Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Twee methoden voor Decellularization van plantaardige weefsels voor Tissue Engineering toepassingen

Published: May 31, 2018 doi: 10.3791/57586
Automatic Translation
1, 2, 4, 4, 1, 2,3
1Department of Surgery, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin College of Engineering, 4Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Hier presenteren we en contrast twee protocollen gebruikt om te decellularize van plantaardige weefsels: een wasmiddel gebaseerde aanpak en een wasmiddel-vrije benadering. Beide methoden zijn achterlaten van de extracellulaire matrix van de weefsels van de plant gebruikt, die vervolgens kan worden gebruikt als steigers voor weefsel waterbouwkundige toepassingen.

Abstract

De transplantaties van het autologe, synthetische en dierlijke momenteel gebruikt als steigers voor weefsel vervanging hebben beperkingen als gevolg van lage beschikbaarheid, arme biocompatibiliteit en kosten. Plantaardige weefsels hebben gunstige kenmerken die ze uniek geschikt voor gebruik als steigers, zoals hoge oppervlakte, uitstekende water transport en retentie, onderling verbonden porositeit, vasculaire netwerken, en een breed scala van mechanische kader van onderzoekopleiding Eigenschappen. Twee succesvolle methoden van plant decellularization voor weefsel waterbouwkundige toepassingen worden hier beschreven. De eerste methode is gebaseerd op wasmiddel baden om cellulaire kwestie, die vergelijkbaar met de eerder vastgestelde methoden gebruikt is om duidelijk zoogdieren weefsels. De tweede is een wasmiddel-vrije methode aangepast van een protocol dat isoleert blad therapieën en impliceert het gebruik van een verwarmde bleekmiddel en zout bad om te wissen van de bladeren en stengels. Beide methoden leveren steigers met vergelijkbare mechanische eigenschappen en de lage cellulaire metabole effecten waardoor de gebruiker kan het protocol dat beter aansluit bij hun beoogde toepassing selecteren.

Introduction

Weefselengineering ontstaan in de jaren 1980 maken levend weefsel substituten, en potentieel adres belangrijke orgaan- en weefsel tekorten1. Een strategie hanteert steigers te stimuleren en begeleiden van het lichaam om te regenereren ontbrekende weefsels of organen. Hoewel geavanceerde productie benaderingen zoals 3D-printen steigers met unieke fysieke eigenschappen hebben geproduceerd, blijft de mogelijkheid voor de vervaardiging van steigers met een breed scala van haalbare fysische en biologische eigenschappen een uitdaging2 , 3. Bovendien, als gevolg van een gebrek aan een functionele vasculaire netwerk, deze technieken hebben beperkt gebleven in het regenereren van 3-dimensionale weefsels. Het gebruik van decellularized dierlijke en menselijke weefsels als steigers heeft geholpen in het omzeilen van dit probleem4,5,6,7. Echter hoge kosten-charges-variabiliteit en beperkte beschikbaarheid kunnen het beperken van wijdverbreide gebruik van decellularized dier steigers8. Er bestaat ook bezorgdheid over mogelijke overdracht van de ziekte aan patiënten en immunologische reactie op sommige decellularized zoogdieren weefsels9.

Cellulose, afgeleid van plant en bacteriële bronnen, is uitgebreid gebruikt voor het genereren van biomaterialen voor een brede waaier van toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Enkele voorbeelden zijn: bot, kraakbeen12,13,14 ,10,11en wond genezing van15. Steigers die bestaan van cellulose hebben een bijkomend voordeel dat ze zijn duurzaam en resistent tegen cellen van zoogdieren wordt uitgesplitst. Dit is vanwege het feit dat zoogdiercellen geen produceren de enzymen die nodig is voor het uitsplitsen van cellulose moleculen. Ter vergelijking, steigers geproduceerd met behulp van macromoleculen uit de extracellulaire matrix, zoals collageen, worden gemakkelijk afgebroken16 en mogelijk niet geschikt zijn voor langdurige toepassingen. Collageen steigers kunnen worden gestabiliseerd door chemische dwarsbinding. Er is echter een trade-off als gevolg van de inherente toxiciteit van de cross-linkers die invloed hebben op de biocompatibiliteit van de steigers17. Omgekeerd, cellulose heeft het potentieel om te blijven aanwezig op de plaats van implantatie voor langdurig van tijd, want het is ongevoelig voor enzymatische afbraak door zoogdiercellen18,19,20. Dit kan worden gewijzigd door het afstemmen van het tarief van aantasting door middel van hydrolyse voorbehandeling en co levering van de steigers met cellulases21. De biocompatibiliteit van decellularized plantgerelateerde cellulose steigers in vivo is ook aangetoond in een studie gedaan op muizen22.

Door honderden miljoenen jaren van evolutie, hebben planten hun structuur en samenstelling te verhogen van de efficiëntie van vloeibare vervoer en bewaring verfijnd. Plant vasculaire vaartuigen minimaliseren hydraulische weerstand door vertakking naar kleinere schepen, vergelijkbaar met de zoogdieren therapieën volgens Murray's wet23. Na decellularization, wordt van de plant complex netwerk van vaartuigen en onderling verbonden poriën onderhouden. Gezien het grote aantal verschillende plantensoorten beschikbaar hebben plantgerelateerde steigers het potentieel om te overwinnen ontwerpbeperkingen, beïnvloeden momenteel steigers in weefsel engineering24,25. Bijvoorbeeld, Modulevsky et al. aangetoond dat angiogenese en cel migratie gebeurde toen decellularized apple weefsel subcutaan werd ingeplant op de achterkant van een muis-22. Ook Gershlak et al. toonde aan dat endotheliale cellen kunnen volwassen binnen de therapieën van decellularized bladeren24. In een afzonderlijk experiment waren Gershlak et al. ook kunnen laten zien dat cardiomyocytes kon worden gekweekt op het oppervlak van bladeren en waren in staat om een contract van24.

Planten bevatten ook complexe organisatie van de cellulaire naar de macroscopische schaal, die moeilijk is te bereiken zelfs met de meest geavanceerde productie-technieken ontwikkeld tot nu toe. De complexe hiërarchische ontwerp van plantaardige weefsels maakt hen sterker is dan de som van hun kiezers26. Planten bezitten een overvloed aan verschillende mechanische eigenschappen, variërend van stijve en taai componenten zoals stengels, bladeren aan veel meer flexibel en plooibaar degenen zoals27. Bladeren variëren, afhankelijk van de soorten in termen van grootte, vorm, sterkte, de mate van vascularisatie, breken en kunnen verschillende graden van hydrophilicity. Over het geheel genomen, suggereren de eigenschappen van deze plant dat decellularized planten als unieke en zeer functionele medische hulpmiddelen dienen kunnen, met inbegrip van als weefsel engineering van steigers.

Dit protocol richt zich op twee methoden om te decellularize van plantaardige weefsels, zoals bladeren en stengels, voor gebruik als steigers in weefselengineering. De eerste methode is een wasmiddel gebaseerde techniek die maakt gebruik van een reeks van Baden om DNA en cellulaire kwestie, die werd aangepast van een veel gebruikte techniek om decellularize zoogdieren en plantaardige weefsels6,22,25 te verwijderen ,28,29,30. De tweede methode is wasmiddel-vrij en is aangepast van een protocol van de "skeletonization" gewoonlijk gebruikt voor het verwijderen van de zachte weefsels van bladeren31. Voorafgaande werk bleek dat scheiding van de therapieën van de omliggende weke delen31sudderen bladeren in een bleekmiddel, en natriumbicarbonaat oplossing vergemakkelijkt. Deze techniek kan worden aangehaald terug naar experimenten uitgevoerd in de 17th enth 18 eeuwen, zoals het werk van Albertus Seba32 en Edward Parrish33. Deze experimenten gecentreerd rond het verlaten van plantaardig materiaal, zoals bladeren en vruchten, ondergedompeld in water voor langere tijd (weken tot maanden) en waardoor de zachtere tissues aan verval weg natuurlijk. Hier is de "skeletonization"-benadering aangepast voor het gebruik van mildere omstandigheden, zoals langere incubatietijd tijden bij lagere temperaturen, cellulaire resten te verwijderen en om te voorkomen dat aanzienlijk verstoren de weke delen structuur. Voor de experimenten hierin gedetailleerd, drie installatie types werden gebruikt: Ficus hispida, Pachira aquatica en een soort Garcinia. Resultaten van DNA kwantificering, mechanische tests en impact op de cellulaire metabole activiteit van beide methoden worden beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. decellularization van weefsel van de Plant met behulp van het wasmiddel gebaseerde benadering

  1. Gebruik verse of bevroren F. hispida, blad monsters. Bevriezen van ongebruikte verse monsters in een vriezer van-20 ° C en een winkel voor toekomstig gebruik (tot een jaar).
    Opmerking: Gebruik stengel of blad weefsel van bijna alle gewenste planten. Uitgebreide opslag tijden kunnen leiden tot schade aan de weefsels.
    1. Bepalen van de grootte en vorm van de monsters worden verwerkt op basis van het gebruiksdoel van het monster (d.w.z. monsters in reepjes gesneden zijn goed geschikt voor mechanische testen toepassingen, ondertussen 8 mm schijf monsters zijn nuttig in multi goed kweken toepassingen ). Snijd het blad in 8 mm schijven met een scherpe, schone biopsy punch terwijl ondergedompeld onder kamertemperatuur (20-25 ° C) gedeïoniseerd H2O.
      Opmerking: Dit protocol kan worden gebruikt op hele bladeren en stengels. Kleinere monsters zal echter sneller decellularize.
    2. Incubeer de monsters gedurende 5-10 minuten op kamertemperatuur (20-25 ° C) gedeïoniseerd H2O in een shake plaat ingesteld op een lage snelheid-instelling om te wassen en/of ze ontdooien. Gebruik genoeg gedeïoniseerd H2O om ervoor te zorgen alle monsters grondig wordt bevochtigd.
  2. Bereiden van een oplossing van 10% (m/v) natrium dodecyl sulfaat (SDS) in gedeïoniseerd H2O. plaats de monsters in een geschikte container (een glas of kunststof schotel is ideaal) en het toevoegen van SDS oplossing voor het volledig bedekt de monsters. Incubeer monsters gedurende 5 dagen bij kamertemperatuur (20-25 ° C) op een shake plaat ingesteld op een lage snelheid ter voorkoming van schade aan de monsters.
    Opmerking: De container niet overcrowd als dit kan het proces van decellularization vertragen en tot ongelijke behandeling van de SDS leiden. Tijdens deze stap monsters moeten het verwerven van een bruine tint.
    1. Na 5 dagen, vervangen door de oplossing van de SDS gedeïoniseerd H2O. Incubate de monsters voor een extra 10-15 minuten op de plaat van de shake te grondig afspoelen elke resterende SDS-oplossing.
  3. Voorbereiden van een 1% (v/v) niet-ionogene oppervlakteactieve stof in 10% (v/v) bleekwater oplossing. Om een oplossing van 500 mL, Meng 5 mL van de niet-ionogene oppervlakteactieve stof met 50 mL bleekwater dan Voeg 445 mL gedeïoniseerd H2O. Submerge monsters in de vers bereide oplossing.
    Opmerking: De niet-ionogene oppervlakteactieve stof/bleekwater oplossing hoeft niet een lange houdbaarheid, dus, binnen de 48u van voorbereiding moet worden ingezet.
  4. Vervang de niet-ionogene oppervlakteactieve stof/bleekwater oplossing elke 24 h totdat de monsters worden volledig gewist (Zie figuur 1A voor visuele vergelijking). Vervolgens Incubeer het monster in gedeïoniseerd water op een plaat schud gedurende 2 minuten om te spoelen uit de overmaat niet-ionogene oppervlakteactieve stof/bleekwater oplossing. De shake plaat ingesteld op een lage instelling Voorkom beschadiging van de monsters.
    Opmerking: De tijd die nodig is om duidelijk de gebruikte monsters varieert, afhankelijk van het type en de soorten van de plant. De volledige verkleuring van de monsters is een indicatie van de volledige decellularization (uitvoeren DNA kwantificering zodat grondige clearing).
    1. Lyophilize van de monsters voor het opslaan van hen tot een jaar (flitser bevriezing met behulp van vloeibare stikstof is voorkeur, bevriezing van de monsters in-80 ° C is eveneens aanvaardbaar) en bewaar ze bij kamertemperatuur (20-25 ° C) in de lage luchtvochtigheid.
    2. Reconstrueren van monsters in Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) met genoeg om jas monsters. Spoel monsters 2 - 3 keer in serumvrij media voorzichtig met behulp van een micropipet vóór gebruik (dat wil zeggen gebruik 150-300 µL per spoelen, in een standaard 24 goed bord).
      Opmerking: Tris-HCl buffer en serumvrij media (dat wil zeggen DMEM, maar elke fundamentele celkweek media kan worden vervangen) zijn effectiever in het verminderen van de impact op de levensvatbaarheid van de cellen van SDS behandeld monsters dan die met gedeïoniseerd H2O alleen behandeld.

2. bereiding van de monsters met behulp van de aanpak van het wasmiddel-vrije Decellularization

Opmerking: De eerste stappen van deze procedure overeen met stap 1.1-1.1.2 (zie hierboven).

  1. Bereid een 5% (v/v) bleekmiddel (NaClO) en 3% (m/v) natriumbicarbonaat (NaHCO3) oplossing. Verwarm de oplossing in een zuurkast tot 60-70 ° C voor F. hispida blad monsters gesneden in 8 mm schijven al roerend op een hete plaat.
    Opmerking: De natriumbicarbonaat kan worden vervangen door natrium carbonaat (nb2CO3), of natriumhydroxide (NaOH). De gewenste temperatuur verschilt sterk (kamertemperatuur tot 90 ° C) en moet worden aangepast volgens de eigenschappen van de gebruikte monsters.
  2. Zodra de oplossing de gewenste temperatuurbereik bereikt, onderdompelen van de monsters en de opzwepende snelheid om te voorkomen beschadiging van hen te verminderen. Nadat de monsters zichtbaar zijn uitgeschakeld (Zie figuur 1B voor visuele vergelijking), zorgvuldig uit het bad te verwijderen. Incubeer monsters eenmaal in gedeïoniseerd H2O voor 1-2 min voor het verwijderen van overtollige bleekwater oplossing.
    Opmerking: De tijd die nodig is om duidelijk de monsters sterk kan verschillen. Gesneden peterselie kan bijvoorbeeld worden gewist in 10-15 min, terwijl dikkere en/of grotere monsters, zoals hele bladeren of stengels uren in hoge-temperatuur Baden duren kunnen om volledig duidelijk.
  3. Lyophilize van de monsters en bewaar ze bij kamertemperatuur (20-25 ° C) in de lage luchtvochtigheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Beide methoden leverde steigers die waren geschikt voor celkweek en weefsel technische toepassingen. Figuur 1 toont de algemene workflow voor het proces van de decellularization met behulp van een intact blad voor het wasmiddel gebaseerde methode en gesneden monsters (8 mm doorsnede) voor de wasmiddel-vrije methode. Succesvolle decellularization van Ficus hispida weefsels na beide methoden leverde duidelijke en intact monsters (figuur 1A en 1B). Was het mogelijk om het decellularize van de hele plant weefsels (figuur 1A); kleinere monsters bleek echter duidelijk sneller en effectiever. Een potentieel probleem waargenomen met de wasmiddel gebaseerde benadering betrokken heterogene decellularization als gevolg van vroegtijdige verwijdering van het niet-ionogene oppervlakteactieve stof bad (Figuur 1 c). Een nadeel van het wasmiddel-vrije methode is dat schade kan ontstaan als gevolg van langdurige incubatie in het verwarmde bad (Figuur 1 d).

De mechanische eigenschappen van decellularized steigers opgesteld op basis van beide methoden werden onderzocht met behulp van eenassige treksterkte testen zoals ook is gebeurd in andere studies24,34. Deze testen leverde de maximale tangent modulus (MTM) (figuur 2A), stam op falen (SAF) (figuur 2B), en uiteindelijke treksterkte (UTS) (figuur 2C) voor F. hispida en Pachira aquatica monsters. P. aquatica monsters bereid met behulp van beide protocollen decellularization weergegeven vergelijkbare mechanische eigenschappen in alle drie de gemeten parameters. De F. hispida monsters bleek een soortgelijke trend in alle gevallen behalve de UTS testen. In het bijzonder, had monsters die zijn opgesteld in overeenstemming met het protocol (SDS) wasmiddel gebaseerde hogere gemiddelde UTS resultaten dan die bereid zijn met de (bleekwater) wasmiddel-vrije benadering. Deze resultaten tonen aan dat monsters verzameld uit verschillende plantensoorten tot verschillende decellularized steiger eigenschappen leiden kunnen wanneer bereid via de twee decellularization-protocollen.

Voor het meten van DNA verwijdering, monsters zijn gewist met behulp van beide methoden en hun genomic DNA was geïsoleerd met behulp van een eerder gangbaar protocol35. Beide methoden van de decellularization (wasmiddel gebaseerde en wasmiddel-vrij) aanzienlijk daalde de genomic DNA-inhoud van de monsters naar 2,47 ng van DNA/mg (n = 3, s = 0.18) en 2.71 ng van DNA/mg van weefsel (n = 3, s = 1,60) respectievelijk (figuur 2D). Non-decellularized monsters had 104.67 ng van DNA/mg van weefsel (n = 3, s = 26.21) (figuur 2D). De aanzienlijke afname van de DNA-inhoud na decellularization een effectieve verwijdering van plantaardige cel aangegeven van belang.

De gevolgen voor de levensvatbaarheid van de cellen van de twee methoden van de decellularization werd beoordeeld door het meten van de metabole activiteit van menselijke dermale fibroblasten (hDF) gekweekte voor 2 dagen in het bijzijn van decellularized P. aquatica of Garcinia steigers. hDFs had hogere metabole activiteit wanneer gekweekt in aanwezigheid van de steigers van decellularized via de wasmiddel-vrije methode versus die bereid via de wasmiddel gebaseerde methode (figuur 3A). Om grondige verwijdering van de gebruikte tijdens de decellularization, een extra reeks experimenten reagentia werd uitgevoerd waarin de bereid steigers werden gewassen uitgebreid voorafgaand aan de cultuur van de cel. Twee aparte wassen methoden werden getest op monsters die zijn opgesteld in overeenstemming met de wasmiddel gebaseerde benadering: een wassen in Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8,5) gevolgd door een wassen in Serum mediagroep vs. 2 wasbeurten in gedeïoniseerd H2O. Beide benaderingen gebruikt definitieve wassen stappen met 1 x PBS. De impact op de zoogdiercellen vervolgens blootgesteld aan de steigers van decellularized plant werd gemeten met behulp van de dezelfde bepaling van de metabole activiteit zoals hierboven. Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8,5) gevolgd door Serum mediagroep geholpen om de impact op de cellulaire metabole activiteit in vergelijking met gedeïoniseerd H2O, degustaties neiging met het wasmiddel gebaseerde benadering vergelijkbaar met monsters van het wasmiddel-vrij maken methode (figuur 3B).

Eerder werd aangetoond dat zoogdiercellen kunnen groeien op steigers opgesteld op basis van het wasmiddel gebaseerde benadering25; Daarom was het noodzakelijk om aan te tonen dat op monsters die zijn bereid volgens de eerder geteste wasmiddel-vrije methode. Mesenchymale stamcellen (MSCs) werden zaadjes op decellularized F. hispida blad monsters (8 mm schijven) op 20.000 cellen per steiger en incubeer gedurende 24u kunnen. Deze steigers werden matiemaatschappij vóór invoering van de cel met een conjugaat RGD-Dopamine om vast te houden. Figuur 4 illustreert beelden verzameld van een typisch voorbeeld. Een heldere veld beeld werd verzameld om aan te tonen van de algehele structuur van een gedeelte van het monster gebruikt (figuur 4A). De MSCs werden gekleurd met behulp van calceïne en beeld met een fluorescentie Microscoop (figuur 4B). De beelden werden vervolgens (figuur 4C) als u wilt weergeven van de locatie van de groeiende cellen op het oppervlak van het blad bedekt.

Figure 1
Figuur 1 . De algemene workflow voor het decellularization van plantaardige weefsels. Doorsnee werkstroom voor het decellularization van plantaardige weefsels (wassen en voorbereidende stappen zijn universeel); (A) bovenste pad is voor de bodem wasmiddel gebaseerde methode (B) voor de wasmiddel-vrije methode. (C) een onvolledige/mislukte decellularization van een P. aquatica blad met de wasmiddel gebaseerde methode als gevolg van vroegtijdige verwijdering uit de niet-ionogene oppervlakteactieve stof/bleekmiddel bad (D) een beschadigd decellularization van een F. hispida blad Als gevolg van langdurige incubatie in de verwarmde bleekwater oplossing in het wasmiddel-vrije methode. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Vergelijking van de mechanische eigenschappen en de doeltreffendheid van decellularization tussen de methoden. Bedoel ± SD; statistische analyse werd gedaan met de twee-sample t-test p waarden en genoteerd waar statistisch significant (kleiner dan of gelijk aan 0,05). Vergelijking van mechanische testen resultaten tussen monsters van F. hispida en P. aquatica (blauwe staven gebruikt voor wasmiddel gebaseerde benadering, rood voor het wasmiddel-vrij en groen voor onbehandelde monsters) (F. hispida wasmiddel gebaseerde n = 4, wasmiddel-vrije n = 2; P. aquatica wasmiddel-base n = 3, wasmiddel-vrije n = 4) (A) maximale tangens Modulus (MTM) (B) stam op falen (SAF) (C) en Ultimate treksterkte (UTS). (D) een dsDNA kwantificering assay werd uitgevoerd in drievoud op drie monsters uit elke groep: onbehandeld (vers, n = 3), de wasmiddel-vrije methode (bleekmiddel, n = 3) en de wasmiddel gebaseerde methode (SDS, n = 3), p -waarden zijn voor de decellularization methode groep in vergelijking met onbehandelde steekproef groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Metabole activiteit assay resultaten vergelijken effect tussen de twee methoden voor decellularization. Bedoel ± SD; statistische analyse werd gedaan met behulp van de twee-sample t-test en p -waarden genoteerd waar statistisch significant (kleiner dan of gelijk aan 0,05). Cellulaire metabole activiteit werd gemeten in aanwezigheid van weefselmonsters van P. aquatica én een soort Garcinia (genormaliseerd naar controleputjes met geen enkel monster toegevoegd) weergegeven van een vergelijking (A) van de metabole effecten van de twee decellularization methoden (n = 3 voor elke groep) en (B) vergelijking van de impact op de metabole activiteit met behulp van twee methoden wassen in een wasmiddel-gebaseerd protocol: Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8,5) gecombineerd met Serum mediagroep (n = 4) vs. gedeïoniseerd H 2 O (n = 4). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . Mesenchymale stamcellen (MSCs) groeien op het oppervlak van decellularized Ficus hispida blad, met een conjugaat RGD-Dopamine matiemaatschappij. MSCs waren geworden op F. hispida bladeren, decellularized door de wasmiddel-vrije methode en matiemaatschappij met een conjugaat RGD-Dopamine (500 µm schaal balken werden toegevoegd voor verwijzing) (A) helder veld beeld van een deel van decellularized blad (B ) Fluorescentie afbeelding calceïne gekleurd MSCs groeien op blad oppervlakte (C) samengevoegde helder veld en fluorescentie beeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hierin worden twee methoden om te decellularize van plantaardige weefsels beschreven. De resultaten die hier gepresenteerd in combinatie met de resultaten van voorafgaande studies25, suggereren dat de protocollen uitwaardigen waarschijnlijk zijn die van toepassing zijn op een breed spectrum van plantensoorten en kunnen worden uitgevoerd op zowel de stengels en de bladeren. Deze procedures zijn eenvoudig en vereisen geen speciale apparatuur, zodat plant decellularization in de meeste laboratoria kan worden uitgevoerd. Het is opmerkelijk dat na de decellularization, de steigers moeten worden matiemaatschappij om zoogdieren cel adhesie. Verschillende functionalization technieken om zoogdieren cel adhesie en groei op plantaardige weefsels geweest die elders beschreven25 en zijn niet het onderwerp van het huidige manuscript.

De laatste stap in beide decellularization protocollen die hier gepresenteerd (Figuur 1) was cruciaal voor hun succes. Wanneer het uitvoeren van beide methoden doen niet overcrowd het bad als dit zal resulteren in een ongelijke clearing. Deze methoden kunnen worden toegepast op de hele bladeren en stengels; Dit zal echter de lengte van de tijd die nodig is om hen duidelijk verhogen. Zorg ervoor dat de monsters om te houden van de clearing consequent door het hele monster volledig worden ondergedompeld. Idealiter moet decellularization plantaardige weefsels van meest cellulaire zaak duidelijk terwijl het minimaliseren van schade aan de constructie. Het is waarschijnlijk dat het wasmiddel-vrije methode zoals nodig om te werken met de gewenste exemplaren kan worden gewijzigd. Hogere temperaturen van het bad kunnen leiden tot sneller clearing keer maar kunnen ook leiden tot meer schade aan de monsters als ze overdreven bebroede. Lagere temperaturen kunnen langere incubatietijd tijden verlangen en gepast zou zijn voor kwetsbaarder monsters. De concentratie van het bleekmiddel in de oplossing kan ook worden veranderd om te versnellen of vertragen het proces van decellularization. Wanneer testen nieuwe monsters voor gebruik met de methode wasmiddel-vrij, is het raadzaam om te beginnen met de temperatuur van een bad van 50-60 ° C met frequente controle op de voortgang van de decellularization (ideaal om 15-20 minuten) totdat ze adequaat worden gewist. Deze temperatuurbereik was goed verdragen door de meeste van de plantensoorten die werden getest tijdens de optimalisatie van de techniek. Na voltooiing, de monsters kunnen visueel worden geïnspecteerd en handmatig om ervoor te zorgen zij niet zijn overdreven geïncubeerd en onherstelbaar beschadigd als zou worden aangegeven door scheuren of desintegratie na verwijdering uit het bad. Monsters die zijn opgesteld in overeenstemming met deze benadering geven een verminderde gevolgen voor de celgroei (Zie figuur 3A) dan het wasmiddel-based benadering met alleen wassen in gedeïoniseerd H2O. Het is echter raadzaam te wassen bovendien met Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) en serum-vrije media, met name in de gevoelige toepassingen.

De (SDS) wasmiddel gebaseerde methode is waarschijnlijk die van toepassing zijn op de meeste plantensoorten en is vooral nuttig voor het ontruimen van hele blad en delicate monsters, omdat het vereist minimale fysieke agitatie. Zoals hierboven vermeld, is de laatste stap is essentieel voor de decellularization van de monsters. Monsters met verschillende fysische eigenschappen kunnen worden gewist door de incubatietijd in de niet-ionogene oppervlakteactieve stof baden aan te passen. Een belangrijk nadeel van dit proces is dat decellularized weefsels sporen van de detergentia gebruikt bevatten kunnen, die vervolgens invloed op de cellulaire metabole activiteit van zoogdiercellen uitoefenen kunnen. Grondig wassen stappen zijn daarom raadzaam vóór gebruik. Hier bleek dat monsters gewassen met Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8,5) gevolgd door serumvrij media had hogere levensvatbaarheid van de cellen dan die gewassen met gedeïoniseerd H2O vóór het gebruik ervan (figuur 3B).

Wanneer onbehandeld monsters voor toekomstig gebruik op te slaan in beide methoden, is het belangrijk om ze voor schade om ervoor te zorgen dat de daaruit voortvloeiende steigers niet zal worden beïnvloed te controleren. Schade kan worden weergegeven als de verkleuring van de plantaardige weefsels, alsmede barsten of buitensporige broosheid als afgehandeld. Het wordt aanbevolen om te controleren de monsters op een wekelijkse basis om hen te gebruiken voordat ze niet langer nuttig zijn en moet worden verwijderd. Het ontstaan van schade varieert tussen specimen types, met dikkere robuustere monsters langer.

In het algemeen houden planten veel belofte als een potentiële bron van biomaterialen. Dit wordt versterkt door hun natuurlijk ontwikkelde ingewikkelde structuren en kenmerken die hen helpen groeien in hun eigen omgeving. Succesvol gebruik van plantaardige weefsels als weefsel engineering steigers stelt een potentieel goedkoop alternatief voor dure en vaak moeilijk te ontwerpen, biomaterialen. Plant weefsel van oppervlakte topografie, die inherent van de ene soort naar de andere varieert, kan ook worden aangewend tot directe ruimtelijk georiënteerde cellulaire groei25. Bijvoorbeeld, heeft een eerdere studie aangetoond dat menselijke cellen op topografische signalen aanwezig op decellularized planten25, dus dat deze steigers kunnen worden gebruikt reageren om cellen in zeer georganiseerde patronen25cultuur. Een ander kenmerk dat is wenselijk in weefselengineering is DOVO perfusability. Plantaardige weefsels geëvolueerd zijn meer dan honderden miljoenen jaren zijn uiterst efficiënt bij vloeistof transport kunnen, en hun vasculaire netwerken efficiënt geperfundeerd24. Deze eigenschap kan mogelijk worden gebruikt om cellulaire migratie en angiogenese met het uiteindelijke doel van het creëren van vervanging weefsel voor klinische toepassingen te leiden. Dit wordt versterkt door de resultaten van eerdere studies die aangetoond dat biomaterialen met de hoge oppervlakte en onderling verbonden porositeit bevorderlijk aan de celproliferatie en wanneer geïmplanteerd in vivo, immigratie van het inschakelen van de cellen van de gastheer in de implantaat36,37,38,39. De hoge oppervlakte en de onderling verbonden porositeit zijn ook het waarmerk van plantaardige weefsels40,41,42, aldus plantgerelateerde steigers hebben het potentieel om te integreren met de omringende weefsels in vivo. Recente studies vond bovendien dat decellularized bladeren met succes kunnen worden geperfundeerd met cellen24 en dat wanneer menselijke cellen werden zaadjes op decellularized plantaardige weefsels, gelijkvormig ze tot hun topografische signalen25. Wanneer genomen allemaal samen, plantgerelateerde steigers beschikken over de noodzakelijke eigenschappen met succes worden toegepast naar weefsel technische toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We zouden graag bedanken John Wirth van de tuinen van Olbrich voor genadig leveren de specimens die in dit project worden gebruikt. Dit werk is deels gesteund door de National Heart, Lung en bloed Instituut (R01HL115282 naar G.R.G.) National Science Foundation (DGE1144804 J.R.G en G.R.G.), en de Universiteit van Wisconsin afdeling chirurgie en Alumni Fonds (H.D.L.). Dit werk was ook gedeeltelijk ondersteund door de Environmental Protection Agency (STAR grant nr. 83573701), de National Institutes of Health (R01HL093282-01A1 en UH3TR000506) en de National Science Foundation (IGERT DGE1144804).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium dodecyl sulfate Sigma Life Science 75746-1KG
Triton X-100 MP Biomedicals, LLC 807426 Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) Clorox Item #: 31009 Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate Acros Organics 217120010 Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch HealthLink 15111-80 Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table Stovall Life Sciences BDRAA115S Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate Fisher Scientific Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker Any Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
DMEM Corning MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay Life Technologies P11496 Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vacanti, J. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art. Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).
  2. Kim, S., et al. Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels. Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).
  3. Park, A., Wu, B., Griffith, L. Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion. Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).
  4. Steinhoff, G., et al. Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue. Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).
  5. Stock, U., et al. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).
  6. Ott, H., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
  7. Guyette, J., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
  8. Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy. JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).
  9. Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B. Tissue-engineered skin substitutes: an overview. Journal of Artificial Organs. 16 (4), 397-403 (2013).
  10. Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds. Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).
  11. Wan, Y., et al. Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications. Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).
  12. Vinatier, C., et al. An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects. Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).
  13. Vinatier, C., et al. A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes. Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).
  14. Vinatier, C., et al. Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).
  15. Helenius, G., Bäckdahl, H., Bodin, A., Nannmark, U., Gatenholm, P., Risberg, B. In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 76 (2), 431-438 (2006).
  16. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).
  17. Thomas, D., et al. A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells. Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).
  18. Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).
  19. Märtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).
  20. Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).
  21. Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding. Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).
  22. Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
  23. McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. Water transport in plants obeys Murray's law. Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).
  24. Gershlak, J., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  25. Fontana, G., et al. Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).
  26. Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R. Bioinspired structural materials. Nature Materials. 14 (1), 23-36 (2015).
  27. Gibson, L. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  28. Hoshiba, T., et al. Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2016, (2016).
  29. Guyette, J., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
  30. Modulevsky, D. J., et al. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS ONE. 9 (5), e97835 (2014).
  31. Blonder, B. How to make leaf skeletons. , Available from: http://benjaminblonder.org/The_secrets_of_leaves/Making_skeletons.html (2017).
  32. Seba, A., Sloane, H. The Anatomical Preparation of Vegetables, by Albertus Seba, F. R. S. Communicated to the Royal Society by Sir Hans Sloane, Bart. Pr. R. S. and Col. Med. Lond. Translated from the German, by Mr. Zolman, F. R. S. Philosophical Transactions. 36 (407), 441-444 (1775).
  33. Parrish, E. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. , (1865).
  34. Coffin, S., Gaudette, G. Aprotinin extends mechanical integrity time of cell-seeded fibrin sutures. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (9), 2271-2279 (2016).
  35. Zangala, T. Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e246 (2007).
  36. Borselli, C., Cezar, C., Shvartsman, D., Vandenburgh, H., Mooney, D. The role of multifunctional delivery scaffold in the ability of cultured myoblasts to promote muscle regeneration. Biomaterials. 32 (34), 8905-8914 (2011).
  37. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Designing Scaffolds to Enhance Transplanted Myoblast Survival and Migration. Tissue Engineering. 12 (5), 1295-1304 (2006).
  38. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (8), 2494-2499 (2006).
  39. Ma, J., Holden, K., Zhu, J., Pan, H., Li, Y. The Application of Three-Dimensional Collagen-Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-9 (2011).
  40. Tyree, M. Plant hydraulics: the ascent of water. Nature. 424 (6943), 923 (2003).
  41. Raven, P., Evert, R., Eichhorn, S. Biology of Plants. , 7th edition, (2005).
  42. Turrell, F. The area of the internal exposed surface of dicotyledon leaves. American Journal of Botany. 23 (4), 255-264 (1936).

Tags

Bioengineering kwestie 135 Decellularized steigers plantaardige weefsels bladeren stengels perfusable steigers decellularization
Twee methoden voor Decellularization van plantaardige weefsels voor Tissue Engineering toepassingen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak,… More

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak, J. R., Gaudette, G. R., Le, H. D., Murphy, W. L. Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (135), e57586, doi:10.3791/57586 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter