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Articolo metodologico

Analisi quantitativa di Micro-CT di Aortopathy in un modello murino di indotta da β-aminopropionitrile aneurisma e dissezione

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DOI:

10.3791/57589

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16 luglio 2018

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1Center for Vascular and Inflammatory Diseases, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Diagnostic Radiology and Nuclear Medicine, University of Maryland School of Medicine, 3Division of Vascular Surgery, University of Maryland School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive una metodologia dettagliata dell'utilizzo di una gomma di silicone radiopaco base di piombo per irrorare il vasculature murino per la quantificazione di diametro aortico in un modello murino di aneurisma e dissezione.

Abstract

Dissezione e aneurisma aortico è associate a significativa morbidità e mortalità nella popolazione e può essere altamente letale. Mentre esistono modelli animali di malattia aortica, in vivo imaging del sistema vascolare è stato limitato. Negli ultimi anni, micro-automatizzato la tomografia (micro-CT) è emerso come una modalità preferita per l'imaging di piccoli e grandi vasi sia in vivo ed ex vivo. In concomitanza con un metodo di fusione vascolare, abbiamo con successo usato micro-CT per caratterizzare la frequenza e la distribuzione di patologia aortica in topi C57/Bl6 β-aminopropionitrile-trattati. Limiti tecnici di questo metodo includono variazioni nella qualità della perfusione introdotta dalla scarsa preparazione degli animali, l'applicazione di metodologie adeguate per la quantificazione di dimensione del vaso e la non-sopravvivenza di questa procedura. Questo articolo descrive in dettaglio una metodologia per la perfusione intravascolare di una gomma di silicone radiopaco a base di piombo per la caratterizzazione quantitativa del aortopathy in un modello murino di aneurisma e dissezione. Oltre alla visualizzazione di patologia aortica, questo metodo può essere utilizzato per l'esame di altri letti vascolari in vivo o letti vascolari rimossi post mortem.

Introduzione

L'incidenza della dissezione aortica è di 3 casi per 100.000 all'anno1. Dissezione aortica e malattie aneurismatiche rappresentano oltre 10.000 morti negli Stati Uniti ogni anno, pari a 1-2% di tutte le morti in paesi occidentali2. Dissezione aortica viene avviata da una lacrima nello strato intimal della nave con la propagazione del sangue attraverso gli strati della parete aortica sotto pressioni fisiologiche. Pressioni elevate paziente polso sono associate con un'incidenza aumentata della dissezione e complicazioni. Sollecitazione di taglio della parete aumentato è associato con l'espansione di parete aortica che conduce ad un aneurisma formazione3,4. Conseguenze della dissezione aortica includono l'occlusione del flusso di sangue agli organi distanti, compreso il cervello, reni, intestino e membra, la formazione di aneurismi cronici, rottura o morte5,6,7.

Allo stato attuale, i processi biochimici e cellulari coinvolti nell'iniziazione e progressione dei aneurysms aortici e dissezioni sono ancora poco conosciuti. Modelli animali riproducibile di aneurisma e dissezione sono chiave per comprendere la loro patofisiologia. Β-aminopropionitrile (BAPN) è un inibitore della lisil ossidasi, che impedisce la reticolazione di collagene ed elastina ed è stato indicato per alterare significativamente la struttura della tabella extracellulare della parete di vaso e l' integrità biomeccanica6, 8. Roditori trattati con BAPN sono stati utilizzati come un comune modello animale di aneurisma e dissezione9,10.

Modalità di imaging vascolare sono strumentali nell'identificare la patologia vascolare, confermando la pervietà del vaso e perfusione d'organo di valutazione. Recentemente, micro-tomografia (micro-CT) è stata utilizzata per studiare il sistema vascolare dei topi e, allo stesso modo, animali di taglia. A differenza dell'osso, la formazione immagine assiale dei vasi sanguigni tramite tomografia computata è limitata, come sangue intraluminal è intrinsecamente relativamente radiotrasparente. Quando combinato con agenti di contrasto intravascolare, micro-CT consente tuttavia dettagliate ricostruzioni tridimensionali di animali vasculatures per lo studio della patologia vascolare macro-anatomica11.

L'agente di contrasto selezionato (vedere la Tabella materiali) è una gomma di silicone radiopaco che contiene solfato di piombo e di cromato di piombo. Al momento di aspersione in presenza di un catalizzatore, indurisce rapidamente per formare un cast del vasculature con minime modifiche nell'architettura macro-anatomiche dei vasi, rendendo il sistema vascolare altamente radiopaco in contrasto con i tessuti di fondo quando esame radiografico. Questo agente di contrasto è vantaggioso perché è facile da maneggiare ed evita la degradazione del tessuto e perdita del vaso a causa di rottura spesso associato alla corrosione cast vascolare. Come cura con minima contrazione12, vasi deselezionate di sangue rimangono brevetti e consentono una valutazione accurata del vasculature macro degli animali in esperimenti non-sopravvivenza. Lavoro precedente è utilizzato con successo in silicone radiopaco gomma-contrasto in una varietà di studi sugli animali. In particolare, è stato dimostrato applicabilità nel visualizzare le coronarie, glomerulare, placentare e cerebrale circolazioni11,12,13,14,15 . In questa carta, abbiamo dettaglio la metodologia della puntura ventricolare sinistra aperta per perfusione intravascolare della gomma di silicone radiopaco a base di piombo per caratterizzare quantitativamente patologia aortica BAPN-indotta in un modello murino di micro-CT.

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Protocollo

I protocolli per la gestione degli animali erano approvati dal comitato di uso dell'Università del Maryland, Baltimora (numero di protocollo animale 0116024) e istituzionali Animal Care e condotto secondo gli standard internazionali di AAALAC.

1. preparazione dei reagenti

  1. Eparina
    1. Diluire 250 µ l di 1000 U/mL eparina solfato in 50 mL di fosfato tampone salino per rendere una concentrazione finale di 5 U/mL.
    2. Caldo al eparinizzata (5 U/mL) tampone fosfato salino, che sostituirà il sangue nel sistema vascolare in un bagnetto ad acqua settato a 37 ° C.
    3. Preparare la pompa di pressione controllata collegando i tubi necessari e 2 vuoti siringhe da 10 mL, 1 per il buffer di salina eparinizzata e 1 per l'agente di contrasto.
    4. Riempire il tubo con la soluzione salina tamponata al fosfato eparinizzata caldo e rimuovere le bolle d'aria dal tubo della pompa pressione.
  2. Agente di contrasto
    Nota: Consultare la Tabella dei materiali per i componenti di kit agente di contrasto.
    1. Mescolare un composto pigmentato con un diluente per ottenere una tintura 1:6 al rapporto di diluente.
    2. Immediatamente prima dell'uso (passo 2.3.12), aggiungere 200 µ l di un agente indurente ad ogni aliquota di 5 mL del composto pigmentato diluito e mescolare bene (4% in volume).
      Nota: Il produttore segnalato che l'orario di lavoro è di 40 min. Come l'agente di contrasto di gomma di silicone inizia a polimerizzare 20 min dopo l'aggiunta dell'agente indurente, è importante preparare la soluzione immediatamente prima della sua infusione.
  3. Acqua potabile BAPN
    1. Sciogliere β-aminopropionitrile (BAPN) in acqua potabile per creare una concentrazione finale di 3 g/L (adattato da protocolli precedentemente descritti nella letteratura)9,16,17.
    2. Amministrare l'acqua potabile contenenti BAPN ad un gruppo di topi, una volta che sono 4 settimane di età fino al momento di aspersione per micro-CT.

2. intervento chirurgico

  1. Preparazione degli animali
    1. Svezzare i topi a 3 settimane dell'età, mantenerli in un ciclo di 12 h luce/12 h scuro e dar loro da mangiare cibo del roditore standard. Per il gruppo trattato con BAPN, amministrare l'acqua potabile BAPN preparata per 16-26 settimane ad libitum. Fornire che agli animali di controllo con standard bere acqua ad libitum.
  2. Tecnica anestetica
    Nota: 24 h prima dell'analisi di CT, la procedura riportata di seguito viene eseguita. Le procedure chirurgiche sono emanate per preparare il campione per una post mortem perfusione intracardiaca.
    1. Indurre un'anestesia tramite un serbatoio di induzione con 100% O2 e 3% isoflurane consegnato tramite un vaporizzatore di precisione. Dopo l'induzione di anestesia, interrompere l'isoflurano e lavare la camera con O2. Mantenere l'anestesia con 2-2.5% isoflurane e 1 L/min di O2 tramite un cono di naso.
    2. Fissare la camera di induzione e la maschera facciale per spazzino del carbone di legna per adsorbimento di gas di scarico per proteggere il personale. Garantire un adeguato piano anestetico dimostrando che non c'è nessuna risposta agli stimoli nocivi (pizzico di punta).
    3. Preparare un campo operatorio composto da un vassoio chirurgico e degli strumenti chirurgici necessari.
    4. Trasferire l'animale nel campo chirurgico e la posizione in decubito dorsale.
  3. Tecnica attiva
    1. Utilizzando le forbici, fare un'incisione del midline attraverso la pelle e dei tessuti molli da midway tra la sinfisi pubica fino alla tacca sternal, che si estende attraverso la pelle e i tessuti molli sovrastanti lo sterno.
    2. Utilizzando le forbici, creare un buco nel diaframma al processo xifoideo di entrare nella cavità toracica.
    3. Usare le forbici per sezionare il diaframma della parete ventrale toracica, bilateralmente.
    4. Tagliare le cartilagini costiere per separare le costole dallo sterno al bordo di destra dello sterno.
    5. Applicare una pinza emostatica bene fino alla punta dello sterno (vicino il processo xifoideo) e spostare la pinza emostatica cranialmente in modo che è posizionato sopra la testa del mouse. Questo si ritrae il timo e sterno dal cuore, esponendo il cuore e dei vasi grandi per ulteriori manipolazioni.
    6. Acutamente sezionare gli eventuali allegati tra il cuore e la parete toracica.
    7. Connettere l'ago catetere di calibro 27 IV una siringa pre-caricata con 10 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato eparinizzata (5 U/mL) e riempire tutte le tubazioni con il buffer per rimuovere le bolle d'aria dai tubi della pompa pressione.
    8. Prestare attenzione durante la preparazione del fluido come bolle nella linea fluida può ostacolare il riempimento dei vasi più piccoli. Limitare il numero di navi che sono stati danneggiati durante la preparazione degli animali, come questo farà sì che l'agente di contrasto a fuoriuscire i vasi mozzati, cambiando il volume richiesto per un riempimento e introdurre artefatti per l'imaging finale.
    9. Il ventricolo sinistro la puntura con un ago calibro 27 che è stabilizzato con un morsetto ad angolo retto. Immediatamente incise il ventricolo destro o la vena cava inferiore per drenare la soluzione di eparina e sangue.
      Nota: L'eparina è usata come anticoagulante per impedire che il sangue coaguli nei vasi dopo la morte dell'animale.
    10. Irrorare l'animale ad un tasso costante di 2 mL/minuto utilizzando una pompa a siringa singola. Si noti l'imbiancamento visibile degli organi. Continuare la perfusione finché il perfusato drenante dalla circolazione venosa è libero di sangue (circa 5-6 mL). Fermare la pompa.
    11. Scollegare il tubo del catetere IV dalla siringa 10 mL, facendo attenzione a non per disturbare la posizione dell'ago nel ventricolo sinistro.
    12. Immediatamente dopo il completo dissanguamento, separare la soluzione di agente di contrasto in aliquote di 5 mL e aggiungere l'agente indurente in questo momento (Vedi punto 1.2). Mescolare bene. Aspirare 5 mL del mix di agente di contrasto in una siringa da 10 mL e irrorare l'animale con esso.
    13. Per un riempimento dei vasi (arterie e vene), continuare l'infusione oltre il punto quando si vede uscire la soluzione venosa. Cercare segni di un'aspersione di successo tra cui la visualizzazione di un agente di casting nelle arterie coronarie, arterie polmonari, intestino e sistema vascolare del fegato.
    14. L'agente di contrasto curerà dopo circa 20 min a temperatura ambiente. Al momento di polimerizzazione, raccogliere i singoli organi, secondo le necessità e correggerli in formalina neutra tamponata 10%. Difficoltà carcasse intere se i campioni non sono utilizzati per il giorno seguente l'esame di micro-CT. Se le carcasse saranno utilizzate il giorno successivo, posizionarli su un vassoio di metallo e metterli in frigorifero a 4 ° C per curare tutta la notte.

3. esame di micro-CT e parametri

Nota: I parametri di acquisizione immagine specifica dipenderà la macchina in uso.

  1. Acquisire immagini di tomografia computata raggi x di ogni mouse il giorno successivo la perfusione utilizzando un micro-CT scanner utilizzando una tensione di tubo di raggi x del kVp 55, una corrente di 150 μA, un fattore di ingrandimento di sistema di 2.19 e un fattore di binning pixel fotocamera CCD di 2. Questo produce una dimensione di pixel effettivi di 29 µm.
    1. Gettare la carcassa del mouse supina sul tavolo di micro-CT scanner e ottenere uno scout esplorazione dei raggi x.
    2. Concentrare il rilevatore di campo di 57,4 mm (assiale) x 37,1 mm (transaxial) sul torso all'immagine l'intera lunghezza dell'aorta.
    3. Acquisire 180 proiezioni di immagine con un incremento della rotazione di 2 gradi e un tempo per proiezione di 2800 ms.
  2. Ricostruire le immagini utilizzando un algoritmo Feldkamp modificato; la dimensione del voxel ricostruito è 29 x 29 x 29 µm3 (spessore della fetta = 29 µm) utilizzando la visualizzazione 3D multimodali plug-in per il software utilizzato qui.

4. post-elaborazione e il Rendering

  1. Convertire i dati di CT in un formato DICOM utilizzando il software appropriato.
  2. Analizzare le immagini per identificare se un aneurisma era presente. Misurare il diametro dell'asse minore nel punto più largo dell'arco aortico, aorta toracica, discendente e dell'aorta addominale come precedentemente descritto18 (Figura 1).
    Nota: Nel nostro studio, le immagini sono state analizzate da due osservatori indipendenti (uno cieco) che utilizza un visualizzatore DICOM per identificare se un aneurisma era presente. Il diametro dell'asse minore è stato misurato nel punto più largo dell'arco aortico, discendente dell'aorta toracica e aorta addominale come descritto in precedenza19 (Figura 1). Significa non-aneurismatica segmenti arteriosi dei topi non trattati BAPN stabilito diametri normale del vaso che serve come i valori di controllo di pari età.
  3. I aneurysms sono definiti come una dilatazione localizzata o diffusa dei segmenti aortici per diametri superiori al 50% del diametro del riferimento. Individuare questi sulla base delle misurazioni di cui sopra.

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Risultati

Al fine di valutare questo protocollo, 20 topo maschio adulto, del fondo misto come descritto in precedenza19 e del 20-30 settimane di età, con o senza trattamento BAPN, sono stati irrorati con una gomma di silicone radiopaco a base di piombo (Vedi il tabella materiali ) utilizzando il protocollo di cui sopraelencato. Hanno subito l'esame di micro-CT il giorno seguente (Figura 1 e

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Discussione

Micro-CT imaging consente di fornire ricostruzioni altamente dettagliate e tridimensionale di patologia vascolare in modelli animali. Attraverso l'uso di media di contrapporre-aumentata intravascolare, tessuti molli, non potenziate, come il lume di un vaso sanguigno, possono essere differenziati da quelli che intende potenziare. Mentre laser Doppler, microangiography, angiografia a risonanza magnetica, l'istologia con microscopia confocale, o due-fotone può essere utilizzato per valutare letti vascolari, essi in genere c...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Mark Smith per la sua assistenza con formazione immagine radiografica. Questo lavoro è sostenuto dalla sovvenzione di T32 NIH per la ricerca interdisciplinare nella malattia cardiovascolare (BOA), l'associazione americana di cuore (SMC) e il NIH R35 Grant (DKS).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MicrofilFlow Tech, IncMV-122Usiamo il giallo, un colore diverso può essere ordinato a piacere. Il kit include il composto MV, il diluente MV e l'agente indurente MV.
Eparina (1000 U/mL)Sagent Pharmaceuticals25021-400-10
Soluzione salina tamponata con fosfatoCorning21-031-CV
IsofluraneVet One, MWI502017
3-Aminopropionitrile fumarato saleSigma-AldrichA3134
Pompa a siringa singolaFisher Scientific14-831-200
calibro 27 ago per vene del cuoio capelluto ExelInt2670927G x 3/4", tubo da 12"
Inveon Scanner Micro-CTSiemens Medical Solutions
Osirix MDPimxmeo SARLVersione 8.0.2
Inveon Research WorkplaceSiemens Medical SolutionsVersione 4.2
Roditore ChowHarlan Teklad2018sx

Riferimenti

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