrene overflytte ens under andet run som de gjorde i det første løb. I dette tilfælde vil en vestlige skamplet udstille en diagonal mønster på membranen i en 45° vinkel som det ses i figur 3B. Hvis fibrene tage afstand under SDD-alder-processen, vil den mindre fibre overflytte hurtigere under den anden elektroforese. I dette tilfælde vil en vestlige skamplet udstille lodrette striber diagonal linje, som vist i figur 3C.
For de MLKL fibre set under necroptosis, viser de de karakteristiske smøre under den første dimension SDD-alder (figur 4A). Når de samme fibre blev udsat for 2D SDD-alder, udstillet de en skarp diagonal linje med lodrette striber (fig. 4B). Med dette bevis konkluderedes det, at MLKL ikke adskilles fra fibrene under SDD-alder-processen, og at MLKL-holdige fibrene ses i figur 1 var faktisk adskiller sig fra RIPK1/RIPK3 fibrene. Desuden, når RIPK3 var immuno-forarmet fra cellelysater, MLKL fibre forblev intakt4, bekræfter, at MLKL fibre og RIPK1/RIPK3 fibre er faktisk adskilte enheder.
Figur 1 . Undersøgelse af amyloid-lignende fibre under necroptosis. Hele cellelysater blev høstet fra celler gennemgår TNF-induceret necroptosis og udsat for SDD-alder. Western blotting blev udført for RIPK1, RIPK3 og MLKL. MLKL, der indeholder fibre udstillet en særskilt migration mønster fra RIPK1/RIPK3-holdige fibre. MLKL monomer er knap synlige under denne betingelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Forsøgsplan. (A) skematisk af to-dimensionelle semi-denaturering vaskemiddel Agarosen gelelektroforese (2D SDD-alder). Begynder ved at indlæse prøven i den rigtige de fleste lane, mærket med rødt. Efter afslutning af den første dimension run, rotere gel 90° mod uret. Køre den anden dimension elektroforese. Massiv pil angiver retningen af den første dimension køre, punkteret pil angiver retningen af den anden dimension køre. (B) skemaet for overførsel af kapillaritet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Mulige resultater. (A) den forventede migration mønster af amyloid eller amyloid-lignende fibre efter den første dimension af SDD-alder. Massiv pil angiver retningen af migration. (B) den forventede migration mønster af SDD-alder-stabil (ingen nedbrydning eller dissociation) amyloid eller amyloid-lignende fibre efter 2D SDD-alder. Massiv pil angiver retningen af den første dimension SDD-alder. Punkteret pil angiver retningen af den anden dimension SDD-alder. (C) den forventede migration mønster af ikke-SDD-alder-stabil amyloid eller amyloid-lignende fibre. Massiv pil angiver retningen af den første dimension SDD-alder. Punkteret pil angiver retningen af den anden dimension SDD-alder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Overførsel af MLKL-holdige fibre under 1D og 2D SDD-AGE. (A) hele cellelysater blev høstet fra celler stimuleret med TSZ til at gennemgå necroptosis. Lysates blev udsat for SDD-alder, og en vestlige skamplet blev udført for MLKL. En karakteristisk smøre blev observeret. (B) hele cellelysater blev høstet fra celler stimuleret med TSZ til at gennemgå necroptosis. Lysates blev udsat for 2D SDD-alder og en vestlige skamplet blev udført for MLKL. En skarp linje i en 45° vinkel blev observeret, der angiver, at fibrene ikke undergår dissociation under SDD-alder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske aspekt af de 2D SDD-alder er at de elektroforese betingelser er de samme for den første og anden dimension. Evnen til at opdage en skarp diagonal linje på 45° (der angiver, at ingen dissociation eller nedbrydning er opstået) afhænger af fibrene migrere Ansoegningsformularen under begge electrophoreses. Ved hjælp af forskellige betingelser, for eksempel ændre spændingen eller længden på kørselstidspunktet, vil skjule disse resultater. Også, som det er tilfældet for traditionelle 1D SDD-alder, kogende prøven bør undgås, da det vil forstyrre amyloid og amyloid-lignende fibre. Som det er tilfældet for alle overførsler, udvises forsigtighed bør undgå boblerne mellem lag filterpapir, membran og gel. Endelig under trinnet overførsel er det kritisk, at broen ikke hænge og direkte kontakt håndklæde papirstakken. En pålidelig måde at undgå dette er at bruge et lille stykke plastic wrap til at dække kanten af papirhåndklæder.
De kører betingelserne i protokol (60 V for 4 h) kan justeres. For eksempel, i denne protokol var agarosegel 14 cm x 15 cm. Hvis en mindre gel bruges, tilpasses spænding (4 V/cm gel længde) og operationstiden proportionalt. To prøver kan analyseres på én gang ved hjælp af to kamme, når du forbereder gel. Prøverne skal indlæses i rigtige mest godt for hver kam. I dette tilfælde bør operationstiden igen afkortes, således at den øverste prøve ikke kører i bunden halvdelen af gelen. Hvis tiden indstilles til den ene dimension af gel, er det afgørende, at anden dimensionen er justeret til at matche.
I modsætning til SDS-PAGE er 1 D og 2D SDD-alder semi-denaturering. Da fibrene forbliver intakt, kan nogle epitoper være utilgængelige. Dette kan begrænse påvisning af nogle antistoffer. 2D SDD-alder er begrænset i sin evne til at bestemme den nøjagtige størrelse af amyloid eller amyloid-lignende fibre. Dog kan en relativ størrelse sammenligning gøres.
Alle proteinkomplekser kan dissociation eller forringelse under SDD-alder, og så de kvalitative resultater kan være vanskelige at fortolke. Brugen af 2D SDD-alder tillader bekræftelse på, at størrelse heterogenitet set under SDD-alder ikke er på grund af SDS-afhængige dissociation under elektroforese. 2D SDD-alder er passende at bruge i enhver sammenhæng anvendes traditionelt 1 D SDD-alder. 2D SDD-alder er især nyttig, når størrelse heterogenitet er observeret i 1 D SDD-alder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af et stipendium for S.H.-A. fra NIH/NCATS (TL1TR001104), en Welch Foundation giver (I-1827) og et R01 tilskud fra NIGMS (RGM120502A) til Z.W. Z.W. er Virginia Murchison Linthicum Scholar i medicinalforskning og forebyggelse af kræft og Research Institute af Texas Scholar (R1222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
- Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
- Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Methods in Enzymology. 412, Academic Press. 33-48 (2006).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
